Name: Überwachung Cleaved Caspase-3 Aktivität und Apoptose von Immortalized Oligodendrozyten mit Live-cell Imaging und Cleaveable Fluorogenic-Farbstoff-Substrate Nach Kalium-induzierten Membrandepolarisation (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 45 s
Description: Erfahren Sie die Live-Cell-Imaging-Methode zur Echtzeitüberwachung von Caspase-3-vermitteltem Apoptose in N19-Oligodendrozyten mit NucView 488. Diese Technik ermöglicht dynamische Analysen von Zelltodmechanismen.

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Dieses Labor wurde von der kanadischen Institutes of Health Research, dem Natural Sciences and Engineering Research Council in Kanada, und die Multiple Sclerosis Society of Kanada (MSSC) unterstützt. GSTS war der Empfänger einer Doctoral Studentship aus dem MSSC. Wir danken Dr. Joan Boggs (Hospital for Sick Children, Toronto) für viele hilfreiche Diskussionen und Kommentare zu diesem Manuskript. Wir sind dankbar, dass Biotium für ihre großzügige Geschenk von zusätzlichen NucView 488 Caspase-3.

1. Auftauen und Kultivieren von Zellen <ol><li> Erhalten Lager von gefrorenem verewigt N19-Oligodendrozyten aus langfristigen flüssigem Stickstoff speichert. </li><li> Tauchen Fläschchen mit Zellen bei 37 ° C Wasserbad, bis die Zellsuspension vollständig aufgetaut. </li><li> 7 ml DMEM (Dulbecco modifiziertes Eagle-Medium) mit High-Glucose mit 10% FBS (Fetal Bovine Serum) und 1% Penicillin / Streptomycin zu einer 10 cm Kulturschale ergänzt. </li><li> Fügen Sie die Zell-Suspension auf die Platte tropfenweise, und vorsichtig geschwenkt und Rock der Petrischale, um die Zellen gleichmäßig zu verteilen. </li><li> Kultur-Zellen bei 34 ° C / 5% CO 2-Inkubator. </li><li> Nach 4 Stunden absaugen Medien aus Platten, um alle verbleibenden DMSO (Dimethylsulfoxid), das als Frostschutzmittel verwendet worden zu entfernen, und ersetzen Sie sie durch frische Medien (7 ml DMEM High-glucose Medien ergänzt mit 10% FBS und 1% Penicillin / Streptomycin) . </li></ol> 2. Die Passage Cells <ol><li> Bei 70-80%Zusammenfluss (4-7 Tage Wachstum), absaugen Medien von Zellen. </li><li> 1 ml 0,25% Trypsin-to-Plate. Pipette Trypsin zu lösen Zellen (ca. 5 Minuten). </li><li> Nehmen Sie die entsprechenden Verdünnungen für experimentellen Bedingungen und Passage eine zusätzliche 10 cm Teller für zukünftige Experimente mit einer Zelldichte nicht weniger als 0,1 x 10 6 Zellen / ml. </li></ol> Hinweis: Sie sollten Durchgang Ihre Zellen mindestens zweimal nach dem Auftauen, bevor Sie sie für Experimente. 3. Zählen und Plating Cells <ol><li> Um Platte Zellen für live-cell imaging, trypsinize wie zuvor beschrieben. </li><li> Entfernen Sie ca. 30 ul der Zellen und zählen mit einem Hämocytometer. </li><li> Legen Sie eine unbeschichtete Deckglas in einer 6-Well-Platte. Hinzufügen von Zellen, die auch bei einer Dichte von 0,1 x 10 6 Zellen / ml in 2 ml Phenol-freiem DMEM High-glucose Medien, mit 10% FBS und 1% Penicillin / Streptomycin bei 34 ° C / 5% CO 2 ergänzt. </li><li> ErlaubenZellen wachsen über Nacht (16-20 h) bei 34 ° C / 5% CO 2 vor der Transfektion. </li></ol> 4. Transfektion <ol><li> Kombinieren Sie 100 ul Serum-freien Medien, 0,5-4 pg gereinigte Plasmid-DNA, und 4 ul FuGENE HD (Roche). Vortex vorsichtig mischen. </li><li> Vortex noch einmal kurz und lassen Sie die DNA zu komplex für 5 min bei Raumtemperatur, und fügen Sie dann FuGENE HD DNA-Gemisch direkt in den kultivierten Zellen. Kippen Sie die Platte vorsichtig mischen. </li><li> Kultur der Zellen für weitere 48 h bei 34 ° C / 5% CO 2 vor der Behandlung oder Experimentieren. </li></ol> 5. Vorbereitung Cells für Live-Cell Imaging (LCI) <ol><li> Schalten Sie die LCI Chamlide Live-cell Instrument Schaltkasten mindestens 1 h, bevor Sie zu Ihrem Experiment starten wollen. Der Schaltkasten regelt auch die Temperatur und Luftfeuchtigkeit innerhalb des LCI Chamlide und reguliert den Fluss des vorgemischten 5% CO 2. </li></ol> Hinweis: Es ist ratsam,Schalten Sie das Kontrollkästchen bis zu 3 h vor Beginn der Experimente, um sicherzustellen, dass die gesamte Stufe 34 ° C erreicht Dieser Schritt reduziert Schwerpunkt Drift, die durch fluxulation und die thermische Ausdehnung des Metalls der Bühne verursacht wird, wie es wärmt, während der Bildgebung. <ol start="2"><li> Die Arbeit in einem Flow-Haube, sprühen Chamlide magnetisch-Type Culture Kammer und Pinzette, mit 70% Ethanol und ihnen erlauben, für 5 Minuten trocknen lassen. </li><li> Entfernen Zellen aus Inkubator und bestätigen, dass sie gesund sind. Sie sollten erscheinen Anhänger und auf dem Deckglas mit zahlreichen Membranverfahren gut verteilt. Zellen, die aus der Transfektion betont werden, sind nicht geeignet für Experimente und eine reduzierte Anzahl von Prozess-Erweiterungen