Name: Counting Nervenstammzellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-08-22T00:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 37 s
Description: Lernen Sie die Zählung menschlicher Nervenstammzellen mit einem Hämozytometer und Trypanblau zur Unterscheidung lebender und toter Zellen. Diese Methode ermöglicht präzise Viability-Bestimmungen für Gewebekultur-Experimente.

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Die Autoren bedanken sich bei Dr. Philip H. Schwartz des National Human Neural Stem Cell Ressourcen auf die Kinder s Hospital, Orange County Forschungsinstitut für die Bereitstellung hNSPC Kulturen anzuerkennen.

Passagierung humaner neuraler Stammzellen Hinweis: Bitte beachten Sie die <a href="/index/details.stp?ID=263">Passagierung Nervenstammzellen</a> Artikel auf, wie zu lösen, und Zellen. https://www.jove.com/index/Details.stp?ID=263 Vorbereitung der Zellsuspension für Counting <ol><li> Platz 25 ul von 0,4% Trypanblau-Lösung und 20 ul der Zelle Medien in ein Eppendorf-Röhrchen. </li><li> Resuspendieren der Zellen, um durch leichtes Antippen des Röhrchens mit den Zellen in einem bekannten Volumen von Medien, um eine homogene Suspension zu schaffen gezählt werden. Platz 5 ul der Zellen in das Eppendorf-Röhrchen aus dem vorherigen Schritt. Dieser Schritt verwässert die Zellkonzentration um den Faktor 10. </li><li> Legen Sie die Abdeckung Glas auf dem Hämazytometer und Last ca. 11-12 ul der Zellsuspension. <img src="/files/ftp_upload/old/262_2008_7_18_4/262_Figure-01.png" alt="262_Figure-01" width="511" height="139"> </li></ol> Zählen von Zellen in der Hämazytometer <ol><li> Beachten Sie die gesamte Raster der Hämazytometer in einem Phasenkontrastmikroskop. Konzentrieren Sie sich auf einen Quadranten des Rasters (wie die in rot). <img src="/files/ftp_upload/old/262_2008_7_18_5/262_Figure-02.png" alt="262_Figure-02" width="492" height="278"> </li><li> Tote oder sterbende Zellen erscheinen blau, weil ihre Membran beschädigt wurde und nicht in der Lage, die Trypanblau auszuschließen. Lebende Zellen werden nicht angezeigt, blau und wird von einem "Halo" von Licht im Phasenkontrast (wird "Phase-hell") umgeben sein. </li><li> Zählen Sie die Anzahl der lebensfähigen Zellen in einem Quadranten (Bereich 1 mm 2). Sie können auch bestimmen, die Lebensfähigkeit der Zellen, indem die Anzahl der lebensfähigen Zellen durch die Gesamtzahl der Zellen. Zählen von Zellen in 3-4 zufällige Quadranten und der Ermittlung der durchschnittlichen Anzahl der Zellen pro Quadrant. Da das Volumen eines Quadranten ist bekannt, dass 10 -4 ml oder 0,1 ul werden, kann die Konzentration von Zellen bestimmt werden <img src="/files/ftp_upload/old/262_2008_7_18_6/262_Figure-03.png" alt="262_Figure-03" width="741" height="165"> </li><li> Sie können folgende Verknüpfung mit der #-Zellen / ul zu bestimmen: <img src="/files/ftp_upload/old/262_2008_7_18_7/262_Figure-04.png" alt="262_Figure-04" width="368" height="69"> Gesamtanzahl von Zellen in Rohr = # Zellen / ul ul X in Rohr </li></ol>

<ol><li>Marchenko, S., Flanagan, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Passaging+Human+Neural+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Passaging Human Neural Stem Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. 7, 
 
 <a target="_blank" href="http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=263">http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=263</a> (2007).</li>
<li>Caprette, D. avidR. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+a+Hemacytometer%5BTitle%5D)+AND+%22BioEd+Online%22%5BJournal%5D)">Using a Hemacytometer.</a> BioEd Online. , 
 
 <a target="_blank" href="http://www.bioedonline.org/slides/slide01.cfm?q=%22hemacytometer&dpg=3">http://www.bioedonline.org/slides/slide01.cfm?q=%22hemacytometer&dpg=3</a> (2008).</li>
<li>Caprette, D. avidR. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Counting+Chamber+%28Hemacytometer%29%5BTitle%5D)+AND+%22BioEd+Online%22%5BJournal%5D)">Counting Chamber (Hemacytometer).</a> BioEd Online. , 
 
 <a target="_blank" href="http://www.bioedonline.org/slides/slide01.cfm?q=%22hemacytometer%22&dpg=2
">http://www.bioedonline.org/slides/slide01.cfm?q=%22hemacytometer%22&dpg=2
</a> (2008).</li>
</ol>

Dieses Protokoll beschreibt eine einfache und schnelle Weg, um die Zellkonzentration für eine Vielzahl von Experimenten mit Zellen zu bestimmen. Mit der Verknüpfung in 3d beschrieben, kann man schnell und genau zu bestimmen, die Zellkonzentration und insgesamt Zellzahl in einem bestimmten Volumen.

