Counting Nervenstammzellen
22. August 2007
Die Kenntnis der genauen Anzahl der lebensfähigen Zellen ist für viele Gewebekultur Manipulationen erforderlich. Dieses Protokoll beschreibt, wie man zwischen lebenden und toten Zellen zu unterscheiden und zu quantifizieren Zellen unter Verwendung eines Hämozytometers. Obwohl es das Zählen menschliche neurale Stammzellen / Vorläuferzellen (hNSPCs) beschreibt, kann es für andere Zelltypen verwendet werden.
Jetzt zeige ich Ihnen, wie man humane neurogene Vorläuferzellen zählt. Sie würden Ihre Zellen zählen, wenn Sie sie für die Immunchemie verwenden oder eine Transfektion mit dem nuklearen Faktor-Maschinenverfahren durchführen möchten. Ich verwende ein Phasenkontrast-Hämozytometer mit einem Randraster und außerdem einen Farbstoff namens Trypanblau. Der Farbstoff ist nützlich, da er zwischen lebenden und toten Zellen unterscheiden kann.
Tote oder sterbende Zellen nehmen diesen Farbstoff auf und erscheinen blau. Wenn Sie die Zellen im Hämocytometer betrachten, können lebende Zellen diesen Farbstoff ausschließen und erscheinen daher nicht blau. Auf diese Weise können Sie die Vitalität Ihrer Zellen bestimmen, um eine Lösung aus Trypanblau und Medium herzustellen.
Ich werde 20 Mikroliter der Trap- und Blue-Lösung in dieses 0,5-ml-Epi-Röhrchen geben. Danach werde ich 25 Mikroliter Medium hinzufügen. Somit habe ich derzeit 45 Mikroliter einer Mischung aus Trap, Pan-Blue und Medium, sodass ich nach Zugabe von fünf Mikrolitern Zellsuspension eine Verdünnung von 1 zu 10 erhalte.
Und nun werde ich fünf Mikroliter Zellsuspension hinzufügen. Zunächst stelle ich sicher, dass die Zellen durch Vortexen mit dem Finger gut resuspendiert sind. Nun möchte ich sicherstellen, dass diese Lösung gut vermischt ist.
Ich werde das Bett also mehrmals hoch- und herunterfahren. Schließlich werde ich etwa 12 Mikroliter dieser Zellsuspension in ein Hämozytometer laden. Es verfügt über zwei Anschlüsse, und Sie können jeden davon verwenden.
Man muss also lediglich die Lösung an dieser Öffnung einführen, und die Flüssigkeit wird durch Kapillarwirkung aufgesaugt. Nun bin ich bereit zu zählen. Hier sehen wir den Hämozytometer bei 10×-Vergrößerung, und hier haben wir ein Quadrant, der 16 Quadrate enthält.
Und wie Sie sehen können, lassen sich hier lebende und tote Zellen beobachten. Hier haben wir lebende Zellen wie diese, diese und diese. Außerdem haben wir einige tote Zellen, wie zum Beispiel diese hier.
Wenn Sie genau hinsehen, erscheint die tote Zelle dunkelblau, während lebende Zellen so etwas wie einen Hof um sich herum aufweisen. Nun werde ich alle lebenden Zellen zählen. Dazu gehe ich von links nach rechts und von oben nach unten vor.
1, 2, 3, 4, 5, 6, 33, 1 32, 33, 34, 3 5, 3 6. Wir haben also insgesamt drei Sechszellen in diesem Quadranten. Wenn ich Zellen sehe, die sich am Rand des Quadranten befinden, beispielsweise entlang dieser Linie hier, zähle ich der Konsistenz halber Zellen, die auf dem linken und oberen Rand liegen.
Und ich zähle die Zellen an diesen Rändern für alle Quadranten des Hämozytometers durchgängig. Nun berechnen wir, wie viele Zellen wir pro Mikroliter haben. Dazu nehme ich den Durchschnitt der Zellen pro Quadrant, also 38, und multipliziere diesen mit 10, was einem Faktor entspricht, der durch die Abmessungen der Kammer bestimmt ist.
Und wir werden ebenfalls mit 10 multiplizieren, was in diesem Fall unser Verdünnungsfaktor ist. Am Ende erhalten wir die Anzahl der Zellen pro Mikroliter. In diesem Fall haben wir also 3.800 Zellen pro Mikroliter.
Und da wir unser Zellpellet in 500 Mikrolitern Lösung resuspendiert haben, können Sie berechnen, wie viele Zellen Sie insgesamt haben. Und wir sind fertig.
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Übersicht
Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Zählung menschlicher neuraler Stamm- bzw. Vorläuferzellen (hNSPCs) mithilfe eines Hämozytometers. Es unterstreicht die Bedeutung der Unterscheidung zwischen lebenden und toten Zellen für verschiedene Gewebekultur-Anwendungen.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Zellbiologie
- Gewebekultur
Hintergrund
- Die Anzahl lebensfähiger Zellen ist entscheidend für Manipulationen in der Gewebekultur.
- Lebende Zellen können bestimmte Farbstoffe ausschließen, tote Zellen hingegen nicht.
- Das Hämozytometer ist ein Standardwerkzeug zur Zellzählung.
- Der Trypanblau-Farbstoff wird häufig zur Beurteilung der Zellviabilität verwendet.
