Name: Differenzierung einer Menschen Neural Stem Cell Line auf Dreidimensional Kulturen, Analyse der MicroRNA und mutmaßlichen Zielgene (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 48 s
Description: Erfahren Sie die Differenzierung menschlicher neurale Stammzellen in 3D-Kulturen mit MicroRNA-Profiling und Validierung von Ziel-mRNAs durch PCR-Arrays und Dual-Luciferase-Assays.

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Wir erkennen an, Julie Heward für die Hilfe bei der Vorbereitung der hNSCs und Lavaniya Thanabalasundaram für ihre technische Unterstützung mit HeLa Züchtung und Transfektion.

1. HNSC Differenzierung Dreidimensional (3D) Kultur HINWEIS: Trennen Sie und leiten hNSCs, aus ethischer genehmigt Gewebe, in einer früheren Veröffentlichung 2 beschrieben. Bitte beachten Sie die ethischen und institutionellen Richtlinien während des folgenden Verfahrens. 1.1) 3D Culture Mit 12-Well-Platte <ol><li> Verwenden Sie aseptische Technik während des gesamten Verfahrens. In einer biologischen Sicherheitswerkbank, die mit Wasser bewässert (WFIR) rehydratisieren Gerüste durch Zugabe von 2 ml / Vertiefung von 70% Ethanol hergestellt. Berühren Sie nicht die Gerüste durch den Verzicht auf die 70% Ethanol auf der Wand jedes gut. </li><li> Die 70% Ethanol vorsichtig absaugen und sofort abwaschen die Gerüste mit 2 ml / Vertiefung DMEM: F12 für 1 min. Zweimal wiederholen den Waschvorgang. Sorgfältig absaugen DMEM: F12 nach dem letzten Waschen. </li><li> Coat Gerüste durch Zugabe von 2 ml / Vertiefung von Laminin (10 ug / ml) in DMEM: F12. Inkubieren Platte bei 37 ° C in einem 5% CO 2 Brummenidified Inkubator für ein Minimum von 2 Stunden. Waschplatte mit warmem DMEM: F12. </li><li> Saatgut jedes Gerüst mit etwa 500.000 hNSCs in einem Volumen von 150 ul RMM + GF. </li><li> Inkubiere die Platte für 3 h bei 37 ° C in einem 5% CO 2 befeuchteten Inkubator, sodass die Zellen, in die Gerüste zu regeln. </li><li> Fügen Sie 3,5 ml RMM in jede Vertiefung kümmert sich nicht um Zellen von Gerüsten zu entfernen. </li><li> Inkubieren der Platte für 7 Tage; ersetzen RMM Medium (3,5 ml / Vertiefung) nach 1 Tag (erste Fütterung) und wieder nach 2-3 Tagen aus der ersten Fütterung. </li><li> Nach 7 Tagen entfernen Medium und fixieren die Zellen mit 4% Paraformaldehyd (PFA) für Immunzytochemie (ICC) oder fügen Sie 500 ul / Vertiefung Lysereagenz für Gesamt-RNA-Extraktion (store Platte bei ≤ -80 ° C oder fahren Sie mit der Gesamt-RNA-Extraktion) . </li></ol> 1.2) Messung der Axon-Prozess Auswuchs <ol><li> Fleck 4% PFA fixiert differenzierte hNSCs nach einer Standard-ICC-Protokoll 20 mit β3-Tubulin (TUBB3) mit einem Fluorochrom konjugierten sekundären Antikörper nachgewiesen primären Antikörper. Gegenfärbung Zellkerne mit Hoechst (1 uM). </li><li> Erfassung repräsentativer Bilder von β3-Tubulin-gefärbten Zellen unter Verwendung eines Fluoreszenzmikroskops; Bilder als TIFF- oder JPEG speichern. Maß für Axon Prozess Auswuchs mit einem Software-Messinstrument (zB Image-Pro Plus). </li><li> Öffnen Sie das Bild, wählen Sie die Option Messungen in der Werkzeugleiste und wählen Sie Trace-Funktion. </li><li> Um den Trace zu starten, wählen Sie den Startpunkt auf dem Axon Auswuchs, indem Sie die Maustaste los. Spur entlang der gesamten Länge des Axon-Auswuchs; der rechten Maustaste, um jede Spur zu beenden. Wiederholen Sie alle Axon outgrowthswith in das Blickfeld zu messen. </li><li> Express-Messungen als Pixel oder um (ausstehende Kalibrierung einrichten). Export Längenmessungen in ein Tabellenkalkulationsprogramm für die Proben vergleichende und statistische Analyse. </li></ol> 2. miRNA-Expressions Verwenden einer Stammzellen undEntwicklungswege Focused miRNA PCR Array 2.1) miRNA Gesamt-RNA-Extraktion <ol><li> Führen miRNA Extraktion auf Gerüsten und 2D gewachsen Proben (differenzierte und undifferenzierte, HNSC Steuerung). </li><li> Tau-Gerüste, in einem 12-Well-Platte eingesetzt wird, falls erforderlich. Kombinieren Lysereagenz Inhalt (500 ul) von 2 Vertiefungen in der gleichen 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen, Endvolumen 1 ml Lysis-Reagens. Darauf achten, dass das Gerüst in der gut zu verlassen. </li><li> Für zuvor gesammelten als Trockenzellenpelle 2D gewachsen Proben (differenzierte HNSC 2D Kulturen und undifferenzierte Steuer) 1 ml Lyse-Reagenz und Inhalt in 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. </li><li> Homogenisieren Sie jede Probe mit einer 1-ml-Spritze und eine kurze 20 bis 25 Gauge-Nadel. Führen Sie das Lysat durch die Nadel mit einer 1 ml Spritze bis zu 5 Mal, bis ein homogenes Lysat erreicht. </li><li> Fügen Sie 200 ul Chloroform zu jedem Eppendorf-Röhrchen und Kappe fest. Umkehren und Wirbelrohre zummischen Inhalten. </li><li> Zentrifuge je 1,5 ml-Mikrozentrifugenröhrchen, das Homogenat 15 Minuten lang bei ≥12,000 x g. </li><li> Wird die obere wässrige Phase von jeder Probe (zur Vermeidung der Übertragung jedes der Interrosafarbene Flüssigkeit) in ein frisches 1,5 ml-Mikrozentrifugenröhrchen, das 750 &amp; mgr; l 100% Ethanol. Gründlich mischen durch Umdrehen. </li><li> Pipettieren von bis zu 700 &amp; mgr; l jeder Testprobe, einschließlich der Niederschlag, der in einen Mini-Säule in ein 2-ml-Collection-Tube. Schließen des Deckels und Zentrifuge bei ≥8,000 xg für etwa 30 sec bei Raumtemperatur. Verwerfen Sie den Durchfluss durch. Wiederholen dieser Schritt unter Verwendung der Rest der Probe. </li><li> Durchführen einer DNA-Digest für 15 min. </li><li> Fügen Sie 700 ul Puffer RWT an den Mini-Säule und zentrifugieren Sie für ca. 30 Sekunden bei ≥8,000 x g. Verwerfen Sie den Durchfluss durch. </li><li> Durch Zugabe von 500 &amp; mgr; l Puffer RPE und Zentrifugation für etwa 30 Sekunden bei ≥8,000 x g waschen Mini Spalte. Verwerfen Sie den Durchfluss durch. Wiederholen wash.Centrifuge bei ≥12,000 · g für 1 min, um die Membran weiter zu trocknen. </li><li> Eluieren Gesamt-RNA in einem 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen durch Zugabe von 40 &amp; mgr; l RNase-freies Wasser auf die Mini-Säule und Zentrifugieren für 1 min bei ≥8,000 x g. Messen Sie die Gesamt-RNA-Konzentration mit Hilfe eines geeigneten Spektralphotometer. </li></ol> 2.2) miRNA cDNA Vorbereitung <ol><li> Bereiten Sie die Reverse-Transkriptase-Master-Mix. Jede Probe erfordert 4 ul 5x miScript HiSpec Puffer, 2 ul 10x nucleics Mix miScript 2 ul-Reverse-Transkriptase-Mix. </li><li> Aliquoten 8 ul der Master-Mix in einem PCR-Röhrchen, fügen erforderliche Volumen von Gesamt-RNA (250 ng), und fügen Sie RNase-freiem Wasser auf ein Gesamtvolumen von 20 ul. </li><li> Inkubieren für 60 min bei 37 ° C.Incubate für 5 min bei 95 ° C bis miScript Reverse Transcriptase-Mischung zu inaktivieren. </li><li> Fügen Sie 200 ul RNase-freies Wasser zu je 20 ul Reverse-Transkriptions-Reaktion, bei -20 ° C, oder fahren Sie mit Echt timich sofort PCR. </li></ol> 2.3) Stammzellen und Entwicklungswege Focused miRNA PCR Array <ol><li> Die PCR-Komponenten-Mix in einem 15-ml-Röhrchen durch Zugabe von 1375 ul 2x SYBR Green Master Mix, 100 ul miRNA cDNA-Präparation, 275 ul von 10x miScript Universalgrundierung, und 1000 ul RNase-freies Wasser (Gesamtvolumen 2750 ul). </li><li> Übertragen PCR-Komponenten-Mix auf einem PCR-Ladebehälter. Die Platte mit 96 Vertiefungen PCR-Array aus der versiegelten Beutel vorsichtig entfernen. </li><li> In 25 ul PCR-Komponenten Mischung in jede Vertiefung der PCR-Array mit einem 8-Kanal-Pipette oder ein 12-Kanal-Pipette mit nur 8 Tipps. Ändern Pipettenspitzen nach jedem Pipettierschritt um eine Kreuzkontamination zwischen den Vertiefungen zu vermeiden. </li><li> Dichtungsplatte mit optischer Klebefolie und zentrifugieren für 1 min bei 1000 xg bei Raumtemperatur (15-25 ° C), um Luftblasen zu entfernen. Sichtprüfung der Platte von unten, um sicherzustellen, keine Luftblasen in den Vertiefungen vorhanden sind. </li><li> Legen Sie die Platte mit 96 Vertiefungen PCR-Array in der Echtzeit-Cycler. </li><li> Programmieren Sie die Echtzeit-Cycler entsprechend: 1 Zyklus bei 95 ° C für 10 min und 45 Zyklen für 15 Sekunden bei 95 ° C und 1 min bei 60 ° C einen einheitlichen (Fluoreszenz-Datenerfassung). </li><li> Exportieren Sie die Ct-Werte für alle Vertiefungen auf eine leere Excel-Tabelle für die Verwendung mit PCR-Array Datenanalyse Vorlage Excel und Web-basierte Software. HINWEIS: Software ist verfügbar <a href="http://www.SABiosciences.com/pcrarraydataanalysis.php">www.SABiosciences.com/pcrarraydataanalysis.php</a> . </li></ol> 3. Computergestützte Analyse für miRNA Ziel Vorhersage und Validierung von Ziel mRNAs durch Reporter Plasmid Transfektions und Ddual Luciferase Assay. 3.1) Computergestützte Analyse für miRNA Ziel Prediction <ol><li> Durchsuchen PicTar ( <a href="http://pictar.mdc-berlin.de/">http://pictar.mdc-berlin.de/</a> ) 21, online verfügbar Algorithmus zur Identifizierung von miRNA Ziel Vorhersage mRNAs. </li><li> Klicken Sie auf &quot;Klicken Sie hier, PicTar Vorhersage von Wirbeltieren&quot;. Eine neue Seite wird geöffnet. </li><li> In der neuen Seite, PicTar Web-Interface, wählen Arten in dem Dropdown-Menü und legen miRNA von Interesse in der miRNA-ID ein. Klicken Sie auf der Suche nach Zielen eines miRNA. </li><li> Beachten Sie die Liste der Ziel-mRNAs durch aPicTar Punktzahl rangiert. HINWEIS: PicTar berechnet eine Wertung die Wahrscheinlichkeit widerspiegelt, dass ein gegebenes UTR durch die ausgewählte miRNA richtet werden, und basierend auf Saatgut Komplementarität Thermodynamik und einer kombi Vorhersage für übliche Ziele in Sätzen von coexprimiert miRNAs 22. </li><li> Verwendung DIANA-LAB (Ähnlich abrufen Liste der Ziel-mRNAs <a href="http://diana.cslab.ece.ntua.gr/microT/">http://diana.cslab.ece.ntua.gr/microT/</a> ) 23 und Targetscan ( <a href="http://www.targetscan.org/">http://www.targetscan.org/</a> ) 24. Alternative online verfügbar Algorithmen. </li><li> Erstellen Sie eine Vergleichstabelle der miRNAs Basis Ranking unter Verwendung von verschiedenen Software-Tools. PicTar rangiert nach Punkten, DianaLab durch Präzision (basierend auf den Signal-Rauschabstand und einem Präzisions-Score zur Beurteilung der Bedeutung der erwarteten Ergebnisse) und Targetscan von aggregierten PCT (basierend auf Saatgut Komplementarität, thermodynamischen freien Bindungsenergie, die Erhaltung über verschiedene Arten), siehe Tabelle 1. </li></ol> 3.2) Validierung von Ziel mRNAs durch Reporter Plasmid Transfektions-und Dual-Luciferase Assay. HINWEIS: 3&#39;UTR Luciferase Reporter für die Validierung der Ziel-mRNA wurde zuvor beschrieben 25. <ol><li> Transfektion <ol><li> Seed HeLa-Zellen bei einer Dichte von 10 5 Zellen / Well in 24-Well-Platte. </li><li> Nach 24 Stunden, Co-Transfektion von HeLa-Zellen mit 1,5 ul Transfektionsreagenz und entweder 100 ng NR4A3 3 &#39;UTRor SOX5 3&#39;-UTR-Plasmid sowie 20 nM miRNA imitiert (hsa-miR-96-5p für SOX5 3217; UTR und hsa-miR-7-5p und hsa-miR-17-5p für NR4A3 3&#39;UTR beziehungsweise) pro Vertiefung. </li><li> Co-Transfektion von Kontrollvertiefungen mit NR4A3 3 &#39;UTRor SOX5 3&#39; UTRplasmid und Fluorochrom markiert Negativkontrolle siRNAs. Die Transfektion von Kontrollvertiefungen mit Fluorochrom markiert Negativkontrolle siRNAs ermöglicht Auswertung der Transfektionseffizienz und macht Mimik miRNA 3&#39;UTR bind Spezifität. </li></ol></li><li> Die Messung der Dual-Luciferase-Aktivitäten <ol><li> Messen Sie Firefly und Renilla-Luciferase-Aktivitäten 24 h nach der Transfektion. Entfernen Zellwachstumsmedium. </li><li> Bereiten Sie Arbeitslösung I durch Zugabe von 50 ul Substrat I in 10 ml Lösung I; gründlich mischen. Fügen Sie 300 ul der Arbeitslösung I in jedes 24-Loch. </li><li> Übertragen Sie den Inhalt jeder 24 gut in 3 Wells einer 96 weiße Platte wurden 100 ul jeder. Warten Sie 10 min und messen Firefly Luziferase in Luminometer Set für Lumineszenz Erwerb. </li><li> Bereiten Sie Arbeits solutIonen II durch Zugabe von 50 ul Substrat II in 10 ml Lösung II; gründlich mischen. 100 l Arbeitslösung I in jedes 96-Loch bereits 100 ul der Arbeitslösung, die I. </li><li> Warten Sie 10 min und messen Renilla-Luciferase in Luminometer Set für Lumineszenz Erwerb. Berechnen des Verhältnisses der Lumineszenz von der Firefly-Luciferase, um die Renilla-Luziferase. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Alle Autoren sind Mitarbeiter, Lager und / oder Aktienoptionsinhaber in ReNeuron AG oder ihre Muttergesellschaft. Diese Studie wurde von ReNeuron (RENE.L) unterstützt.