<table><tbody><tr><td>Phasenkontrast-Hämozytometer</td><td>Werkzeug</td><td>Hausser Scientific</td><td>02-671-54</td><td>Vertrieben von Fisher unter der angegebenen Katalognummer</td></tr><tr><td>Trypanblau-Färbung 0,4 %</td><td>Reagenz</td><td>GIBCO, von Life Technologies</td><td>15250-061</td><td>Vertrieben von Invitrogen unter der angegebenen Katalognummer</td></tr></tbody></table>

counting nervenstammzellen

Counting Human Neural Stem Cells

Die Kenntnis der genauen Anzahl der lebensfähigen Zellen in einem bestimmten Volumen einer Zellsuspension ist für viele Routine Gewebekultur Manipulationen, wie Plattieren Zellen für Immunzytochemie oder für Zell-Transfektionen erforderlich. Dieses Protokoll beschreibt eine einfache und schnelle Methode zur Unterscheidung zwischen lebenden und toten Zellen und die Quantifizierung der Zellkonzentration und insgesamt Zellzahl unter Verwendung eines Hämozytometers. Dieses Verfahren erfordert zunächst Ablösung von Zellen aus einem Wachstum Oberfläche und Resuspendieren sie in den Medien. Anschließend werden die Zellen in eine Lösung von Trypanblau (im Idealfall bis zu einer Konzentration, die 20-50 Zellen pro Quadrant geben wird) verdünnt und in die Hämazytometer. Schließlich, im Durchschnitt der Grafen von lebensfähigen Zellen in mehreren zufällig ausgewählten Quadranten, indem die durchschnittlich um das Volumen eines 1 mm 2-Quadranten (0,1 ul) und Multiplikation mit dem Verdünnungsfaktor ergibt die Anzahl der Zellen pro l. Multipliziert man diese Zellkonzentration durch das Gesamtvolumen in ul gibt die Gesamtzahl der Zellzahl. Dieses Protokoll beschreibt das Zählen menschliche neurale Stammzellen / Vorläuferzellen (hNSPCs), kann aber auch für viele andere Zelltypen verwendet werden.

Die Kenntnis der genauen Anzahl der lebensfähigen Zellen ist für viele Gewebekultur Manipulationen erforderlich. Dieses Protokoll beschreibt, wie man zwischen lebenden und toten Zellen zu unterscheiden und zu quantifizieren Zellen unter Verwendung eines Hämozytometers. Obwohl es das Zählen menschliche neurale Stammzellen / Vorläuferzellen (hNSPCs) beschreibt, kann es für andere Zelltypen verwendet werden.

Counting Nervenstammzellen

Die Kenntnis der exakten Anzahl lebensfähiger Zellen in einem bestimmten Volumen einer Zellsuspension ist für viele routinemäßige Gewebekulturmanipulationen erforderlich, wie zum Beispiel ...

Jetzt zeige ich Ihnen, wie man humane neurogene Vorläuferzellen zählt. Sie würden Ihre Zellen zählen, wenn Sie sie für die Immunchemie verwenden oder eine Transfektion mit dem nuklearen Faktor-Maschinenverfahren durchführen möchten. Ich verwende ein Phasenkontrast-Hämozytometer mit einem Randraster und außerdem einen Farbstoff namens Trypanblau. Der Farbstoff ist nützlich, da er zwischen lebenden und toten Zellen unterscheiden kann.Tote oder sterbende Zellen nehmen diesen Farbstoff auf und erscheinen blau. Wenn Sie die Zellen im Hämocytometer betrachten, können lebende Zellen diesen Farbstoff ausschließen und erscheinen daher nicht blau. Auf diese Weise können Sie die Vitalität Ihrer Zellen bestimmen, um eine Lösung aus Trypanblau und Medium herzustellen.Ich werde 20 Mikroliter der Trap- und Blue-Lösung in dieses 0,5-ml-Epi-Röhrchen geben. Danach werde ich 25 Mikroliter Medium hinzufügen. Somit habe ich derzeit 45 Mikroliter einer Mischung aus Trap, Pan-Blue und Medium, sodass ich nach Zugabe von fünf Mikrolitern Zellsuspension eine Verdünnung von 1 zu 10 erhalte.Und nun werde ich fünf Mikroliter Zellsuspension hinzufügen. Zunächst stelle ich sicher, dass die Zellen durch Vortexen

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Die Einführung eines Gens in eine Zelle ist eine leistungsfähige Methode für die Aufklärung ihrer Funktion in vivo. Dieses Protokoll beschreibt eine effiziente Methode zur Transfektion von einer Kultur des menschlichen neuronalen Stammzellen / Vorläuferzellen (hNSPCs) mit Hilfe der Elektroporation Nucleofector Apparat Amaxa gemacht.