haben, und haben oft eine unregelmäßig geformte Kern. </li><li> Neigen Sie den 6-Well-Platte und entfernen Sie das Deckglas mit einer Pinzette. Raschen Platzierung der Deckglas-Zelle nach oben in die Bodenplatte der Kultur Kammer. Nicht in das Deckglas, um zu trocknen. </li><li> Befestigen Sie den Magnetstreifen wichtigstenKörper der Kultur Kammer und fügen 500 ul der Medien von der ursprünglichen 6-Well-Platte auf der Oberseite des Deckglases. Re-using dieses Medium verringert die Menge der Stress auf die Zellen, die durch Veränderungen der Umwelt verursacht gelegt, und kann auch nützlich sein für die Beurteilung der extrazellulären sekretierten Faktoren. </li><li> Setzen Sie die Glasabdeckung auf die Kultur Kammer. </li><li> Verwenden Sie ein Kimwipe mit 70% Ethanol besprüht, um restliche Material von der Unterseite des Deckglases zu entfernen, die sich mit Mikroskopie stören würde. </li><li> Legen Sie die Kultur Kammer in der 34 ° C / 5% CO 2-Inkubator für 30 min. Dieser Schritt stellt sicher, dass die Kammer selbst zu 34 ° C erwärmt zu reduzieren Verschiebung des Deckglases als das Metall erwärmt. </li></ol> 6. Mikroskop-Einstellungen Die Bilder wurden hier mit einem Leica DMIRE2 inversen Mikroskop mit einer benutzerdefinierten Relais-Linse und Emission Filterrad Gehäuse für Kartusche Laden von mehreren Rädern (Quorum Technologies Inc., G erworbenuelph, ON). <ol><li> Hellfeld - Lampe bis 2,5 V und Belichtungszeit auf 240 ms eingestellt. </li><li> Red Fluorescent Protein (RFP) - Verstärkung bei 140 für 200 ms eingestellt. </li><li> Green Fluorescent Protein (GFP) - Verstärkung bei 140 für 500 ms eingestellt. </li><li> Unser Mikroskop hat eine dimmbare Lampe anstatt einer rotierenden Scheibe, um die Menge an Licht zur Verfügung, um Zellen zu steuern. Wir führen unsere Experimente mit dem Licht bei 90% der maximalen Intensität Lampe. </li></ol> 7. Behandlung der Zellen mit Apoptose-Induktoren und NucView 488 Caspase-3 Substrat <ol><li> Es ist wichtig, um große Bestände von Apoptose induzieren im Voraus vorbereiten und einfrieren in Portionen, so dass die Konzentrationen werden sich im Einklang zwischen den Experimenten. </li><li> Die NucView 488 Substrat ist lichtempfindlich. Bereiten Aliquots von 15 ul auf Einfrieren / Auftauen, und speichern Röhrchen bei -20 ° C in Aluminiumfolie abgedeckt reduzieren. Die Arbeit mit der Umgebungsluft Raumbeleuchtung so gering wie möglich, um die Exposition der NucV reduziereniew 488 Substrat, Licht, vor dessen Verwendung. </li><li> Rufen Sie die Kultur Kammer schnell aus dem Inkubator, so dass die Zellen nicht zu einer Verringerung der Temperatur ausgesetzt sind. Legen Sie die Kultur Kammer auf die Klimakammer des Mikroskops, und verwenden Sie Klammern, um die Kultur Kammer nicht bewegen kann. An dieser Stelle sollten Sie auch dim die Raumbeleuchtung. </li><li> Schalten Sie die 5% vorgemischte CO 2-Tank mit zwei Regler. </li><li> Mit dem 10fach Objektiv, Fokus auf Zellen, die auf dem Computer-Monitor mit Hellfeld-Mikroskopie finden. Hinweis: Sie möchten, um die größte numerische Apertur des Objektivs mit der gewünschten Vergrößerung zu verwenden, um die Belichtungszeit zu reduzieren. </li><li> Deliver Induktoren der Apoptose der Zellen (in unserem Fall 80 mM Kalium oder 100 mM Glutamat), kann eine der folgenden Methoden verwendet werden. Wir werden Anlieferung von 80 mM Kalium als Beispiel nehmen, mit KCl als 10x-Konzentrat in unserem typischen Kulturmedien aufgelöst. <ol><li> Medien Austausch by langsam und lokale Perfusion: - Verwenden Sie eine Schlauchpumpe zum Austausch von Medien in der Kultur Kammer mit den neuen Medien mit 80 mM Kalium. - Ein Ende des Schlauches liefert 10 mL eines Bestandes von 80 mM Kalium in Phenol-freiem DMEM gelöst, und das andere Ende des Schlauchs wird Medien aus der Kammer entfernen. - Sie wollen mindestens einen 10-fach Austausch von Medien, um sicherzustellen, dass die Medien in die Kammer verließ die richtige Konzentration von Kalium hat. - Nach Medien ausgetauscht wird, fügen Sie 3 ul der NucView 488 Substrat für die Medien in der Kammer. Pipette zu mischen. </li><li> Direkte Zugabe von 80 mM K + und NucView 488 Substrat zu Medien in der Kultur Kammer: - Bereiten Sie eine 10x Stammlösung von 80 mM Kalium in Phenol-freiem DMEM aufgelöst. - Add 3 ul der NucView 488 Substrat 50 uL 10x 80 mM Kalium. Pipette zu mischen. In den 500 ul Phenol-freiem DMEM in Kultur Kammer. Hinweis: Diese Methode istbevorzugt, wenn Sie Interesse an der Aufrechterhaltung oder der Beurteilung Wachstum oder andere Faktoren, die abgesondert werden in der Original-Datenträger können, sind. Wir haben festgestellt, dass die NucView 488 Substrat stabil ist in der Zellkultur für Experimente dauerhaft bis zu 36 h. </li></ol></li></ol> 8. Live-Cell