Differenzierung einer Menschen Neural Stem Cell Line auf Dreidimensional Kulturen, Analyse der MicroRNA und mutmaßlichen Zielgene

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist die Bewertung der Differenzierung von microRNA, der Profilerstellung und der Zielvalidierung Mr.NA einer humanen neuralen Stammzelllinie. Dies wird erreicht, indem zunächst menschliche neurale Stammzellen auf einem dreidimensionalen Kultursystem kultiviert werden, um die Zelldifferenzierung zu induzieren. Der zweite Schritt besteht darin, die Differenzierung zu quantifizieren, indem das Wachstum des Axonprozesses gemessen wird.

Als nächstes werden Veränderungen in der Mikro-RNA-Expression mit Hilfe eines MICRO R-N-A-P-C-R Arrays bewertet. Anschließend wird eine computergestützte Analyse ausgewählter differentiell exprimierter microRNAs durchgeführt, um einen Satz mutmaßlicher Ziel-mRNAs zu identifizieren. Letztendlich werden die Ziel-mRNAs durch Reporterplasmid, Transfektion und einen dualen Luciferase-Assay validiert.

Die hier vorgestellte Methode kann also dazu beitragen, wichtige Fragen im Bereich der neuralen Stammzellen zu beantworten, wie z. B. die Charakterisierung exprimierter microRNAs, und sie zielen auf Boten-RNAs in menschlichen neuralen Stammzellen ab, wenn sie sich in der Differenzierung befinden. Diese Methode kann jedoch Einblicke in die Biologie der neuralen Stammzellen geben. Es kann auch auf andere Stammzellsysteme wie mesenchymale Stammzellen, induzierte pluripotente Stammzellen oder andere Systeme angewendet werden, die eine Induktion der Differenzierung und molekulare Charakterisierung erfordern.

visuelle Demonstration dieser Methode schlüsselt die kritischen Schritte bei der Differenzierung einer menschlichen Neuros-Stammzelllinie auf und untersucht die microRNA-Profilerstellung und die Validierung der Ziel-mRNA, wobei gezeigt wird, dass ein Teil des Verfahrens Lavanie sein wird, ein Wissenschaftler aus meinem Labor. Dieser gesamte Eingriff sollte in einer biologischen Sicherheitswerkbank mit aseptischen Techniken durchgeführt werden. Rehydrieren Sie die Gerüste, indem Sie sie in jede Vertiefung des AL VX 12 auffüllen.

Füllen Sie zwei Milliliter 70%iges Ethanol, das mit Wasser für die Bewässerung hergestellt wurde, gut aus. Vermeiden Sie es, die Gerüste zu berühren, indem Sie das 70%ige Ethanol an der Wand jedes Gerüsts abgeben. Nun, saugen Sie das 70%ige Ethanol vorsichtig an und waschen Sie die Gerüste sofort eine Minute lang mit zwei Millilitern D-M-E-M-F 12

Wiederholen Sie den Waschvorgang zweimal, saugen Sie die D-M-E-M-F 12 nach der letzten Wäsche vorsichtig an. Beschichten Sie die Gerüste, indem Sie jeweils zwei Milliliter Laminin in D-M-E-M-F 12 hinzufügen. Inkubieren Sie die Platte mindestens zwei Stunden lang bei 37 Grad Celsius in einem mit 5 % Kohlendioxid befeuchteten Inkubator.

Als nächstes waschen Sie die Platte mit warmem D-M-E-M-F 12 Samen pro Gerüst mit ca. 500.000 menschlichen neuralen Stammzellen oder H nscs in einem Volumen von 150 Mikrolitern RMM-Medium mit Wachstumsfaktoren. Inkubieren Sie die Platte drei Stunden lang, damit sich die Zellen nach drei Stunden in den Gerüsten ansiedeln können. Geben Sie 3,5 Milliliter RMM in jede Vertiefung Achten Sie darauf, dass sich keine Zellen von den Gerüsten lösen.

Inkubieren Sie die Platte sieben oder 21 Tage lang. Tauschen Sie das RMM-Medium nach einem Tag aus, dem ist die erste Fütterung, und tauschen Sie das Medium zwei bis drei Tage nach der ersten Fütterung erneut aus. Sieben und 21 Tage nach der 3D-Kultur von H nscs.

Entfernen Sie das RMM-Medium und fixieren Sie die differenzierten Zellen mit 4%Paraformaldehyd. Die fixierten Zellen werden dann mit einem Beta-3-Tubulin-Primärantikörper gefärbt, der mit einem Fluorochrom-Konjugat nachgewiesen wurde. Sekundäre Antikörperzellkerne werden mit Haken gegengefärbt.

Nehmen Sie repräsentative Bilder der Beta-Drei-Tubulin-gefärbten Zellen auf. Speichern Sie die Bilder mit einem Fluoreszenzmikroskop im TIFF- oder JPEG-Format. Die Messung des Auswuchses von Axonprozessen erfolgt mit dem Messwerkzeug image PRO plus seven.

Um mit dem Öffnen des Bildes zu beginnen, wählen Sie die Messoption in der Symbolleiste und wählen Sie Trace-Funktion. Um die Spur zu starten, wählen Sie den Startpunkt auf dem Axonauswuchs aus, indem Sie mit der Maustaste auf die Spur über die gesamte Länge der Axonauswüchsung klicken, mit der rechten Maustaste, um jede Spur zu beenden. Messen Sie auf diese Weise alle Axonauswüchse innerhalb des Sichtfeldes, drücken Sie Messungen in Pixeln oder Mikrometern aus.