Transfektion humaner neuraler Stammzellen mit dem Amaxa Nucleofector

Die Fähigkeit, menschliche neurale Stammzellen / Vorläuferzellen (hNSPCs) in vitro zu manipulieren, um ihre Eignung als Zelltransplantaten für therapeutische Zwecke zu untersuchen und für die menschliche Entwicklung des Nervensystems zu erforschen. Dieses Protokoll stellt eine Methode zur Kultivierung und Passagierung hNSPCs in der Hoffnung, steigende Reproduzierbarkeit der Forschung mit menschlichen Stammzellen.

Passagierung humaner neuraler Stammzellen

Immunzytochemie ist eine leistungsfähige Methode, um die Präsenz, subzelluläre Lokalisation und relative Häufigkeit eines Antigens von Interesse in kultivierten Zellen zu bestimmen. Dieses Protokoll stellt eine einfach zu folgen Reihe von Schritten, mit denen man Antikörper zu schonen und das Beste aus der eigenen Färbung wird.

Immunzytochemie: Human Neural Stem Cells

Dieses Video-Protokoll zeigt, wie zu diskriminieren und aufzählen bona fide neurale Stammzellen in einer gemischten Population von neuralen Vorläuferzellen über die neuronalen Kolonie-bildenden-Zell-Assay.

Neural-Colony Forming Zell-Assay: Ein Test zur Bona Fide neuralen Stammzellen aus neuralen Vorläuferzellen Discriminate

Eine einfache und zuverlässige Methode zur Isolierung und Kultivierung von neuralen Stammzellen aus gebrauchten menschlichen fetalen kortikalen Gewebe wird beschrieben. Kulturen von bekannten menschlichen neurologischen Erkrankungen abgeleitet werden können für die Charakterisierung von pathologischen zellulären und molekularen Prozesse eingesetzt werden, sowie eine Plattform bieten, um pharmakologische Wirksamkeit zu beurteilen.

Generierung von neuralen Stammzellen aus menschlichen Föten Ausrangierte Rindengewebe

Dieses Protokoll beschreibt einen neuartigen mechanischen Schneideverfahren, das die Erweiterung der sphärischen neuralen Stamm-und Vorläuferzellaggregate ohne Dissoziation zu einer Einzelzellsuspension ermöglicht. Die Aufrechterhaltung Zell / Zell-Kontakt ermöglicht eine schnelle und stabile Wachstum seit über 40 Passagen.

Ein cGMP-Verfahren zur Erweiterung anwendbar Aggregate von humanen neuralen Stamm-und Vorläuferzellen, abgeleitet von pluripotenten Stammzellen oder fetalen Hirngewebe

Es wurde eine Methode entwickelt, um direkt abzuleiten humanen neuralen Stammzellen aus hämatopoetischen Vorläuferzellen aus peripherem Blut Zellen angereichert.

Direkte Induktion von humanen neuralen Stammzellen aus peripherem Blut hämatopoetischen Vorläuferzellen

Mit der Absicht, Veränderungen in miRNAs auf differenzierten humanen neuralen Stammzellen (hNSCs) zu charakterisieren, beschreiben wir die hNSC-Differenzierung auf einem dreidimensionalen System, die Bewertung von Veränderungen in der microRNA-Expression durch miRNA-PCR-Arrays und computergestützte Analysen zur Vorhersage von miRNA-Zielen und deren Validierung durch duale Luciferase-Assays.

Differenzierung einer Menschen Neural Stem Cell Line auf Dreidimensional Kulturen, Analyse der MicroRNA und mutmaßlichen Zielgene

Das Rückenmark eines adulten Säugetieres enthält neurale Stamm-/Vorläuferzellen (NSPCs), die in Kultur isoliert und erweitert werden können. Dieses Protokoll beschreibt die Entnahme, Isolierung, Kultivierung und Passage von NSPCs, die aus der periventrikulären Region des adulten Rückenmarks von der Ratte und von menschlichen Organtransplantatspendern erzeugt wurden.

Isolierung von Neural Stamm- / Vorläuferzellen aus dem Periventrikuläre Region der erwachsenen Ratte und Human Spinal Cord

Neurale Stammzellen (NSCs) beziehen sich auf Zellen, die selbst zu erneuern und differenzieren sich in die drei neuronale Abstammungslinien. Hier beschreiben wir ein Protokoll NSC Frequenz in einer gegebenen Zellpopulation zu bestimmen, Neurosphärenbildung und Differenzierung unter klonalen Bedingungen.

Enumeration neuraler Stammzellen verwenden Geklonte Assays

Das Ziel dieses Protokolls ist es, einen Ansatz zur Analyse des Verhaltens von adulten neuronalen Stamm-/Vorläuferzellen als Reaktion auf die chemogenetische Manipulation eines bestimmten lokalen neuronalen Schaltkreises zu beschreiben.

Assaying Circuit Spezifische Regulation von adulthippocampal neuralen Vorläuferzellen

Lernen Sie die Zählung menschlicher Nervenstammzellen mit einem Hämozytometer und Trypanblau zur Unterscheidung lebender und toter Zellen. Diese Methode ermöglicht präzise Viability-Bestimmungen für Gewebekultur-Experimente.

Counting Nervenstammzellen

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