Imaging <ol><li> Klicken Sie auf den roten Kanal zu transfizierten Zellen anzuzeigen. </li><li> Wählen und speichern Sie etwa ein Dutzend Bilder, wo gibt es mehrere transfizierten Zellen, und speichern Sie diese "XY-Punkte". Je nach der Menge des Arbeitsspeichers, können Sie die Anzahl der Bühne Punkte, die Sie in der Lage sein zu erwerben ist begrenzt. </li><li> Haben die Lupe nehmen Bilder (in Hellfeld-, Rot-Kanal und grünen Kanal) auf diese gespeicherten Etappe Punkte alle 6 Minuten. </li><li> Jede grüne Färbung, die sichtbar ist während der frühen Stadien der Experimente zeigt wahrscheinlich Zellen, die bereits Gegenstand Apoptose aufgrund der Regel der Transfektion und / oder Umweltbelastungen. Apoptosis aufgrund der experimentellen Behandlungen werden zu einem späteren Zeitpunkt in das Experiment nachgewiesen werden. </li></ol> 9. Statistische Analyse <ol><li> Für jedes Experiment, programmieren wir das Mikroskop, um mehrere XY-Punkte zu erwerben, um eine große Datenmenge effizient zu sammeln. Jedes Experiment ist in doppelter oder dreifacher Ausführung durchgeführt und die Daten werden aus verschiedenen Experimenten an verschiedenen Tagen durchgeführt zusammengestellt. Aus jedem Datensatz, analysieren wir bis zu 15 Felder anzeigen und vergleichen das Verhältnis von Caspase-negative Zellen Caspase-positive Zellen (Gesamtzahl der Zellen im Sichtfeld / Gesamtzahl der Caspase-positive Zellen). </li><li> Die aufgezeichneten Messwerte von jedem Datensatz werden in einem größeren Sample-Set zusammengefasst und sind dann miteinander über eine ANOVA-Tabelle (p = 0,05). Wir zeigen die Standardfehler des Mittelwerts (SEM) von jedem Versuch, und vergleichen Sie die Differenz der Mittelwerte durch Ausführen eines Tukey bedeutet Vergleichstest (p = 0,05), um festzustellen, which Behandlungen unterscheiden sich deutlich voneinander. </li></ol> 10. Repräsentative Ergebnisse Wir haben ein Experiment zu zeigen, wie die NucView 488 Substrat kann eine erhöhte Rate von Apoptose von N19-OLG-Zellkulturen nach einer Behandlung mit einer hohen extrazellulären Kaliumkonzentration zeigen beschrieben. Die N19-Zellen wurden mit RFP transfiziert und wurden entweder mit 3 ul NucView 488 Substrat (Kontrolle) oder 3 ul NucView 488 Substrat und 80 mM behandelt [K +] (Behandlung). Die Zellen wurden überwacht und die Bilder wurden über einen 12-Stunden-Kurs, der ausreichend für Studien mit neurologischen Beleidigungen (Abbildung 1A) erworben wird. In Kontrollbedingungen, haben wir nicht beobachten, erhebliche Mengen von Apoptose im Vergleich zu den 80 mM [K +] behandelten Kulturen (Hash-Kasten), die ca. 45% Zelltod nach 12 h (Abbildung 1B) zeigte. Der Hintergrund grünes Signal zu beobachtend in der Kontrollgruppe Bedingungen zeigt die Zellen, die Apoptose sind ohne die Zugabe von extrazellulärem Kalium. Praktisch keine der Zellen in der Kontrollgruppe Experiment weisen Apoptose durch den 12 h Zeitpunkt, obwohl in anderen Situationen die Experimente erforderlich sein, um mehr ausgeführt werden. Die Bilder wurden mit einem 10x-Objektiv. Bar = 100 um. <img alt="Abbildung 1a" src="/files/ftp_upload/3422/3422fig1.jpg"> <img alt="Abbildung 1b" src="/files/ftp_upload/3422/3422fig1b.jpg"> Abbildung 1. (A) A 12 h Zeitverlauf Experiment N19 OLG Kulturen 48 h nach der Transfektion Ausdruck RFP-MBP (roter Kanal) zusammen mit 3 ul der NucView 488 Substrat (grüner Kanal). Die Kulturen wurden entweder mit einer Endkonzentration von 80 mM behandelt [K +] (linkes Bild) oder keine Behandlung als Kontrolle (rechte Bilder). Die Bilder wurden bei 6 min Intervallen erfasst und deutliche Aktivierung von Caspase gespalten-3 (grün) kann beobachten,d in Kulturen mit 80 mM behandelt [K +] innerhalb der Zellkerne (Hash-Box) im Vergleich zur Kontrollgruppe zu experimentieren. (B) Anteil der gespaltenen Caspase-3-Zellen (berechnet durch Division der Gesamtzahl der Zellen in das Blickfeld von die Gesamtzahl der Caspase-positive Zellen). Im Vergleich zu Bedingungen zu kontrollieren, beobachten wir rund 45% Zelltod nach K +-Behandlung um 12 h. SVideo 1. A 12 h Zeitverlauf Experiment N19-OLG Kulturen 48 h nach der Transfektion Ausdruck RFP-MBP (roter Kanal) mit 3 ul der NucView 488 Substrat (grüner Kanal), zusammen mit Hellfeld-Bilder und ein Drei-Wege- zusammengefügte Bild, nach Behandlung mit 80 mM [K +]. SVideo 2. A 12 h Zeitverlauf Experiment N19-OLG Kulturen 48 h nach der Transfektion Ausdruck RFP-MBP (roter Kanal) mit 3 ul der NucView 488 Substrat (grüner Kanal), zusammen mit Hellfeld-images und ein Drei-Wege-zusammengefügte Bild. Keine Behandlung war es, die Kulturen angelegt und N19-OLGs sehen die Migration durch das Mikroskop Bereich im Gegensatz zu Zellkulturen, die mit 80 mM behandelt werden [K +] (mit S-Video 1 zu vergleichen).