Die Entwicklung neuer in vitro-Tests zur Bewertung und Verbesserung der Differenzierung von Stammzellen ist seit jeher für die Untersuchung ihrer Funktionen und therapeutische Fähigkeiten eine Herausforderung. Langfristige und stabile Befestigung hNSCs, für die Entwicklung eines robusten 3D in vitro Differenzierungstest erforderlich ist, wurde durch Testen mehrerer 3D-Substrate mit verschiedenen Eigenschaften in der Bezeichnung von Materialien und Strukturen gerichtet. Im Rahmen der Assay-Entwicklung haben wir ebenfalls bewertet optimale Zellaussaat Konzentration und identifiziert die Anforderung für die Gerüste an Laminin beschichtet werden. Obwohl unsere hNSCs kann spontan bei differen 4-OHT und Wachstumsfaktor Entfernung, die Durchführung einer 3D-Kultursystem zeigte eine signifikante Verbesserung in ihrer Differenzierungsfähigkeit wie durch Axon-Auswuchs Verfahren gemessen im Vergleich zu Standard-2D-differen hNSCs. Um die Wirkung der 3D-induzierten differe untersuchenntiation auf HNSC miRNA-Expression verwendeten wir eine PCR-Array. Im Vergleich zu Standard-Chip-Microarray-PCR-Array bietet die Vorteile einer direkten Quantifizierung und Validierung der miRNA von Interesse. Obwohl das PCR-Array wird im Ausdruck der Gesamtzahl der miRNA pro Array, beispielsweise in hier weniger als 96 beschränkt, es kann so zugeschnitten werden, umfassen spezifisch miRNAs von Interesse, in unserem Fall bereits in der Stammzellentwicklung berichtet. Die Expression des Weges fokussiert miRNAs wurde in 3D- und 2D-differen hNSCs Profil verglichen mit undifferenzierten hNSCs. Die signifikant herunterreguliert miRNAs wurden ausgewählt und analysiert, um ihre mutmaßlichen Ziel-mRNAs mit der Absicht der Bestimmung ihrer Funktionalität und biologische Interpretation mit Online-Algorithmen (DIANA Lab PicTar und TargetScans) beurteilen. Eine einzelne miRNA kann Hunderte von Zielen erkannt und aus diesem Grund haben wir überprüft miRNA Interaktionen mit 3&#39;UTR mRNAsthat können geeignete Kandidaten in einem seinxonal Regulierung. NR4A3, ein Ziel der hsa-miR-7 und miR-17-Familie, ist ein Mitglied der Familie NR4A Kernrezeptoren, die, je nach dem Grad des Ausdrucks, in der Differenzierung, Überleben, Apoptose und Regulierung der Hippocampus beteiligt Axon Führung 26. Ähnlich SOX5, ein Ziel von HSA-miR-96, wird berichtet, dass der Zellzyklusprogression in der neuralen Vorläuferzellen 27 Axonlänge 28, Migration, Differenzierung nach der Migration, und die Vorsprünge von Neuronen 29 steuern. Sowohl SOX5 und NR4A3 wurden als direkte Ziel-mRNA von hsa-miR-96 hsa-miR-7 und 17 jeweils durch Dual-Luciferase-Reporter-Assays identifiziert werden, und. Dual-Luciferase (Firefly und Renilla) stützt sich auf zwei verschiedenen Reportergenen in demselben Plasmid und bietet ein verbessertes System ermöglicht Normalisierung für Auswirkungen durch suboptimale Transfektion und zytotoxische Wirkung gegenüber einer einzigen Luciferase-Plasmid-System verursacht. Im Rahmen unseres Assay-Entwicklung wir auch unsere Transfektion conditi optimiertons, um einen hohen Wirkungsgrad zu erzielen. Die protocolsdescribed hier kann genutzt werden, um weiter zu optimieren und zu charakterisieren, in vitro Differenzierung HNSC die für präklinische Studien und zukünftige klinische Anwendungen implementiert werden können intransplantation Protokolle.

