Isolierung und funktionale Analyse von Mitochondrien aus kultivierten Zellen und Maus-Gewebe

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, atmende Mitochondrien aus kultivierten Zellen oder Mausgewebe zu isolieren und dann die Stärke ihres Membranpotenzials als Maß für den Zellstatus zu beurteilen. Bei kultivierten Zellen wird dies erreicht, indem die Zellen zuerst plattiert und dann behandelt werden. Als nächstes werden die Zellen homogenisiert und das Homogenat durch eine Nadel geführt, um Mitochondrien weiter aus den Zellen zu lösen.

Für Mausgewebe wird die Leber aus der Maus herausgeschnitten und dann auf Eis mit beiden Arten von Ausgangsmaterial homogenisiert. Die differentielle Zentrifugation wird dann verwendet, um die Mitochondrien vom restlichen Zellinhalt zu isolieren. Nachdem die Mitochondrien einer Verarbeitung unterzogen wurden, einschließlich der Zugabe des Membranpotential-empfindlichen Fluoreszenzfarbstoffs, werden TMRE-Fluoreszenzmessungen durchgeführt, um die Stärke des Membranpotentials zu berechnen.

Letztendlich können die mitochondriale Funktion und Störungen des mitochondrialen Membranpotentials unter Verwendung eines Membranpotential-empfindlichen Fluoreszenzfarbstoffs in Verbindung mit einem Fluoreszenzplatten-Reader beurteilt werden. Bei der Behandlung mit gängigen mitochondrialen On-Kopplern und Inhibitoren kann diese Methode zwar einen Einblick in die Zytokin-induzierte Apoptose und die Mitochondrien-Dysfunktion in einem LS.It auch auf jedes andere System angewendet werden, bei dem der Vergleich zwischen zwei oder mehr verschiedenen Proben gesucht wird, wie z. B. Gesund gegen Krankheit oder zwei verschiedene Tierarten mit unterschiedlichen Stoffwechselraten. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung. Da die Isolationsschritte der Mitochondrien schwer zu erlernen sind.

Dies liegt daran, dass es bei der Ausführung der Technik viele Nuancen gibt, die in traditionellen Methodenabschnitten übersehen werden können. Beginnen Sie dieses Verfahren mit der Züchtung von humanen embryonalen Nierenzellen, wie im Textprotokoll beschrieben, 48 Stunden vor der Zytokinbehandlungsplatte, 160.000 Zellen in einen T 1 75-Kolben, um zum Zeitpunkt der Behandlung eine Dichte von etwa 70 % zu erzielen. Dann lassen Sie die Zellen 24 Stunden später mit Serum aushungern, indem Sie das Medium aspirieren und durch das gleiche Volumen an serumfreien Medien ersetzen.

Behandeln Sie schließlich die serumarmen Zellen durch Zugabe von löslichen Zytokinen direkt auf die Zellkulturmedien, um die Isolierung der Mitochondrien durchzuführen. Zuerst wird das Medium aspiriert und die Adhärenzzellen zweimal mit 15 Millilitern einer x phosphatgepufferten Kochsalzlösung oder PBS gewaschen. Jedes Mal nach dem Waschen den Puffer absaugen und den Kolben abkratzen, um die anhaftenden Zellen vom Boden zu entfernen.

Dann 15 Milliliter eines XPBS in jeden Kolben geben, schwenken und in einzelne 15 Milliliter konische Röhrchen auf Eis umfüllen. Sobald das Schaben abgeschlossen ist, zentrifugieren Sie die Röhrchen fünf Minuten lang bei 700 mal G vier Grad Celsius, wobei Sie nach dem Zentrifugieren eine Tischzentrifuge mit einem schwingenden Schaufelrotor verwenden, Überstände absaugen und wiederbeleben. Suspendieren Sie jedes Pellet in einem Milliliter mitochondrialem Isolationspuffer

Kombinieren Sie dann beide Suspensionen und geben Sie sie in ein kleines Glasgefäß zur Homogenisierung an den Mitochondrien resuspendiert und der mitochondriale Isolationspuffer in das Glasgefäß, bis die Lösung die erste Linie erreicht. Wenn der Stößel an einem Bohrer befestigt ist, fahren Sie fort, die Zellen auf Eis bei mittlerer Geschwindigkeit für drei Durchgänge zu homogenisieren. Es sollte darauf geachtet werden, dass beim Einsetzen des Stößels in die Lösung Luftblasen entfernt werden, dass der Stößel nicht über der Flüssigkeit entfernt wird und dass eine gleichmäßige Geschwindigkeit mit kontinuierlichen Durchgängen verwendet wird. Übertragen Sie die homogenisierte Lösung in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen.

Ziehen Sie dann die Lösung mit einer 18-Gauge-Nadel in eine Drei-Milliliter-Spritze und stoßen Sie sie mit einer 27-Gauge-Nadel zurück in das konische Röhrchen auf Eis. Achten Sie darauf, die Lösung gegen die Innenwand des Röhrchens auszustoßen, um diese Kraft für den Aufschluss der Zellmembran zu nutzen. Wiederholen Sie die Spritzenschritte insgesamt fünfmal, geben Sie dann die Lösung in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen und zentrifugieren Sie sie fünf Minuten lang bei 600 mal G vier Grad Celsius in einer Tischzentrifuge mit einem schwingenden Schaufelrotor.