Exportieren Sie Längenmessungen in ein Tabellenkalkulationsprogramm für Probenvergleichs- und statistische Analysen, um Veränderungen in der Mikro-RNA-Expression der dreidimensional kultivierten HSCs zu bewerten. Führen Sie zunächst die Mikro-RNA-Extraktion und die Mikro-RNA-CD-NA-Präparation durch, wie im Begleitprotokoll beschrieben. Text unmittelbar nach dem Abrufen der Mikro-RNA CD NA.

Bereiten Sie die Mischung der PCR-Komponenten für die Echtzeit-PCR in einem 15-Milliliter-Röhrchen vor. Fügen Sie 1375 Mikroliter eines grünen Mastermixes X-S-Y-B-R hinzu. 100 Mikroliter Mikro-RNA, CD NA, 275 Mikroliter des Universalprimers und 1000 Mikroliter RNAs, freier Wassertransfer.

Die PCR-Komponenten vermischen sich mit einem PCR-Ladebehälter. Nehmen Sie das 96-Well-PCR-Array vorsichtig aus dem versiegelten Beutel. Geben Sie mit einer Mehrkanalpipette 25 Mikroliter der PCR-Komponenten hinzu.

In jede Vertiefung des PCR-Arrays mischen. Wechseln Sie die Pipettenspitzen nach jedem Pipettierschritt, um eine Kreuzkontamination zwischen den Well-Dichtungen zu vermeiden. Die 96-Well-Platte mit optischem Klebefilm und zentrifugieren Sie eine Minute lang bei 1000 GS bei Raumtemperatur, um Blasen zu entfernen, und überprüfen Sie die Platte visuell, um sicherzustellen, dass keine Blasen an der Stelle der Wells vorhanden sind.

Das 96-Well-Platten-PCR-Array im Echtzeit-Cycler-Programm. Der Echtzeit-Cycler entsprechend. Exportieren Sie anschließend die CT-Werte für alle Wells in eine leere Excel-Tabelle für die PCR-Array-Datenanalyse, einen Algorithmus, der online verfügbar ist PIC ktar wird zur Identifizierung von vorhergesagten micro-RNA-Zielen verwendet.

Klicken Sie auf, klicken Sie hier für die Vorhersage von pic ktar über Wirbeltiere, um eine neue Seite in der PIC KTAR-Weboberfläche zu öffnen. Wählen Sie im Dropdown-Menü die Spezies aus und geben Sie die gewünschte micro-RNA in das Feld für die micro-RNA-ID ein. Klicken Sie auf Nach Zielen einer microRNA suchen.

Es wird eine Liste der Ziel-mRNAs vorgestellt, die nach einem PIC KTAR-Score eingestuft sind. Die erhaltenen Rankings werden dann verwendet, um eine Vergleichstabelle der microRNAs zu erstellen. Ein duales Luciferase-Reporterplasmid wird als Werkzeug verwendet, um die Ziel-mRNAs zu validieren: Glühwürmchen und renale Luziferase-Aktivitäten werden 24 Stunden nach der Transfektion von Hela-Zellen gemessen.

Bereiten Sie die erste Arbeitslösung vor, indem Sie 50 Mikroliter Substrat und einen in 10 Milliliter Lösung eins geben und gründlich mischen, das Zellwachstumsmedium aus jeder Vertiefung der 24-Well-Platte entfernen und jeweils 300 Mikroliter Arbeitslösung hinzufügen. Übertragen Sie 100 Mikroliter des Inhalts jeder Vertiefung. Warten Sie von der 24-Well-Platte bis zu den drei Wells einer 96-Well-Platte 10 Minuten und messen Sie dann die Glühwürmchen-Luziferase-Aktivität in einem Luminometer-Set für die Lumineszenzerfassung.

Bereiten Sie Arbeitslösung zwei vor, indem Sie 50 Mikroliter Substrat und zwei bis 10 Milliliter Lösung zwei hinzufügen und gründlich mischen. Geben Sie 100 Mikroliter Arbeitslösung zwei in jede Vertiefung der 96-Well-Platte, die bereits 100 Mikroliter Arbeitslösung enthält. Warten Sie 10 Minuten und messen Sie dann die Aktivität der Nieren-Luziferase.

Anschließend wird das Verhältnis der Lumineszenz von der Glühwürmchen-Luziferase zur renalen Luziferase berechnet. Repräsentative Mikrofotografien von H-NSCS auf 3D-Gerüsten wurden nach immunchemischer Färbung von Beta-3-Tubulin (grün) und Zellkern-Gegenfärbung mit Haken (blau) und Messung von Axonprozessen mit Hilfe von Bildanalysesoftware aufgenommen. Ein Vergleich des Axonprozessauswuchses zwischen H-NSCs, die mit 3D-Gerüsten gezüchtet wurden, und mit traditionellen flachen Oberflächen- oder 2D-Kulturen zeigt, dass die 3D-differenzierten HSCs nach einer Woche oder drei Wochen ein größeres Axonprozesswachstum aufwiesen.

Die computergestützte Analyse zur Zielvorhersage führte zu den hier präsentierten Informationen: einer Liste der vorhergesagten microRNAs, Zielgenen sowie einem Präzisionsscore und aggregierten Werten. SOX fünf und NR vier A drei wurden als mutmaßliche Zielgene identifiziert. Ein dualer Luciferase-Reporter-Assay wurde verwendet, um die Ziele der microRNAs zu validieren, wie hier gezeigt.

Die relative Luciferase-Aktivität von humanen drei prime-UTR-Reportern der Gene SOX fünf und NR vier A drei war in Gegenwart der angegebenen microRNAs signifikant ausgeschaltet. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man ihn in neuralen Stammzellen unterscheidet und die Mikro-RNA-Expression und die Validierung von Ziel-Messenger.RNA untersucht.