Überwachung Cleaved Caspase-3 Aktivität und Apoptose von Immortalized Oligodendrozyten mit Live-cell Imaging und Cleaveable Fluorogenic-Farbstoff-Substrate Nach Kalium-induzierten Membrandepolarisation

Dieses Verfahren ermöglicht es, den Zelltod von Oligo-DDR-Gliazellen in Echtzeit zu überwachen. Dazu werden die Zellen zunächst kultiviert, dann werden die Zellen für die Bildgebung lebender Zellen vorbereitet. Der nächste Schritt besteht darin, die Zellen zu behandeln und die Auswirkungen mit Hilfe der Fluoreszenzmikroskopie zu überwachen.

Der letzte Schritt ist die Durchführung der Datenanalyse. Letztendlich zeigen die Ergebnisse die Raten des Zelltods in einer Zellpopulation nach einer Behandlung oder einem Stimulus durch Überwachung der Kernfluoreszenz durch einen Caspase-aktivierten Flurofarbstoff. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der Immunfärbung ist die Möglichkeit, mehrere Zeitpunkte gleichzeitig zu erfassen.

Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen in der Zellbiologie zu beantworten, wie z. B. Reaktionen auf pharmakologische, Reagenzien und verschiedene Behandlungen. Nun kann diese Methode Aufschluss über den Tod in Zellkulturen geben. Es kann auch auf andere Systeme wie ex vivo, organotypische Gewebe, einschließlich Hirnschnitte, angewendet werden.

Im Allgemeinen werden Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten haben, sich an die Arbeit mit lebendem Gewebe anstelle von fixiertem Gewebe zu gewöhnen. Die visuelle Demonstration dieser Technik ist wichtig, da es im Vergleich zu fixiertem Gewebe viele Schritte zur Vorbereitung von lebenden Zellproben gibt. Tauen Sie zunächst eingefrorene, immortalisierte N19-Oligo-Gliazellen in einem 37 Grad Celsius warmen Wasserbad auf, während die Zellen auftauen.

Geben Sie sieben Milliliter DMEM mit hohem Glukosegehalt, ergänzt mit 10 % FBS und 1 % Penicillin-Streptomycin, in eine 10 Zentimeter große Kulturschale. Geben Sie dann die Zellsuspension tropfenweise auf die Platte und rühren Sie die Petrischale vorsichtig um, um die Zellen gleichmäßig zu verteilen. Kultivieren Sie die Zellen bei 34 Grad Celsius in einem 5-Cent-Kohlendioxid-Inkubator für vier Stunden für vier Stunden.

Saugen Sie das Medium aus den Platten an, um das verbleibende DMSO zu entfernen. Kryoprotektivum. Nach vier bis sieben Tagen Wachstum durch sieben Milliliter Frischmedium ersetzen. Wenn die Zellen 70 bis 80 % Confluence erreicht haben, aspirieren Sie das Medium und pipettieren Sie einen Milliliter Tropfen auf das Zellblatt, das fünf Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert wird.

Ernten Sie dann den nächsten Samen, eine 10 Zentimeter große Gewebekulturschale mit den geernteten Zellen in einer Dichte von 0,1 mal 10 zu den sechs Zellen pro Milliliter, und stellen Sie diese Schale in den Gewebekultur-Inkubator. Nach einer weiteren Massage können die Zellen für Live-Cell-Imaging-Experimente plattiert werden. Ernten Sie dazu die Zellen wie bisher, entnehmen Sie dann 30 Mikroliter der Zellsuspension und zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer.

Verwenden Sie anschließend eine sterile Pinzette, um unbeschichtete Glasabdeckfolien zu platzieren. In den Vertiefungen einer Sechs-Well-Platte geben Sie Zellen mit einer Dichte von 0,1 mal 10 zu den sechs Zellen pro Milliliter in die Vertiefung. In zwei Millilitern phenolfreiem DMEM-Medium mit hohem Glukosegehalt, ergänzt mit 10 % FBS und 1 % Penicillin, ermöglicht Streptomycin den Zellen, über Nacht bei 34 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid zu wachsen, bevor sie transfektioniert werden.