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</ol>

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offen zu legen.

Obwohl dies nicht die einzige fluorogenen Produkt für die Apoptose-Erkennung gibt es mehrere signifikante Vorteile bei der Verwendung der NucView 488 Substrat. Einer der wichtigsten Vorteile ist die Fähigkeit, Apoptose in lebenden Zellen in Echtzeit zu verfolgen, während die meisten alternativen Produkten entweder Zelllyse benötigen oder haben schlechte Zellpermeabilität. Weitere Vorteile sind die hohe Empfindlichkeit für Caspase-3-Erkennung, hohe Zellpermeabilität, geringe Zytotoxizität und keine Interferenzen mit dem Fortschreiten der Apoptose. Der Untergrund hat auch geringe Hintergrundfluoreszenz, bis es gespalten und gelangt in den Zellkern, die Hintergrund-Fluoreszenz eliminiert. Die Caspase-3-Erkennungssequenz enthält 3 negative Ladungen und der DNA-bindenden Farbstoff hat eine positive Ladung 2. Die DEVD-NucView 488-Molekül hat also eine negative Ladung, welche die Aktivierung und Bindung des Farbstoffs verhindert, um DNA in Zellen, in denen Caspase ist nicht aktiv. Maintaining Konsistenz zwischen den Experimenten ist erforderlich, um der Lage sein, sinnvolle Vergleiche zwischen den Wiederholungen zu ziehen. Einer der wichtigsten Parameter zu halten konsistent ist Zelldichte, als es die Rate der Transfektion beeinflusst. Die Realisierung hoher Transfektionsraten in verewigt N19-OLG Zellkulturen ist schwieriger als mit anderen gängigen Zelllinien wie HeLa-oder HEK293, und ist stark abhängig von Dichte, in unserer Erfahrung 12, 13. Unsere beste Transfektionseffizienz für diese Zellen mit Fugene HD (Roche) wurden erhalten und sind in der Regel etwa 15%, kann aber über 30% zu erreichen, je nach zu bauen. Sorgfältige Zellzählung wird in eine kohärente Transfektionsraten Hilfe. Es ist auch wichtig, um Zellen aus verschiedenen Behandlungen, um das gleiche Maß an Umwelt-Stress aussetzen, insbesondere bei der Messung Raten von Apoptose. Insbesondere sind die Länge der Zeit, über die die Zellen Transfektionsreagenzien, oder die Höhe der Belichtung ausgesetzt sind, wichtige ökologische VariablenAbles zu prüfen, und sollte konstant bleiben über Experimente. Für unsere Anwendungen haben wir festgestellt, dass die Sammlung einer großen Anzahl von Feldern-of-view bietet eine ausreichend große Stichprobe, um statistisch signifikante Vergleiche make [ebd.].

Tabelle der spezifischen Reagenzien und Geräte <table border="1"><tr><th> Name des Reagenz </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nummer </th></tr><tr><td> NucView 488 Caspase-3 Assay Kit for Live Cells </td><td> Biotium </td><td> 30029 </td></tr><tr><td> FuGENE HD Transfektionsreagenz </td><td> Roche </td><td> 04709705001 </td></tr><tr><td> Dulbecco modifiziertes Eagle-Medium </td><td> Gibco </td><td> 31053-028 </td></tr><tr><td> 0,25% Trypsin </td><td> Gibco </td><td> 15050-065 </td></tr><tr><td> Fetal Bovine Serum </td><td> Gibco </td><td> 12483-020 </td></tr><tr><td> Penicillin / Streptomycin </td><td> Gibco </td><td> 15140122 </td></tr><tr><td> # 1,5-25 mm Deckglas </td><td> Warner Instruments </td><td> 64-0715 </td></tr><tr><td> Chamlide CMB magnetische Kultur Kammer für 25 mm Deckglas </td&gt; <td> Quorum Technologies </td><td> CM-B-40 </td></tr><tr><td> Cellstart Gewebekultur 10 cm Teller </td><td> VWR </td><td> 82050-576 </td></tr><tr><td> BD Falcon 6-Well-Platten </td><td> VWR </td><td> CA62406-161 </td></tr></table>

Überwachung cleaved caspase-3 aktivität und apoptose von immortalized oligodendrozyten mit live-cell imaging und cleaveable fluorogenic-farbstoff-substrate nach kalium-induzierten membrandepolarisation