Mitochondrien befinden sich nach diesem ersten Spin mit niedriger Geschwindigkeit im Überstand, während einige Membranen und ungebrochene Zellen pelletiert werden, entfernen Sie vorsichtig den Überstand und verteilen Sie ihn auf drei 1,5-Milliliter-Röhrchen. Dann zentrifugieren Sie die drei Röhrchen in einem Festwinkelrotor bei 10.000 mal G vier Grad Celsius für fünf Minuten. Mitochondrien aus kultivierten Zellen erscheinen weißlich.

Entfernen Sie die Leber von jedem Tier und legen Sie eine eiskalte Mahlzeit, eine XPBS ohne Kalzium oder Magnesium, um jegliches Blut wegzuspülen. Das Lebergewebe in eine Schüssel auf Eis geben und mit einer frischen Rasierklinge eine Minute lang in feine Stücke schneiden. Geben Sie anschließend Gewebe und den entsprechenden Puffer in das Gefäß, bis der Puffer die erste Linie erreicht.

Fahren Sie fort, das Gewebe auf Eis mit dem Stößel von Hand fünf Durchgänge lang zu homogenisieren. Es sollte darauf geachtet werden, dass beim Einsetzen des Stößels in die Lösung Luftblasen entfernt werden, dass der Stößel nicht über der Flüssigkeit entfernt wird und dass eine gleichmäßige Geschwindigkeit mit kontinuierlichen Durchgängen verwendet wird. Fahren Sie mit der Zentrifugation und Homogenisierung der Proben fort, wie im Textprotokoll beschrieben.

Nachdem die neuen Überstände mit dem ersten Überstand aus jeder Probe kombiniert wurden, zentrifugieren Sie die Röhrchen in einem Festwinkelrotor bei 10.000 mal G vier Grad Celsius für fünf Minuten. Saugen Sie die oberste weiße, flauschige Schicht vorsichtig mit einer Pipettenspitze ab und/oder schieben Sie sie an die Seiten des Röhrchens. Gießen Sie dann vorsichtig den Rest des Überstands und die Wiederbelebung ab.

Suspendieren Sie die Leber-Mitochondrien-Pellets in 500 Mikrolitern mitochondrialer Isolierung. Die Puffermitochondrien aus der Leber sind braun. Legen Sie die Proben unmittelbar vor dem Vorbereiten der Reaktionen schnell auf Eis.

Verdünnen Sie die Mitochondrien auf 0,5 Milligramm pro Milliliter. Arbeitskonzentration mit experimentellem Puffer. Fügen Sie geeignete Behandlungen hinzu, wie im Textprotokoll aufgeführt, um die Röhrchen bei einem Zehntel, dem Gesamtvolumen der verdünnten Mitochondrien, zu trennen.

Legen Sie anschließend die verdünnten Mitochondrien in jedes Reaktionsröhrchen und rühren Sie jedes Röhrchen vorsichtig um, um eine ordnungsgemäße Durchmischung zu gewährleisten. Inkubieren Sie die Reaktionen sieben Minuten lang auf dem Labortisch. Fügen Sie dann dem mitochondrialen Reaktionsvolumen ein gleiches Volumen von zwei mikromolaren Tetraethyl-, Rod Domine-, Ethylester-, abgekürzt TMRE hinzu.

Rühren Sie erneut jedes Röhrchen vorsichtig um, um eine ordnungsgemäße Mischung zu gewährleisten. Nachdem Sie die Reaktionen weitere sieben Minuten lang auf dem Labortisch inkubiert haben, pelletieren Sie die Mitochondrien durch Zentrifugation in einem Festwinkelrotor bei 10.000 mal G vier Grad Celsius für fünf Minuten. Dann wird die Hälfte des Überstandsvolumens jeder Probe auf ein 3 84 geladen.

Die Well-Platte, fährt mit dem Lesen der Fluoreszenz der Proben fort und berechnet dann die Faltdifferenz in der Fluoreszenz zwischen der Kontrolle und jeder Behandlung, wie im Textprotokoll beschrieben, die Behandlung von HEK 2 93 T-Zellen mit TNF, alpha, IL, einem beta und IFN gamma für 24 bis 48 Stunden führt zu einem fortschreitenden Zelltod. Die Zellviabilität wurde mit MTT-Assays bewertet, die konsistent zeigen, dass die Zellviabilität bei einer 24-Stunden-Behandlung um etwa 10 % und bei einer Abnahme um etwa 20 % abnimmt. Bei einer 48-Stunden-Behandlung führen Zellen, die mit ähnlichen Konzentrationen behandelt wurden, nach 48 Stunden zu ähnlichen Zelltodergebnissen.

Und die Behandlung mit einzelnen Zytokinen zeigt, dass die Abnahme der Lebensfähigkeit auf kombinatorische Effekte zurückzuführen ist. Die Viabilitätsdaten stellen die mittlere Standardabweichung von drei separaten Experimenten dar. Jeder Lauf in dreifacher Ausführung und die Dichtheit der Fehlerbalken zeigen die Reproduzierbarkeit der Daten.

Die prozentuale Abnahme des Membranpotenzials in Mitochondrien, die aus mit Zytokinen behandelten Zellen isoliert wurden, deutet darauf hin, dass die Gesundheit der Mitochondrien durch die Zytokinbehandlungen beeinträchtigt wurde, was die Viabilitätsdaten nach diesem Verfahren bestätigt. Andere Methoden, wie die Bewertung einer TP-Erzeugung, einer Gesamt-TP oder des Sauerstoffverbrauchs, können gebildet werden, um zusätzliche Fragen zu bewerten, wie z.B. welche Energie- und Atmungsunterschiede zwischen den verschiedenen Proben bestehen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man intakte funktionelle Mitochondrien isoliert und die Stärke ihres Membranpotenzials als Spiegelbild des zellulären Status beurteilt.