Kombinieren Sie am nächsten Tag 100 Mikroliter serumfreies Medium, 0,5 bis vier Mikrogramm gereinigtes Plasmid, DNA und vier Mikroliter FU-Gen HD. Wirbeln Sie die Mischung zweimal vorsichtig und lassen Sie die DNA dann fünf Minuten lang bei Raumtemperatur komplexieren. Nach Ablauf der Inkubationszeit geben Sie das FU-Gen-HD-DNA-Gemisch direkt zu den kultivierten Zellen.

Kippen Sie die Platte zum Mischen vorsichtig. Kultivieren Sie die Zellen dann weitere 48 Stunden lang bei 34 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid, bevor Sie sie behandeln oder experimentieren. Schalten Sie zuerst die Steuerbox des LCI Cham Light Live-Cell-Instruments ein.

Dies sollte drei Stunden vor Beginn des Versuchs erfolgen, um eine gründliche Erwärmung des Tisches zu gewährleisten. Das Steuergerät sollte mindestens eine Stunde vor Beginn des Experiments eingeschaltet werden. Besprühen Sie anschließend in einer Strömungshaube die LCI Cham Light Magnetkulturkammer und die Pinzette mit 70 % Ethanol und lassen Sie sie fünf Minuten lang trocknen.

Nehmen Sie die Zellen aus dem Inkubator und untersuchen Sie sie unter dem Mikroskop, um zu bestätigen, dass sie gesund sind. Die Zellen sollten mit zahlreichen Membranprozessen durant und gut verteilt auf dem Glasdeckglas erscheinen. Zellen mit einer reduzierten Anzahl von Prozessverlängerungen oder einem unregelmäßig geformten Zellkern sind wahrscheinlich durch die Transfektion gestresst und für weitere Experimente in der Strömungshaube ungeeignet.

Kippen Sie die Sechs-Well-Platte und entfernen Sie den Deckglas mit einer Pinzette. Setzen Sie die Abdeckung mit der Zellenseite nach oben schnell in die Bodenplatte der Kammer ein. Lassen Sie den Deckglas nicht trocknen.

Befestigen Sie als Nächstes den magnetischen Hauptkörper der Kulturkammer und geben Sie 500 Mikroliter Medium aus der ursprünglichen Sechs-Well-Platte auf die Oberseite des Deckglases. Die Wiederverwendung des Mediums verringert die Belastung der Zellen durch Umweltveränderungen und kann auch für die Beurteilung extrazellulärer sezernierter Faktoren nützlich sein. Nachdem das Medium hinzugefügt wurde, setzen Sie die Glasabdeckung auf die Kulturkammer und verwenden Sie ein Kim-Tuchgeflecht mit 70 %, um jegliches Restmaterial, das die Mikroskopie beeinträchtigen könnte, von der Unterseite des Deckglases zu entfernen.

Stellen Sie die Kulturkammer für 30 Minuten in den 34 Grad Celsius heißen Inkubator mit 5 % Kohlendioxid. Dieser Schritt stellt sicher, dass die Kammer selbst die 34 Grad erwärmt, um ein Verrutschen des Deckglases zu reduzieren. Wenn sich das Metall erwärmt, ist es notwendig, in den folgenden Schritten mit einer möglichst niedrigen Raumbeleuchtung zu arbeiten.

Zuerst bereitete Dóra zuvor die Elequa der Atombombe bei Raumtemperatur vor. Nehmen Sie dann die Kulturkammer aus dem Inkubator und platzieren Sie sie schnell in der Klimakammer des Mikroskops. Schalten Sie den 5%igen vorgemischten Kohlendioxidtank mit Doppelregler ein.