Monitoring Cleaved Caspase-3 Activity and Apoptosis of Immortalized Oligodendroglial Cells using Live-cell Imaging and Cleaveable Fluorogenic-dye Substrates Following Potassium-induced Membrane Depolarization

Das zentrale Nervensystem erleben können eine Reihe von Belastungen und neurologischen Beleidigungen, die zahlreiche negative Auswirkungen, die letztendlich zu einer Verringerung der neuronalen Population und Funktion führen haben kann. Verletzte Axone Freisetzung erregenden Moleküle wie Kalium-oder Glutamat in die extrazelluläre Matrix, die wiederum weitere Beleidigung und Verletzung der Unterstützung Gliazellen einschließlich Astrozyten und Oligodendrozyten 8, 16 produzieren kann. Wenn die Beleidigung besteht, werden die Zellen durchlaufen den programmierten Zelltod (Apoptose), die geregelt und wird durch eine Reihe von etablierten Signaltransduktionskaskaden 14 aktiviert. Apoptose und Nekrose Gewebe kann nach Schädel-Hirn-Verletzungen, zerebrale Ischämie und Krampfanfälle auftreten. Ein klassisches Beispiel für apoptotische Regulation ist die Familie der Cystein-abhängige Aspartat-Proteasen gerichtet, oder Caspasen. Aktivierte Proteasen einschließlich Caspasen wurden auch in den Zelltod als Reaktion auf chronische neuro verwickeltdegenerative Krankheiten wie Alzheimer, Huntington und Multiple-Sklerose-4, 14, 3, 11, 7. In diesem Protokoll beschreiben wir die Verwendung des NucView 488 Caspase-3-Substrat, um die Rate der Caspase-3-vermittelte Apoptose in verewigt N19-Oligodendrozyten (OLG) Zellkulturen 15, 5 zu messen, nach Exposition mit verschiedenen extrazellulären Belastungen wie hohe Konzentrationen von Kalium-oder Glutamat. Das bedingt, verewigt N19-OLG-Zelllinie (als Vertreter der O2A Vorläuferzellen) wurde von Dr. Anthony Campagnoni (UCLA Semel Institute for Neuroscience) 15, 5 erhalten und wurde bereits verwendet, um molekulare Mechanismen der Myelin-Genexpression und Signaltransduktion führenden Studie zu OLG Differenzierung (z. B. 6, 10). Wir haben diese Zelllinie gefunden werden im Hinblick auf die Transfektion mit exogenen Myelin basisches Protein (MBP) robust konstruiert fusioniert entweder RFP oder GFP (rot oder grün fluoreszierendes Protein) 13,12. Hier wurden die N19-OLG Zellkulturen entweder mit 80 mM Kaliumchlorid oder 100 mM Natrium-Glutamat zu axonalen Leckage in der extrazellulären Matrix zu imitieren, um Apoptose zu induzieren 9 behandelt. Wir verwendeten eine bi-funktionale Caspase-3-Substrat mit einer DEVD (Asp-Glu-Val-Asp) Caspase-3 Anerkennung Untereinheit und einer DNA-bindenden Farbstoff 2. Der Untergrund schnell geht das Zytoplasma, wo sie von intrazellulären Caspase-3 gespalten wird. Der Farbstoff, NucView 488 ist freigegeben und gelangt in den Zellkern, wo sie DNA und fluoresziert grün bindet bei 488 nm, Apoptose zu signalisieren. Die Nutzung der NucView 488 Caspase-3-Substrat ermöglicht live-cell imaging in real-time 1, 10. In diesem Video beschreiben wir auch die Kultivierung und Transfektion von immortalisierten N19-OLG-Zellen, sowie Live-Cell-Imaging-Techniken.

Live-Cell-Imaging von Caspase-3-vermittelte Apoptose in verewigt N19-Oligodendrozyten-Zellkulturen unter Verwendung des<em&gt; NucView</em&gt; 488 Caspase-3-Substrat. Diese Technik ist für den programmierten Zelltod-Assays in Echtzeit in einer Vielzahl von Zelltypen und Geweben.

Überwachung Cleaved Caspase-3 Aktivität und Apoptose von Immortalized Oligodendrozyten mit Live-cell Imaging und Cleaveable Fluorogenic-Farbstoff-Substrate Nach Kalium-induzierten Membrandepolarisation

Das Zentralnervensystem kann einer Reihe von Belastungen und neurologischen Insulten ausgesetzt sein, die zahlreiche adverse Effekte haben können, welche letztendlich zu einem ...