Stammzellforschung spielt eine zentrale Rolle in der regenerativen Medizin, die auch umfasst die Disziplinen des Tissue Engineering, Entwicklungs Zellbiologie, Zelltherapeutika, Gentherapie und Biomaterialien (Gerüsten und Matrizen). Stammzellen sind in beiden Organ Entwicklungund Gewebereparatur wichtig; zu verstehen, wie Stammzellen funktionieren ist von zentraler Bedeutung für die Entwicklung neuer Stammzell-basierten Behandlungen ein. CTX0E03 ist eine klonale, konditional immortalisierten humanen neuralen Stammzellen (HNSC) Linie 2 vom ersten Trimester menschlichen fetalen Kortex isoliert. CTX0E03 hat Qualitätsmerkmale, die für die klinische Zellbank unter guten Herstellungspraxis (GMP) 3 definiert. HNSCs kann spontan in Nervenzellen, Gliazellen und Oligodendrozyten differenzieren und haben sich als neurologische Defizite zu verbessern, wenn in einem Nagetiermodell der fokalen Ischämie 2,4,5 transplantiert. Die CTX0E03 hNSCs sind derzeit in klinischen Studien für Schlaganfall Behindekeit (NCT01151124 6 und NCT02117635, Clinicaltrials.gov). MiRNAs eine durchschnittliche 22 Nukleotide lang und regulatorische Moleküle 7 bewiesen, sie kodieren Proteine, sondern binden 3 Prime-untranslatierten Region (3&#39;-UTR) von mRNAs, die Regulierung ihrer Stabilität und Übersetzung in Proteine. MiRNAs sind bekannt, die zur Regelung einer Anzahl von zellulären Prozessen, einschließlich der Entwicklung, Proliferation und Differenzierung 8 teilzunehmen. Mehrere miRNAs sind bei der Regulierung des Schicksals und Spezifikation von neuralen Stammzellen 9 in Verbindung gebracht. In zweidimensionalen (2D) Standardkulturumgebung der Komplexität der in vivo-Umgebung nicht übereinstimmen und folglich der Induktion und Regulation der Differenzierung HNSC nicht optimal ist. In vivo werden die Zellen durch eine dreidimensionale (3D) Mikroumgebung von anderen zusammen umgeben Zellen und extrazellulärer Liganden, darunter auch vieleTypen von Kollagenen, Laminin und andere Matrixproteine ​​(der extrazellulären Matrix, ECM). Frühere Studien haben berichtet, dass die architektonischen Topographie der Materialien nachahmt ECMs und deren Geometrie beeinflusst Zellphänotyps und Verbleib 10-15. Eine Anzahl von im Handel erhältlichen 3D Gerüste zur Verfügung stehen; Wir verwendeten ein hochporöses Polystyrol-Gerüst mit einer gut definierten und einheitlichen Architektur entworfen in eine 200 um dicke Membran, die ein 3D-Raum in die Zellen eindringen können und differen 16-18 liefert. Hierin 2D- und 3D-Differenzierungsassays werden zur axonprocess Auswuchs zu bewerten. Darüber hinaus beschreiben wir eine Methode, um die miRNA-Expression einer klinischen Grade HNSC Linie Profil zu miRNA Auswirkungen auf die Differenzierung weiter zu untersuchen. Die Methoden hier dargestellt sind auf die, die ursprünglich in 19 beschrieben basiert.

<table><tbody><tr><td>DMEM: F12</td><td>Invitrogen</td><td>21331-020</td><td>Für die RMM-Mediumvorbereitung</td></tr><tr><td>Humanalbuminlösung&nbsp;</td><td>Baxter Health Care Limited&nbsp;</td><td>1501052</td><td>Für RMM-Medium bei einer Endkonzentration von&nbsp; 0,03 %</td></tr><tr><td>Transferrin, humane rekombinante</td><td>Sigma</td><td>T8158</td><td>Für RMM-Medium bei einer Endkonzentration von&nbsp; 5 & Mikro; g/ml</td></tr><tr><td>Putrescine DiHCl&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P5780</td><td>Für RMM-Medien mit einer Endkonzentration von&nbsp; 16,2 &μ; g/ml</td></tr><tr><td>Insulin, humane rekombinante Insulin &nbsp;</td><td>Sigma</td><td>I9278</td><td>Für RMM-Medien bei einer Endkonzentration von&nbsp; 5 &μ; g/ml</td></tr><tr><td>Progesteron&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P6149</td><td>Für RMM-Medium bei einer Endkonzentration von&nbsp; 60 ng/ml</td></tr><tr><td>L-Glutamin&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>25030-24</td><td>Für RMM-Medium bei einer Endkonzentration von&nbsp; 2 mM</td></tr><tr><td>Natriumselenit&nbsp; &nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S9133</td><td>Für RMM-Medium, das in einer Endkonzentration von 40 ng/ml</td></tr><tr><td>bFGF&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-15</td><td>Zur Zugabe zu RMM-Medium, verwendet in einer Endkonzentration von 10 ng/ml</td></tr><tr><td>EGF&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-188</td><td>Zur Zugabe zu RMM-Medium, verwendet in einer Endkonzentration von 20 ng/ml</td></tr><tr><td>4-OHT</td><td>Sigma</td><td>H7904</td><td>Zur Zugabe zu RMM-Medium, verwendet in einer Endkonzentration von 100 nM Laminin</td></tr><tr><td></td><td>AMS Biotech</td><td>3400-010-10</td><td></td></tr><tr><td>TrypZean/EDTA</td><td>Lonza&nbsp;</td><td>BE02-034E</td><td></td></tr><tr><td>Wasser für die Bewässerung</td><td>Baxter Healthcare</td><td>UKF7114</td><td></td></tr><tr><td>Definierter Trypsin-Inhibitor (DTI) (Lagerung -20 Grad; C)</td><td>Invitrogen</td><td>R007-100</td><td></td></tr><tr><td>Alvetex 12-Well-Platte&nbsp;</td><td>Reinnervate Ltd</td><td>AVP002</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol&nbsp;</td><td>Merck&nbsp;</td><td>1.00986.1000</td><td></td></tr><tr><td>&beta; III Tubulin-Antikörper</td><td>Sigma</td><td>T8660</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst</td><td>Sigma</td><td>B2261</td><td></td></tr><tr><td>miRNeasy Mini-Kit</td><td>Qiagen&nbsp;</td><td></td><td></td>217004</tr><tr><td>RNase-freie DNase&nbsp;</td><td>Qiagen&nbsp;</td><td>79254</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma</td><td>C7559-5VL</td><td></td></tr><tr><td>miScript II RT Bausatz&nbsp;</td><td>Qiagen&nbsp;</td><td>218160</td><td></td></tr><tr><td>SYBR grünes PCR-Kit</td><td>Qiagen</td><td></td><td></td>218073</tr><tr><td>Zellentwicklung & Differenzierung miScript miRNA PCR Array</td><td>Qiagen/ SABiosciences</td><td>MIHS-103Z</td><td></td></tr><tr><td>Lightcycler 480 weiß 96 Platten</td><td>Roche</td><td>&nbsp; </td><td></td>4729692001</tr><tr><td>Lightcycler 480&nbsp; Siegelfolie</td><td>Roche</td><td>&nbsp; </td><td></td>4729757001</tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668-027</td><td></td></tr><tr><td>Vector NR4A3 miRNA 3' UTR-Zielklone&nbsp;</td><td>GenCopeia</td><td>HmiT019538-MT0</td><td></td></tr><tr><td>Vektor SOX5 miRNA 3' UTR-Zielklone&nbsp;</td><td>GeneCopeia</td><td>HmiT017632-MT01</td><td></td></tr><tr><td>Allstars Negativkontrolle siRNA AF 488 (Qiagen).</td><td>Qiagen&nbsp;</td><td>1027284</td><td>MiRNA-Transfektionskontrolle</td></tr><tr><td>Luc-Pair miR Luciferase Assay</td><td>GeneCopeia</td><td>LPFR-M010</td><td></td></tr><tr><td>Lightcycler 480&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td>Roche</tr><tr><td>GloMax 96 Mikroplatten-Luminometer&nbsp;</td><td>Promega</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