Zweck der Studie
- Eine zuverlässige Methode zur Zählung von hNSPCs bereitstellen.
- Lebende und tote Zellen effektiv unterscheiden.
- Forscher bei der Vorbereitung weiterer Experimente wie Immunchemie oder Transfektion unterstützen.
Verwendete Methoden
- Verwendung eines Phasenkontrast-Hämozytometers.
- Anwendung von Trypanblau-Färbemittel zur Unterscheidung der Zellviabilität.
- Zählung der Zellen unter dem Mikroskop.
- Herstellung einer Lösung aus Trypanblau und Medium.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Unterscheidung zwischen lebenden und toten Zellen.
- Präzise Quantifizierung von hNSPCs.
- Nachweis der Wirksamkeit der Trypanblau-Färbung.
- Bestätigung des Hämozytometers als zuverlässige Zählmethode.
Schlussfolgerungen
- Das Protokoll bietet einen einfachen Ansatz für die Zellzählung.
- Es ist auf verschiedene Zelltypen anwendbar, die über hNSPCs hinausgehen.
- Das Verständnis der Zellviabilität ist entscheidend für erfolgreiche Gewebekultur-Experimente.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Eine genaue Quantifizierung lebensfähiger humaner neuraler Stamm- bzw. Vorläuferzellen (hNSPCs) ist entscheidend für reproduzierbare Zellkulturabläufe in der neurowissenschaftlichen Wirkstoffforschung. Dieses Protokoll ermöglicht eine zuverlässige Beurteilung der Zellviabilität und die Bestimmung der Zellkonzentration und unterstützt so eine konsistente experimentelle Aussaat für nachgeschaltete Anwendungen wie Immunzytochemie und Transfektion. Durch die Standardisierung der Unterscheidung zwischen lebenden und toten Zellen mittels Trypanblau und der zellzahlbasierten Zählung mit dem Hämozytometer wird das Vorhersagevertrauen in frühen Phasen der Target-Validierung und der Assay-Entwicklung erhöht.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht eine präzise Aussaat von hNSPCs für Untersuchungen zur Zielstrukturenbindung und Modulation von Signalwegen.
- Operationaler Wert: Verringert die Variabilität in zellbasierten Assays, indem eine konsistente Zufuhr lebensfähiger Zellen sichergestellt wird.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Liefert quantitative, reproduzierbare Daten zur Zellkonzentration, die für die Standardisierung von Assays entscheidend sind.
- Operativer Wert: Ermöglicht die skalierbare Herstellung von Zellsuspensionen für High-Content-Screening-Formate.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Gewährleistet konsistente zelluläre Ausgangswerte in den Übergangsphasen von der Entdeckung bis zur präklinischen Entwicklung.
- Operationaler Wert: Ermöglicht die Zusammenarbeit zwischen verschiedenen Fachbereichen durch standardisierte Zellzählverfahren.
Pipeline- und Workflow-Integration
Diese Methode ist in den frühen Entdeckungsprozess integriert und unterstützt eine zuverlässige Zellpräparation von der Target-Validierung über die Assay-Optimierung bis hin zur präklinischen Wirksamkeitsprüfung.
- Entdeckungsbiochemie Gewährleistet eine genaue Zelldosierung für Target-Validierungsexperimente mit humanen NSPCs.
- Screening: Liefert standardisierte, quantifizierbare Zellmengen, die für eine reproduzierbare Assay-Leistung erforderlich sind.
- Analytik: Erzeugt Angaben zur lebensfähigen Zellkonzentration und Gesamtanzahl, die zur Normierung der experimentellen Bedingungen verwendet werden.
- Translationale Forschung Unterstützt die Kontinuität im Zellhandling zwischen in-vitro-Entdeckung und präklinischen Modellen.
- Unternehmensweites Wiederverwenden: Stellt eine übertragbare, wenig komplexe Methode dar, die auf verschiedene Zelltypen und Projekte anwendbar ist.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Verbessert die Vorhersagesicherheit, indem die Variabilität in zellbasierten experimentellen Eingangsparametern minimiert wird.
- Operativer Wert: Steigert die Reproduzierbarkeit und Standardisierung zwischen Laboren und Arbeitsgruppen.
- Strategischer Wert: Unterstützt fundierte Entscheidungen über Fortführung oder Abbruch durch verlässliche Assay-Grundlagen.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht eine risikoadjustierte Weiterentwicklung, indem die Datenqualität in der frühen Wirksamkeitsprüfung sichergestellt wird.
Durchführungsüberlegungen
- Benötigt grundlegende Zellkulturtechniken und Erfahrung in der Mikroskopie.
- Hängt von der Verfügbarkeit und ordnungsgemäßen Reinigung eines Hämozytometers ab, um Kontaminationen zu vermeiden.
- Erfordert eine einheitliche Schulung der Bediener, um eine unverzerrte Auswahl der Quadranten und einheitliche Regeln für die Zählung von Zellen an den Rändern sicherzustellen.
- Eingeschränkt durch die manuelle Zählgeschwindigkeit; nicht für die Automatisierung mit hohem Durchsatz geeignet, ohne Anpassungen vorzunehmen.
- Basiert auf korrekter Verdünnung und gründlichem Mischen, um eine repräsentative Probe der Zellsuspension zu gewährleisten.