Dieses Verfahren ermöglicht die Echtzeitüberwachung des Oligo-DDR-Gliazelltods. Dies wird erreicht, indem die Zellen zunächst kultiviert und anschließend für die Live-Cell-Abbildung vorbereitet werden. Im nächsten Schritt werden die Zellen einer Behandlung unterzogen und die Effekte mittels Fluoreszenzmikroskopie überwacht.Der letzte Schritt besteht in der Durchführung der Datenanalyse. Letztendlich zeigen die Ergebnisse die Raten des Zelltods in einer Zellpopulation nach einer Behandlung oder Reizung an, indem die nukleare Fluoreszenz eines caspasenaktivierten Fluoreszenzfarbstoffs überwacht wird. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber etablierten Methoden wie der Immunfärbung liegt in der Möglichkeit, mehrere Zeitpunkte gleichzeitig zu erfassen.Mit dieser Methode lassen sich zentrale Fragen der Zellbiologie beantworten, beispielsweise bezüglich der Reaktionen auf pharmakologische, reagentielle und verschiedene andere Behandlungen. Aktuell ermöglicht diese Methode Einblicke in den Zelltod innerhalb von Zellkulturen. Sie kann außerdem auf andere Systeme angewandt werden, wie zum Beispiel ex vivo- und organotypische Gewebe, einschließlich Hirnschnitten.Im Allgemeinen haben Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten, während sie sich daran gewöhnen, mit lebendem Gewebe anstelle von fixiertem Gewebe zu arbeiten. Eine visuelle Demonstration dieser Technik ist wichtig, da im Vergleich zu fixiertem Gewebe viele Schritte zur Vorbereitung von lebenden Zellproben erforderlich sind. Tauen Sie zunächst gefrorene immortalisierte N 19 Oligo droog gliale Zellen in einem Wasserbad von 37 Grad Celsius auf, während die Zellen auftauen.Geben Sie sieben Milliliter High-Glucose-DMEM, ergänzt mit 10 % FBS und 1 % Penicillin-Streptomycin, in eine 10 cm große Kulturschale. Anschließend die Zellsuspension tropfenweise auf die Platte geben und die Petrischale vorsichtig schwenken, um die Zellen gleichmäßig zu verteilen. Kultivieren Sie die Zellen vier Stunden lang bei 34 Grad Celsius in einem CO₂-Inkubator mit 5 % Kohlendioxid, nachdem vier Stunden verstrichen sind.Entfernen Sie das Medium von den Platten, um verbleibendes DMSO-Cryoprotektivmittel zu eliminieren. Ersetzen Sie es nach vier bis sieben Tagen Wachstum durch sieben Milliliter frisches Medium. Wenn die Zellen eine Konfluenz von 70 bis 80 % erreicht haben, aspirieren Sie das Medium und pipettieren Sie einen Milliliter Dispersion auf den Zellrasen, inkubieren Sie fünf Minuten bei Raumtemperatur.Dann ernten Sie die Zellen und säen Sie diese in eine 10 cm große Zellkulturschale mit den geernteten Zellen in einer Dichte von 0,1 × 10⁶ Zellen pro Milliliter aus, und stellen Sie diese Schale in den Zellkulturtrockenschrank. Nach einer weiteren Passage können die Zellen für Live-Cell-Imaging-Experimente ausgesät werden. Gehen Sie dazu wie zuvor vor, um die Zellen zu ernten, entnehmen Sie dann 30 µL der Zellsuspension und zählen Sie die Zellen mithilfe eines Hämozytometers.Verwenden Sie anschließend sterile Pinzette, um unbeschichtete Glasdeckgläser zu platzieren. Geben Sie in die Vertiefungen einer 6-Loch-Platte Zellen mit einer Dichte von 0,1 × 10⁶ Zellen pro Milliliter in die Vertiefung. Lassen Sie die Zellen über Nacht in zwei Milliliter phenolfreiem DMEM mit hohem Glukosegehalt, ergänzt mit 10 % FBS und 1 % Penicillin-Streptomycin, bei 34 °C und 5 % Kohlendioxid wachsen.Am nächsten Tag 100&nbsp;Mikroliter serumfreies Medium mit 0,5 bis vier&nbsp;Mikrogramm gereinigtem Plasmid-DNA und vier&nbsp;Mikrolitern FU-Gene-HD mischen. Die Mischung vorsichtig zweimal verwirbeln und anschließend die DNA fünf Minuten bei Raumtemperatur komplexieren lassen. Nach Ablauf der Inkubationszeit die FU-Gene-HD-DNA-Mischung direkt den kultivierten Zellen hinzufügen.Kippen Sie die Platte vorsichtig, um die Flüssigkeit zu mischen. Kultivieren Sie die Zellen anschließend weitere 48 Stunden bei 34 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid, bevor Sie mit der Behandlung oder den Experimenten fortfahren. Schalten Sie zuerst das Steuergerät des LCI Cham Light Live-Cell-Instruments ein.Dies sollte drei Stunden vor Versuchsbeginn erfolgen, um eine gründliche Aufwärmung des Stages sicherzustellen. Mindestens eine Stunde vor Versuchsbeginn sollte die Steuerbox eingeschaltet werden. Anschließend im Flussbrüschensprüh die LCI Cham light magnetische Kulturkammer und die Pinzette mit 70 % Ethanol ein und lassen Sie sie fünf Minuten lang trocknen.Entfernen Sie die Zellen aus dem Inkubator und untersuchen Sie sie unter dem Mikroskop, um sicherzustellen, dass sie gesund sind. Die Zellen sollten auf dem Glasdeckchen dicht und gut ausgebreitet erscheinen und zahlreiche Membranausläufer aufweisen. Zellen mit einer verminderten Anzahl an Ausläufern oder einem unregelmäßig geformten Zellkern sind vermutlich durch die Transfektion belastet und für weitere Experimente im Flusshaubenarbeitsbereich ungeeignet.Neigen Sie die 6-Loch-Platte und entfernen Sie die