differenzierung einer menschen neural stem cell line auf dreidimensional kulturen, analyse der microrna und mutmaßlichen zielgene

Differentiation of a Human Neural Stem Cell Line on Three Dimensional Cultures, Analysis of MicroRNA and Putative Target Genes

Neurale Stammzellen (NSCs) sind in der Lage, Selbsterneuerung und Differenzierung in Neuronen, Astrozyten und Oligodendrozyten unter spezifischen lokalen Mikroumgebungen. Im hier präsentieren wir eine Reihe von für die dreidimensionale (3D) Differenzierung und miRNA-Analyse einer klonalen humanen neuralen Stammzellen (HNSC) Linie derzeit in klinischen Studien für Schlaganfall Behinderung (NCT01151124 und NCT02117635, Clinicaltrials.gov) verwendet, Methoden. HNSCs wurden aus ethischer genehmigten ersten Trimester menschlichen fetalen Kortex abgeleitet und Verwendung von retroviralen Integration einer einzigen Kopie der c-mycER TAM konstruieren bedingt verewigt. Wir beschreiben, wie Axon Prozess Auswuchs hNSCs auf 3D-Gerüsten und wie man damit verbundenen Änderungen der miRNA-Expression mit Hilfe der PCR-Array zu quantifizieren differenziert messen. Außerdem veranschaulichen wir Computeranalyse mit dem Ziel, die Auswahl miRNA mutmaßlichen Ziele. SOX5 und NR4A3 wurden als geeignet miRNA vermeintlichen Ziel deutlich ausgewählt identifiziert herunterregulierend miRNAs in differenzierten HNSC. MiRNA-Target-Validierung wurde am SOX5 und NR4A3 3&#39;UTRs von Dual-Reporter-Plasmid-Transfektion und Dual-Luciferase-Assay durchgeführt.

In Abbildung 1 ist die Untersuchung und Quantifizierung von HNSC Differenzierung auf 3D-Gerüsten im Vergleich zu herkömmlichen flachen Oberfläche Kulturen (2D) visualisiert und expressedas Axons Prozess Auswuchs Messungen. In Abbildung 2 ist representedthe Workflow und die Ergebnisse für die miRNA-Quantifizierung mit Stammzellen und Entwicklungswege konzentriert miRNA PCR-Array unterschiedliche Expression von miRNAs in 2D und 3D differenzierte hNSCs Vergleich zu undifferenzierten Kontrolle zu untersuchen. Nach miRNA vergleichende Analyse zwischen differenzierte und undifferenzierte hNSCs und Computeranalyse zur Zielvorhersage, SOX5 und NR4A3 (NOR1) wurden als vermeintliche Ziel-mRNAs identifiziert. Um die direkte Interaktion zwischen den miRNAs und deren vermeintlichen Ort auf der mRNA 3&#39;UTR verwendeten wir zwei im Handel erhältlichen Plasmiden, die entweder SOX5 oder NR4A3 3&#39;UTR-Sequenz eingefügt hinter der Glühwürmchen-Luciferase-Reportergens, studieren ein<html> nd in einem gemeinsamen Plasmid Renilla-Luciferase-Gen für die Normierung. Die repräsentativen Ergebnisse der 3 &#39;UTR Luciferaseaktivität Herunterregulierung ist in Abbildung 3 dargestellt. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/52410/52410fig1.jpg" /> Abb. 1: Die Differenzierung der hNSCs auf 3D-Gerüste, und die Bewertung von Axons Prozess es Auswuchs (A) Im Anschluss an Standard-ICC-Färbung für β3-Tubulin (grün) und Kerne mit Hoechst (blau) repräsentative Mikrogegengefärbt wurden erworben und Messung von Prozessen gab Axon mit Hilfe einer Bildanalyse-Software durchgeführt. (B) Diagramme die Berichterstattung über die Messung des Axons Prozess Auswuchs in 2D und 3D unterschieden hNSCs 1 (1W) oder 3 Wochen (3W) durchgeführt.com / files / ftp_upload / 52.410 / 52410fig1highres.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen. <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/52410/52410fig2.jpg" /> Abb. 2: Schematische Workflow von miRNA-Profiling in differenzierten hNSCs Gesamt-RNA, einschließlich miRNAs wurde von beiden differenzierten hNSCs auf 3D-Gerüsten und Standard-2D-Kulturen oder undifferenzierte Steuer extrahiert. 250 ng Gesamt-RNA wurden retro transkribiert mit einer Methode, die die selektive Umwandlung von reifen miRNAs in cDNA für miRNA Quantifizierung mit menschlichen Zelldifferenzierung und Entwicklung miScript miRNA PCR-Array ermöglicht. Die geo-Mittelwert SNORD61, SNORD68, SNORD72, SNORD95, SNORD96A und RNU6-2 wurde zur Datenanalyse auf der Basis der 2 -ΔΔct Methode verwendet. Wesentliche Veränderungen wurden als +/- 1,5 fache nach oben und unten Regelung auf eine sta definierttistically erheblichem Maße. Die Daten wurden mittels web-basierte Software verfügbar Die Ergebnisse sind als clustergram ausgedrückt analysiert. Geändert von 3 19. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52410/52410fig2highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/52410/52410fig3.jpg" /> Abbildung 3: Validierung von miRNA Ziel prognostiziert mRNA mit einem Dual-Luciferase-Assay-Bericht. (A) Vertreter Diagramm eines Dual-Luciferase-Reporter-Plasmid als Werkzeug benutzt, um 3&#39;-UTR-Sequenz als direktes Ziel einer miRNA validieren. (B) Vertreter mikroskopische Aufnahme, die Transfektionseffizienz. (C) &#160; Signale, ausgedrückt in relativen Luciferase-Aktivität, aus menschlichem 3 &amp; #39; UTR Reportern ofSOX5 und NR4A3 Gene signifikant niedergeschlagen in Gegenwart von hsa-miR-96 und hsa-miR-7 und 17 miRNA imitiert auf. Geändert von 5 19. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52410/52410fig3highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td></td><td colspan="2"> DIANALAB </td><td> PicTar </td><td> Targetscan </td></tr><tr><td> miRNA </td><td> Zielgens </td><td> Zielorte / Gene gefunden </td><td> Genauigkeit </td><td> Ergebnis </td><td> Aggregate P CT </td></tr><tr><td> hsa-miR-96 </td><td> SOX5 </td><td> 1214/763 </td><td> 1 </td><td> 6,74 </td> &lt;td&gt; 0,94 </td></tr><tr><td> hsa-miR-183 </td><td> DUSP10 </td><td> 302/190 </td><td> 0.72 </td><td> 4,75 </td><td> 0.85 </td></tr><tr><td> hsa-miR-302a </td><td> NR4A3 </td><td> 863/473 </td><td> 0.84 </td><td> 3.05 </td><td> NF </td></tr><tr><td> hsa-miR-182 </td><td> FOXN3 </td><td> 1358/794 </td><td> 0.94 </td><td> NF </td><td> 0.96 </td></tr><tr><td> hsa-miR-7 </td><td> NR4A3 </td><td> NF </td><td> NF </td><td> 1.61 </td><td> 0,17 </td></tr><tr><td> hsa-miR-7 </td><td> FOXN3 </td><td> 399/136 </td><td> 0,17 </td><td> NF </td><td> 0.88 </td></tr><tr><td> hsa-miR-20a </td><td> NR4A3 </td><td> 1650/841 </td><td> 0.85 </td><td> 5,87 </td><td> 0.63 </td></tr><tr><td><strong&gt; hsa-miR-20b </td><td> NR4A3 </td><td> 1955/973 </td><td> 0.9 </td><td> 5,87 </td><td> 0.63 </td></tr><tr><td> hsa-miR-17 </td><td> NR4A3 </td><td> 1928/961 </td><td> 0.9 </td><td> 5,38 </td><td> 0,63 + 0,37 </td></tr><tr><td> hsa-miR-20a </td><td> EIF4G3 </td><td> 1650/841 </td><td> 0.97 </td><td> NF </td><td> NF </td></tr><tr><td> hsa-miR-20b </td><td> EIF4G3 </td><td> 1955/973 </td><td> 0.94 </td><td> NF </td><td> NF </td></tr><tr><td> hsa-miR-17 </td><td> EIF4G3 </td><td> 1928/961 </td><td> 0.94 </td><td> NF </td><td> NF </td></tr></tbody></table> Tabelle 1: Liste der miRNA Ziel Vorhersage mRNAs. Vertreter Tabelle von miRNAs, Zielvorhersage Gene und Algorithmen-Analyse (vorherzusagenion / Partitur / Aggregat versehen mit Diana Lab, PicTar und Targetscan beziehungsweise). Geändert aus der Tabelle 3 19.

