Counting Nervenstammzellen

Jetzt zeige ich Ihnen, wie man menschliche Neurovorläuferzellen zählt, und Sie würden Ihre Zellen zählen, wenn Sie sie für die Immunchemie einsetzen oder wenn Sie eine Transfektion mit einer Kernfaktormaschine durchführen möchten. Ich verwende ein Phasenkontrast-Hämozytometer, das ein Kantengitter hat, und wir verwenden auch einen Farbstoff namens Trip und Blau. Und der Farbstoff ist insofern nützlich, als er zwischen lebenden und toten Zellen unterscheiden kann.

Tote oder absterbende Zellen nehmen diesen Farbstoff auf und erscheinen blau. Wenn man sich die Zellen im Blut ansieht, sind das Zytometer und die lebenden Zellen in der Lage, diesen Farbstoff auszuschließen, und sie, sie, sie erscheinen nicht blau. Auf diese Weise können Sie die Lebensfähigkeit Ihrer Zellen bestimmen, um eine Lösung aus Trip, Blau und Medien herzustellen.

Ich werde 20 Mikroliter Trap und blaue Lösung in dieses 0,5 mil Epi-Röhrchen geben. Und dann füge ich 25 Mikroliter Medium hinzu. Auf diese Weise habe ich im Moment 45 Mikroliter einer Trap Pan Blue und Medienlösung, so dass, wenn ich fünf Mikroliter Zellsuspension hinzufüge, ich eine Verdünnung von eins bis 10 habe.

Und jetzt füge ich fünf Mikroliter Zellsuspension hinzu. Zuerst werde ich sicherstellen, dass die Zellen durch Fingerwirbeln gut resuspendiert werden. Jetzt möchte ich sicherstellen, dass diese Lösung gut gemischt ist.

Also werde ich das Bett ein paar Mal auf und ab stellen. Und schließlich werde ich etwa 12 Mikroliter dieser Zellsuspension in ein Hämozytometer laden. Es hat, es hat zwei Ports und Sie können, Sie können jeden verwenden.

Alles, was Sie tun müssen, ist, die Lösung an dieser Stelle einzuführen, und die Flüssigkeit wird durch eine Kapillarwirkung aufgesaugt. Und jetzt bin ich bereit zu zählen. Hier ist ein Blick auf das Hämozytometer bei 10 x und hier haben wir einen Quadranten, der 16 Quadrate enthält.

Und wie Sie sehen können, können wir hier lebende und tote Zellen beobachten. Hier haben wir lebende Zellen wie diese und diese und das. Und wir haben auch einige tote Zellen wie diese.

Wenn Sie es bemerken, erscheint die tote Zelle dunkelblau, während lebende Zellen eine Art Hagel um sich herum haben. Jetzt werde ich also alle lebenden Zellen zählen. Ich gehe also von links nach rechts und von oben nach unten.

1, 2, 3, 4, 5, 6, 33, 1 32, 33, 34, 3 5, 3 6. Wir haben also insgesamt drei sechs Zellen in diesem Quadranten. Wenn ich also Zellen sehe, die sich an der Grenze des Quadranten befinden, z. B. entlang dieser Linie hier, um konsistent zu sein, zähle ich die Zellen, die sich am linken Rand und am oberen Rand befinden.

Und ich zähle konsequent Zellen an diesen Grenzen für alle Quadranten auf dem Hämozytometer. Jetzt berechnen wir, wie viele Zellen wir pro Mikroliter haben. Und um das zu tun, nehme ich den Durchschnitt der Zellen pro Quadranten, der 38 ist, und multipliziere ihn mit 10, was ein Faktor ist, der durch die Abmessungen der Kammer bestimmt wird.

Und wir werden auch mit 10 multiplizieren, was in diesem Fall unser Verdünnungsfaktor ist. Und am Ende werden wir die Anzahl der Zellen pro Mikroliter erhalten. In diesem Fall haben wir also 3.800 Zellen pro Mikroliter.

Und da wir unsere Zellpalette in 500 Mikrolitern Lösung resuspendiert haben, können Sie berechnen, wie viele Zellen Sie insgesamt haben. Und schon sind wir bereit.