Deckgläser mit einer Pinzette. Legen Sie die Deckgläser schnell mit der Zellseite nach oben in die untere Kammerplatte. Lassen Sie die Deckgläser nicht austrocknen.Befestigen Sie anschließend den magnetischen Hauptkörper der Kulturkammer und geben Sie 500 µL Medium aus der ursprünglichen 6-Loch-Platte auf die Oberseite des Deckgläschens. Die Wiederverwendung des Mediums verringert die durch Umweltveränderungen verursachten Belastungen für die Zellen und kann außerdem nützlich sein, um extrazellulär sezernierte Faktoren zu bewerten. Nachdem das Medium hinzugefügt wurde, setzen Sie das Glasdeckel auf die Kulturkammer und verwenden Sie einen Kim-Tücher-Zopf mit 70 %, um rückständige Materialien von der Unterseite des Deckgläschens zu entfernen, die die Mikroskopie stören könnten.Stellen Sie die Kulturkammer für 30 Minuten in den Inkubator bei 34 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid. Dieser Schritt stellt sicher, dass die Kammer selbst auf 34 Grad erwärmt wird, um eine Verschiebung des Deckglases zu vermeiden. Während das Metall erwärmt, ist es notwendig, bei den folgenden Schritten die Umgebungsbeleuchtung so gering wie möglich zu halten.Zunächst hatte Thora zuvor Elektra mit Nuklearblick bei Raumtemperatur vorbereitet. Danach entnehmen Sie die Kulturkammer aus dem Inkubator und stellen sie schnell in die Umgebungskammer des Mikroskops. Schalten Sie den mit 5 % vorgegasten Kohlendioxid-Behälter mit Doppelregler ein.Danach unter Verwendung des 10-fachen Objektivs mit der Mikroskoplampe auf etwa 2,5 Volt eingestellt und der Belichtungszeit auf 240 Millisekunden. Fokussieren Sie mit Hellfeldmikroskopie, um die Zellen auf dem Computermonitor sichtbar zu machen. Anschließend geben Sie eine 80 Millimolar konzentrierte Kaliumionenlösung oder einen anderen Apoptoseinduktor über Medienaustausch mit langsamer und lokaler Perfusionszufuhr mittels einer peristaltischen Pumpe zu den Zellen hinzu.Das Nuke View 4 88 Substrat ist in der Zellkultur für Experimente stabil, die bis zu 36 Stunden dauern. Daher ist es möglich, Experimente über diesen Zeitraum durchzuführen. Richten Sie zuerst das Mikroskop so ein, dass die Fluoreszenz von rotem und grünem fluoreszierendem Protein sichtbar wird.Klicken Sie dann auf den roten Kanal, um die transfizierten Zellen anzuzeigen. Wählen Sie etwa 12 Bilder mit mehreren transfizierten Zellen aus und speichern Sie diese XY-Bühnenpositionen. Lassen Sie das Mikroskop alle sechs Minuten an diesen gespeicherten Positionen Bilder im Hellfeld, roten Kanal und grünen Kanal aufnehmen.Nach der Erfassung mehrerer XY-Punkte aus duplizierten oder triplicierten Experimenten die Daten aus separaten, an verschiedenen Tagen durchgeführten Experimenten zusammenstellen und die Datenanalyse sowie statistische Tests gemäß dem schriftlichen Protokoll durchführen, um das Verhältnis von CASP-Bay-negativen zu CASP-Bay-positiven Zellen zu vergleichen. Das Substrat Nuke View 4 88 kann auf eine erhöhte Apoptoserate in N 19 Oligo DDR glialen Zellkulturen hinweisen. Nach einer Behandlung mit hoher extrazellulärer Kaliumkonzentration wurden diese Basislinienbilder mit einem 10-fachen Objektiv aufgenommen.Die N 19-Zellen wurden mit RFP transfiziert und entweder mit drei Mikrolitern Nuke View, 4 88 Substrat für Kontrollzellen oder mit drei Mikrolitern Nuke View, 4 88 Substrat und 80 Millimolar Kalium behandelt. Diese Bilder zeigen, dass die Anzahl apoptotischer Zellen im Verlauf der Zeit – drei, sechs und neun Stunden nach der Behandlung mit 80 Millimolar Kalium – zunimmt. Unter Kontrollbedingungen wurden im Vergleich zu den mit 80 Millimolar Kalium behandelten Kulturen keine signifikanten Mengen an Apoptose beobachtet. Das im Hintergrund sichtbare grüne Signal unter Kontrollbedingungen weist auf Zellen hin, die Apoptose durchlaufen, ohne dass extrazelluläres Kalium zugegeben wurde.Ein 12-stündiger Zeitverlauf ist für Studien, die neurologische Schädigungen betreffen, ausreichend. Nach 12 Stunden zeigten die mit Kalium behandelten Kulturen etwa 45 % Zelltod. Praktisch keine der Zellen im Kontrollexperiment zeigt zum 12-Stunden-Zeitpunkt Apoptose. Obwohl in anderen Fällen die Experimente möglicherweise länger durchgeführt werden müssen.Dieses Diagramm zeigt die Zunahme der Caspase-3-positiven Zellen im zeitlichen Verlauf des zwölfstündigen Experiments. Sobald man mit der Technik vertraut ist, kann sie innerhalb einer Stunde durchgeführt werden, und die Datenerfassung kann über Nacht erfolgen, sofern alles korrekt durchgeführt wird. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, zwischen den Behandlungsgruppen konsequent zu bleiben, wenn man diesem Protokoll folgt.Andere Methoden wie die Immunfärbung können verwendet werden, um weitere downstream Proteine zu untersuchen, die in den untersuchten Signalwegen beteiligt sind. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Proben für die Bildgebung vorzubereiten sind. Erfassen Sie einen Datensatz und analysieren Sie Ihre Daten.