Mit der Absicht, Veränderungen in miRNAs auf differenzierten humanen neuralen Stammzellen (hNSCs) zu charakterisieren, beschreiben wir die hNSC-Differenzierung auf einem dreidimensionalen System, die Bewertung von Veränderungen in der microRNA-Expression durch miRNA-PCR-Arrays und computergestützte Analysen zur Vorhersage von miRNA-Zielen und deren Validierung durch duale Luciferase-Assays.

Differenzierung einer Menschen Neural Stem Cell Line auf Dreidimensional Kulturen, Analyse der MicroRNA und mutmaßlichen Zielgene

Neural stem cells (NSCs) are capable of self-renewal and differentiation into neurons, astrocytes and oligodendrocytes under specific local ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, die Differenzierung von Mikro-RNA, die Profilierung sowie die Ziel-mRNA-Validierung einer humanen neuralen Stammzelllinie zu untersuchen. Dies wird erreicht, indem humane neurale Stammzellen zunächst in einem dreidimensionalen Kultursystem kultiviert werden, um die Zelldifferenzierung zu induzieren. Der zweite Schritt besteht darin, die Differenzierung durch Messung des Axonprozesswachstums zu quantifizieren.Anschließend werden Veränderungen in der Mikro-RNA-Expression mittels Mikro-RNA-PCR-Array analysiert. Es folgt eine computergestützte Analyse ausgewählter differenziell exprimierter Mikro-RNAs, um eine Gruppe möglicher Ziel-mRNAs zu identifizieren. Schließlich werden die Ziel-mRNAs mittels Reporterplasmid, Transfektion und einem dualen Luciferase-Assay validiert.Die hier vorgestellte Methode kann daher helfen, zentrale Fragen im Bereich der neuralen Stammzellen zu beantworten, beispielsweise die Charakterisierung exprimierter microRNAs und ihrer Ziel-messenger-RNAs in humanen neuronalen Stammzellen während der Differenzierung. Obwohl diese Methode Einblicke in die Biologie neuraler Stammzellen ermöglicht, kann sie ebenso auf andere Stammzell-Systeme angewandt werden, wie mesenchymale Stammzellen, induzierte pluripotente Stammzellen oder andere Systeme, die eine Differenzierungsinduktion und molekulare Charakterisierung erfordern.Die visuelle Demonstration dieser Methode zerlegt die kritischen Schritte bei der Differenzierung einer humanen neurogenen Stammzelllinie sowie bei der Untersuchung des Mikro-RNA-Profils und der Validierung der Ziel-mRNA, wobei einen Teil des Verfahrens Lavania, eine Wissenschaftlerin aus meinem Labor, vorführen wird. Das gesamte Verfahren sollte in einem biologischen Sicherheitswerkbank unter Verwendung aseptischer Techniken durchgeführt werden. Rehydrieren Sie die Scaffolds, indem Sie sie jeder Vertiefung der AL VX 12 hinzufügen.Geben Sie zwei Milliliter 70 %igen Ethanol, hergestellt mit Wasser für die Spülung, in die Vertiefungen. Vermeiden Sie es, die Scaffolds zu berühren, indem Sie den 70 %igen Ethanol an der Wand jeder Vertiefung abgeben. Aspirieren Sie den 70 %igen Ethanol vorsichtig und waschen Sie die Scaffolds anschließend unverzüglich mit je zwei Milliliter D-M-E-M-F 12 pro Vertiefung für eine Minute.Wiederholen Sie den Waschvorgang zweimal und aspirieren Sie vorsichtig das D-M-E-M-F 12 nach dem letzten Waschschritt. Beschichten Sie die Scaffolds, indem Sie zwei Milliliter Laminin in D-M-E-M-F 12 zu jedem hinzu­geben. Inkubieren Sie die Platte bei 37 °C in einem mit 5 % Kohlendioxid befeuchteten Inkubator für mindestens zwei Stunden.Als Nächstes waschen Sie die Platte mit warmem D-M-E-M-F 12 und besiedeln jedes Scaffold mit etwa 500.000 humanen neuralen Stammzellen oder H nscs in einem Volumen von 150 Mikrolitern RMM-Medium mit Wachstumsfaktoren. Inkubieren Sie die Platte drei Stunden lang, um den Zellen Zeit zu geben, sich in den Scaffolds anzusiedeln. Geben Sie danach 3,5 Milliliter RMM pro Mulde hinzu, wobei darauf zu achten ist, dass die Zellen nicht aus den Scaffolds gespült werden.Die Platte sieben oder 21 Tage inkubieren. Nach einem Tag, der ersten Fütterung, das RMM-Medium wechseln und das Medium erneut zwei bis drei Tage nach der ersten Fütterung erneuern. Sieben und 21 Tage nach der 3D-Kultur von H nscs.Entfernen Sie das RMM-Medium und fixieren Sie die differenzierten Zellen mit 4 % Paraformaldehyd. Die fixierten Zellen werden anschließend mit einem primären Antikörper gegen Beta-Tubulin III gefärbt, der mit einem Fluorochrom-konjugierten sekundären Antikörper nachgewiesen wird. Die Zellkerne werden mit Hoescht kontragefärbt.Nehmen Sie repräsentative Bilder der gegen Beta-Tubulin-3 gefärbten Zellen auf. Speichern Sie die Bilder mithilfe eines Fluoreszenzmikroskops im TIFF- oder JPEG-Format. Die Messung des Axonfortsatzwachstums erfolgt mit dem Messwerkzeug der Image-Pro-Plus-7-Software.