Isolation and Functional Analysis of Mitochondria from Cultured Cells and Mouse Tissue

Thomas Lampl; Jo A. Crum; Taylor A. Davis; Carol Milligan; Victoria Del Gaizo Moore

doi:10.3791/52076

Isolierung und funktionale Analyse von Mitochondrien aus kultivierten Zellen und Maus-Gewebe

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Biology

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Isolation and Functional Analysis of Mitochondria from Cultured Cells and Mouse Tissue

Isolierung und funktionale Analyse von Mitochondrien aus kultivierten Zellen und Maus-Gewebe

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09:27 min

March 23, 2015

DOI: 10.3791/52076-v

Thomas Lampl¹, Jo A. Crum¹, Taylor A. Davis¹, Carol Milligan^2,3,4, Victoria Del Gaizo Moore¹

¹Chemistry Department,Elon University, ²Department of Neurobiology and Anatomy,Wake Forest School of Medicine, ³Neuroscience Graduate Program,Wake Forest School of Medicine, ⁴ALS Center Translational Science Unit,Wake Forest School of Medicine

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Der Vergleich des mitochondrialen Membranpotentials zwischen Proben liefert wertvolle Informationen über den zellulären Status. Detaillierte Schritte zur Isolierung von Mitochondrien und zur Beurteilung des Ansprechens auf Inhibitoren und Entkoppler mittels Fluoreszenz werden beschrieben. Die Methode und der Nutzen dieses Protokolls werden anhand eines Zellkultur- und Tiermodells für zellulären Stress veranschaulicht.

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, atmende Mitochondrien aus kultivierten Zellen oder Mausgewebe zu isolieren und dann die Stärke ihres Membranpotenzials als Maß für den Zellstatus zu beurteilen. Bei kultivierten Zellen wird dies erreicht, indem die Zellen zuerst plattiert und dann behandelt werden. Als nächstes werden die Zellen homogenisiert und das Homogenat durch eine Nadel geführt, um Mitochondrien weiter aus den Zellen zu lösen.

Für Mausgewebe wird die Leber aus der Maus herausgeschnitten und dann auf Eis mit beiden Arten von Ausgangsmaterial homogenisiert. Die differentielle Zentrifugation wird dann verwendet, um die Mitochondrien vom restlichen Zellinhalt zu isolieren. Nachdem die Mitochondrien einer Verarbeitung unterzogen wurden, einschließlich der Zugabe des Membranpotential-empfindlichen Fluoreszenzfarbstoffs, werden TMRE-Fluoreszenzmessungen durchgeführt, um die Stärke des Membranpotentials zu berechnen.

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