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Dieses Video beschreibt einen in vitro Caspase-3/7 Lumineszenz-Assay zur Quantifizierung von Zelltod oder Apoptose. Der Assay misst die Lumineszenz, die nach der Caspase-3/7-Spaltung eines prolumineszierenden DEVID-Substrats erzeugt wird. Die erzeugte Lumineszenz ist proportional zur Caspase-3/7-Aktivität.

Caspase-3/7-Assay: Ein lumineszenzbasierter Assay zur Quantifizierung der Apoptose durch Messung der Caspase-3/7-Aktivitäten in Froschhaut-Explantaten

Dieses Video zeigt die Aktivierung von Caspase-Proteinen in menschlichen Makrophagen unter Verwendung von bimolekularen Fluoreszenz-Komplementations-Reporterproteinen. Die Pro-Domänen von Caspase-1 sind mit nicht-fluoreszierenden Fragmenten von Venusproteinen fusioniert, die zu Inflammasom-Komplexen rekrutiert werden. Die Nähe von Inflammasomen induziert die Rückfaltung und Fluoreszenz von Venusfragmenten, was die Caspase-Aktivierung in den Makrophagen bestätigt.

Visualisierung der Caspase-Aktivierung in humanen Monozyten-abgeleiteten Makrophagen

Multiplex-Assays können nützliche Informationen für grundlegende zelluläre Mechanismen und beseitigen Abfälle von Reagenzien und unnötig wiederholende Experimenten. Wir beschreiben hier ein Multiplex-Caspase-3/7 Aktivitätstest unter Verwendung von fluoreszierenden und lumineszier-basierte Verfahren, um die Lebensfähigkeit der Zellen in einem in vitro Modell Hypothalamus folgenden oxidativen Herausforderung mit Palmitinsäure bestimmen.

Verwendung eines Caspase Multiplexing-Test zur Apoptose in einer Zelle Hypothalamus Modell ermitteln

Der Begriff Anastase bezieht sich auf das Phänomen, bei dem sterbende Zellen einen Zellselbstmordprozess in einem späten Stadium rückgängig machen, sich selbst reparieren und schließlich überleben. Hier demonstrieren wir Protokolle zum Nachweis und zur Verfolgung von Zellen, die einer Anastasierung unterzogen werden.

Strategien für die Spurhaltung Anastasis, einer Zelle Überleben Phänomen, das Apoptose Kehrt

Um die Mechanismen der Demyelinisierung und der neuronalen Apoptose in kortikalen Läsionen von entzündlichen demyelinisierenden Erkrankungen zu untersuchen, werden verschiedene Tiermodelle verwendet. Wir beschreiben hier einen ex vivo Ansatz, bei dem Oligodendrozyten-spezifische CD8+ T-Zellen auf Hirnschnitten verwendet werden, was zum oligodendroglialen und neuronalen Tod führt. Mögliche Anwendungen und Grenzen des Modells werden diskutiert.

Ein Ex-vivo- Modell eines Oligodendrozyten-gerichtete T-Cell Attack in akuten Hirnschnitten

Anastasis ist technisch anspruchsvoll, um in Vivo zu erkennen, da die Zellen, die der Zelle Todesprozess umgekehrt haben morphologisch nicht zu unterscheiden von normalen gesunden Zellen sein können. Hier beschreiben wir Protokolle für die Erkennung und Verfolgung von Zellen, die Anastasis mit lebenden Tieren zu unterziehen, durch den Einsatz unserer neu entwickelten in Vivo -CaspaseTracker-Biosensor-System.

Erkennung von Anastasis In Vivo durch CaspaseTracker Biosensor

Dieses Protokoll beschreibt Caspase bimolekulare Fluoreszenz-Ergänzung (BiFC); eine Imaging-basierte Methode, die verwendet werden, um induzierte Nähe der Initiator Caspasen, zu visualisieren, das ist der erste Schritt in ihre Aktivierung.

Die Wege zur Aktivierung der Caspase bimolekulare Fluoreszenz Ergänzung mit Beleuchtung

Es werden zwei verwandte Methoden beschrieben, um subzelluläre Ereignisse zu visualisieren, die für die synaptische Übertragung erforderlich sind. Diese Protokolle ermöglichen die Echtzeitüberwachung der Dynamik des präsynaptischen Kalziumeinflusses und der synaptischen Vesikelmembranfusion mittels Lebendzellbildgebung von in vitro kultivierten Neuronen.

Echtzeit-Fluoreszenzmessung synaptischer Funktionen in Modellen der amyotrophen Lateralsklerose

Das vorliegende Protokoll beschreibt zwei Methoden zur Messung der Caspase-Aktivität durch ein fluorogenes Substrat unter Verwendung von Durchflusszytometrie oder einem Spektrofluorometer.

Messung der Caspase-Aktivität mit einem fluorometrischen Assay oder einer Durchflusszytometrie

Dieses Protokoll beschreibt ein Lebendzell-Bildgebungsverfahren zur Überwachung der lysosomalen Membranpermeabilisierung während der Nekroptose unter Verwendung von Fluoreszenzsonden, die Veränderungen der Integrität der lysosomalen Membran und der Versauerung nachweisen.

Lebendzell-Bildgebung der Permeabilisierung der lysosomalen Membran während der Nekroptose

Erfahren Sie die Live-Cell-Imaging-Methode zur Echtzeitüberwachung von Caspase-3-vermitteltem Apoptose in N19-Oligodendrozyten mit NucView 488. Diese Technik ermöglicht dynamische Analysen von Zelltodmechanismen.

Überwachung Cleaved Caspase-3 Aktivität und Apoptose von Immortalized Oligodendrozyten mit Live-cell Imaging und Cleaveable Fluorogenic-Farbstoff-Substrate Nach Kalium-induzierten Membrandepolarisation (Video) | JoVE Journal

Überwachung Cleaved Caspase-3 Aktivität und Apoptose von Immortalized Oligodendrozyten mit Live-cell Imaging und Cleaveable Fluorogenic-Farbstoff-Substrate Nach Kalium-induzierten Membrandepolarisation

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