Als nächstes verwenden Sie das 10-fach-Objektiv mit einer Mikroskoplampe, die auf etwa 2,5 Volt und eine Belichtungszeit von 240 Millisekunden eingestellt ist. Fokussieren Sie mit der Hellfeldmikroskopie, um die Zellen auf dem Computermonitor sichtbar zu machen. Geben Sie dann eine 80 Millimolare Konzentration an Kaliumionen oder einem anderen Apoptose-Induktor zu den Zellen durch Medienaustausch mit langsamer und lokaler Perfusion unter Verwendung einer Peristaltikpumpe.

Das Substrat Nuke View 4 88 ist in Zellkultur stabil für Experimente, die bis zu 36 Stunden dauern. Daher ist es möglich, Experimente über diesen Zeitraum durchzuführen. Zuerst richtete ich das Mikroskop so ein, dass es die Fluoreszenz von rot und grün fluoreszierenden Proteinen sichtbar machte.

Klicken Sie dann auf den roten Kanal, um die transfizierten Zellen anzuzeigen. Wählen Sie ca. 12 Frames aus, in denen mehrere transfizierte Zellen vorhanden sind, und speichern Sie sie, und speichern Sie diese XY-Tischpunkte. Lassen Sie das Mikroskop alle sechs Minuten Bilder im Hellfeld-Rot- und Grünkanal an diesen gespeicherten Tischpunkten aufnehmen.

Nachdem Sie mehrere XY-Punkte aus doppelten oder dreifachen Experimenten gesammelt haben, stellen Sie die Daten aus separaten Experimenten zusammen, die an verschiedenen Tagen durchgeführt wurden, und führen Sie Datenanalysen und statistische Tests durch, wie im schriftlichen Protokoll beschrieben, um das Verhältnis der negativen Zellen der CASP-Bucht zu den positiven Zellen der CASP-Bucht zu vergleichen. Nuke view 4 88 Substrat kann auf eine erhöhte Apoptoserate von N 19 Oligo DDR Gliazellkulturen hinweisen. Nach einer Behandlung mit einer hohen extrazellulären Kaliumkonzentration wurden diese Ausgangsbilder mit einem 10-fachen Objektiv aufgenommen.

Die N19-Zellen wurden mit RFP transfiziert und entweder mit drei Mikrolitern Nuke View, 4 88 Substrat für Kontrollzellen oder drei Mikrolitern Nuke View, 4 88 Substrat und 80 Millimolar Kalium behandelt. Diese Bilder zeigen, dass die Anzahl der apoptotischen Zellen im Laufe der Zeit zunimmt, drei, sechs und neun Stunden nach der Behandlung mit 80 Millimolar Kalium wurden unter Kontrollbedingungen keine signifikanten Mengen an Apoptose im Vergleich zu den mit 80 Millimolar Kalium behandelten Kulturen beobachtet. Das unter den Kontrollbedingungen beobachtete grüne Hintergrundsignal zeigt die Zellen an, die eine Apoptose ohne Zugabe von extrazellulärem Kalium durchlaufen.

Ein 12-stündiger Zeitkurs ist ausreichend für Studien mit neurologischen Insulten. Nach 12 Stunden zeigten mit Kalium behandelte Kulturen einen Zelltod von etwa 45 %. Praktisch keine der Zellen im Kontrollexperiment zeigte Apoptose zum 12-Stunden-Zeitpunkt. In anderen Situationen kann es jedoch erforderlich sein, dass die Experimente länger laufen.

Dieses Diagramm zeigt die Zunahme der Caspase von drei positiven Zellen im Verlauf des 12-stündigen Experiments. Einmal belästigt, kann diese Technik in einer Stunde durchgeführt werden, und Daten können über Nacht gesammelt werden, wenn sie richtig durchgeführt werden. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, zwischen den Behandlungen nach diesem Verfahren konsistent zu sein.

Andere Methoden, wie z. B. die Immunfärbung, können verwendet werden, um andere nachgeschaltete Proteine zu untersuchen, die an den untersuchten Signalwegen beteiligt sind. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie Proben für die Bildgebung vorbereiten. Erfassen Sie einen Datensatz und analysieren Sie Ihre Daten.