Öffnen Sie zunächst das Bild, wählen Sie die Messoption in der Symbolleiste und aktivieren Sie die Funktion „Spur“. Um die Spur zu beginnen, wählen Sie den Startpunkt am Axonfortsatz durch Klicken der Maustaste aus und verfolgen Sie die gesamte Länge des Axonfortsatzes. Klicken Sie mit der rechten Maustaste, um jede Spur abzuschließen. Messen Sie auf diese Weise alle Axonfortsätze innerhalb des Sichtfelds und geben Sie die Messungen in Pixeln oder Mikrometern an.Exportieren Sie Längenmessungen in ein Tabellenkalkulationsprogramm, um vergleichende und statistische Analysen an Proben durchzuführen und Veränderungen in der Mikro-RNA-Expression der dreidimensional kultivierten HSCs zu bewerten. Führen Sie zuerst die Mikro-RNA-Extraktion und die Mikro-RNA-CD-NA-Präparation wie im begleitenden Protokoll beschrieben durch. Text unmittelbar nachdem die Mikro-RNA-CD-NA erhalten wurde.Bereiten Sie die PCR-Bestandteilemischung für die Echtzeit-PCR in einem 15-Milliliter-Röhrchen vor. Geben Sie 1375 Mikroliter einer 2X-S-Y-B-R-Grün-Mastermix, 100 Mikroliter microRNA CD NA, 275 Mikroliter des universellen Primers und 1000 Mikroliter RNA-freies Wasser zu.Die PCR-Bestandteile werden in ein PCR-Lade-Reservoir gegeben. Entnehmen Sie die 96-Loch-PCR-Platte vorsichtig aus der versiegelten Tüte. Geben Sie mithilfe eines Mehrkanalpipettiersystems 25 Mikroliter der PCR-Bestandteile hinzu.Mischen Sie je einen Ansatz in jedes Loch des PCR-Arrays. Wechseln Sie die Pipettenspitzen nach jedem Pipettierschritt, um eine Kreuzkontamination zwischen den Löchern zu vermeiden. Die 96-Loch-Platte mit optischem Haftfolienverschluss versehen und eine Minute lang bei 1000 ×g bei Raumtemperatur zentrifugieren, um Blasen zu entfernen. Die Platte visuell überprüfen, um sicherzustellen, dass sich keine Blasen in den Löchern befinden.Die 96-Loch-PCR-Platte im Echtzeit-Cycler-Programm. Der Echtzeit-Cycler entsprechend. Anschließend werden die CT-Werte für alle Vertiefungen in eine leere Excel-Tabelle zur Datenanalyse des PCR-Arrays exportiert, wobei ein Algorithmus, der online verfügbar ist, PIC ktar, zur Identifizierung vorhergesagter mikro-RNA-Ziele verwendet wird.Klicken Sie auf, klicken Sie hier für die PIC KTAR-Vorhersage bei Wirbeltieren, um eine neue Seite in der PIC KTAR-Web-Schnittstelle zu öffnen. Wählen Sie die Art im Dropdown-Menü aus und geben Sie das gewünschte Mikro-RNA in das Feld Mikro-RNA-ID ein. Klicken Sie auf „Suche nach Zielstrukturen einer Mikro-RNA“.Eine Liste von Ziel-mRNAs, sortiert nach dem PIC-KTAR-Score, wird präsentiert. Die erhaltenen Rangfolgen werden anschließend verwendet, um eine vergleichende Tabelle von Mikro-RNAs zusammenzustellen. Ein duales Luciferase-Reporter-Plasmid dient als Werkzeug zur Validierung der Ziel-mRNAs; die Aktivitäten von Feuerfliegen- und Nierenluciferase werden 24 Stunden nach der Transfektion von Hela-Zellen gemessen.Stellen Sie die Arbeitslösung eins her, indem Sie 50 Mikroliter Substrat eins zu 10 Milliliter Lösung eins hinzufügen und gründlich mischen. Entfernen Sie das Zellwachstumsmedium aus jedem Brunnen der 24-Brunnen-Platte und geben Sie 300 Mikroliter der Arbeitslösung eins in jeden Brunnen. Übertragen Sie 100 Mikroliter des Inhalts jedes Brunnens der 24-Brunnen-Platte auf drei Brunnen einer 96-Brunnen-Platte. Warten Sie 10 Minuten und messen Sie anschließend die Aktivität der Feuerfly-Luciferase in einem Luminometer, das für die Lumineszenzmessung eingestellt ist.Bereiten Sie die Arbeitslösung zwei vor, indem Sie 50 µL Substrat zu zwei bis 10 mL Lösung zwei hinzufügen und gründlich mischen. Geben Sie 100 µL der Arbeitslösung zwei in jedes Loch der 96-Loch-Platte, die bereits 100 µL Arbeitslösung enthält. Warten Sie 10 Minuten und messen Sie anschließend die renale Luciferase-Aktivität.Anschließend wird das Verhältnis der Lumineszenz der Feuerfluchtluciferase zur renalen Luciferase berechnet. Repräsentative Mikroaufnahmen von H-NSC auf 3D-Gerüsten wurden nach der Immunfärbung für Beta-Tubulin III in grün und der Kerngegenfärbung mit Hoechst in blau angefertigt; die Messung der Axonprozesse erfolgte mithilfe einer Bildanalyse-Software. Ein Vergleich des Axonprozesswachstums zwischen H-NSC, die auf 3D-Gerüsten oder auf herkömmlichen flachen Oberflächen bzw. 2D-Kulturen gezüchtet wurden, zeigt, dass die auf 3D-Gerüsten differenzierten H-NSC nach einer oder drei Wochen ein stärkeres Axonprozesswachstum aufwiesen.Die computergestützte Analyse zur Zielvorhersage ergab die hier dargestellten Informationen, darunter eine Liste vorhergesagter Zielgene von Mikro-RNAs sowie deren Präzisionswerte und aggregierte Werte. SOX5 und NR4A3 wurden als putative Zielgene identifiziert. Ein duales Luciferase-Reporterassay wurde verwendet, um die Zielstrukturen der Mikro-RNAs zu validieren, wie hier gezeigt.Die relative Luciferase-Aktivität von menschlichen drei-prim-UTR-Reportern der Gene SOX five und NR four A three wurde in Gegenwart der angegebenen Mikro-RNAs signifikant herunterreguliert. Nachdem Sie dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man ihn in neuralen Stammzellen differenziert und die Expression von Mikro-RNAs sowie die Validierung von Ziel-Messenger-RNA untersucht.

differentiation-human-neural-stem-cell-line-on-three-dimensional

Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

Dieses Video zeigt die Entwicklung und Differenzierung menschlicher neuronaler Stammzellen innerhalb eines dreidimensionalen Gerüsts. Eine Lamininbeschichtung auf dem Gerüst fördert die Zelladhäsion, während ein wachstumsfaktorfreies neuronales Medium die Zelldifferenzierung in neurale Vorläuferzellen induziert, die ihre Prozesse innerhalb einer porösen Architektur in mehrere Richtungen ausdehnen und eine dreidimensionale Kultur...

Differenzierung menschlicher neuronaler Stammzellen in 3D-Kultur mit Hilfe eines porösen Gerüsts

Dieses Video zeigt die Differenzierung von humanen embryonalen Stammzellen (hESCs) direkt in neurale Vorläuferzellen, ohne dass Feeder-Zellen oder Zwischenschritte verwendet werden. Die selektive Hemmung des Signalwegs des knochenmorphogenetischen Proteins (BMP) und des transformierenden Wachstumsfaktor-beta (TGF-β) führt zur Differenzierung der hES-Zellen in neurale Vorläuferzellen (NPCs).

Differenzierung humaner embryonaler Stammzellen in neurale Vorläuferzellen

Dieses Video zeigt die Erzeugung von neuralen Vorläuferzellen aus nicht-transgenen und transgenen humanen pluripotenten Stammzellen (hPSCs). hPSCs werden unter Verwendung eines neuronalen Differenzierungsmediums zu neuralen Vorläuferzellen differenziert. Während die Differenzierung in nicht-transgenen Zellen mit kleinen Molekülen induziert wird, werden die transgenen hPSCs durch Zugabe eines Antibiotikums differenziert, das den Promotor für einen neuronalen differenzierungsspezifischen...

Differenzierung von nicht-transgenen und transgenen humanen pluripotenten Stammzellen in neurale Vorläuferzellen

In diesem Video wird ein schrittweises Protokoll für humane embryonale Stammzellen in neuronale Organoide demonstriert. Die Methode beinhaltet die Induktion der Bildung neuronaler Rosetten, gefolgt von einer kontrollierten Reifung und einer abschließenden Kultivierung auf einer hydrophoben Membran, um voll entwickelte neuronale Organoide zu erhalten.

Differenzierung und Reifung humaner embryonaler Stammzellen zu neuronalen Organoiden

Es wurde eine Methode entwickelt, um direkt abzuleiten humanen neuralen Stammzellen aus hämatopoetischen Vorläuferzellen aus peripherem Blut Zellen angereichert.

Direkte Induktion von humanen neuralen Stammzellen aus peripherem Blut hämatopoetischen Vorläuferzellen

Wir beschreiben eine Technik für die zur Erzeugung von zwei- oder dreidimensionalen Embryoidkörpern murinen embryonalen Stammzellen. Wir dann erklären, wie neuronale Differenzierung der Zellen Embryoidkörper von Retinsäure zu induzieren, und wie ihr Zustand der Differenzierung von Vorläuferzellmarker Immunofluoreszenz und Immunoblotting analysiert.

Analyse von Retinsäure-induzierte neuronale Differenzierung von embryonalen Stammzellen der Maus in zwei und drei-dimensionale Embryoidkörpern

Menschliche induzierte pluripotenten Stammzellen (hiPSCs) gelten als ein leistungsfähiges Werkzeug für die Arzneimittel- und Chemikalien-Screening und für die Entwicklung neuer in vitro- Modelle für die Toxizitätstests, einschließlich Neurotoxizität. Hier wird ein detailliertes Protokoll zur Differenzierung von hiPSCs in Neuronen und Glia beschrieben.

Protokoll zur Differenzierung von human induzierten pluripotenten Stammzellen in Mischkulturen von Neuronen und Glia für Neurotoxizitätstests

Hier wird ein Protokoll zur Erzeugung einer einzelzelligen Kultur menschlicher embryonaler Stammzellen und deren anschließende Differenzierung in neuronale Vorläuferzellen vorgestellt. Das Protokoll ist einfach, robust, skalierbar und eignet sich für Arzneimittelscreenings und anwendungen in der regenerativen Medizin.

Effiziente neuronale Differenzierung mit einzelzellischer Kultur menschlicher embryonaler Stammzellen

Wir beschreiben das Verfahren zur In-vitro-Differenzierung von embryonalen Stammzellen der Maus in neuronale Zellen mit der Hanging-Drop-Methode. Darüber hinaus führen wir eine umfassende phänotypische Analyse durch RT-qPCR, Immunfluoreszenz, RNA-seq und Durchflusszytometrie durch.

Differenzierung und Charakterisierung neuronaler Vorläufer und Neuronen aus embryonalen Stammzellen der Maus

Diese Studie berichtet über einen neuartigen Ansatz zur Messung mehrerer mitochondrialer Funktionsparameter basierend auf Durchflusszytometrie und Doppelfärbung mit zwei fluoreszierenden Reportern oder Antikörpern, um Veränderungen des mitochondrialen Volumens, des mitochondrialen Membranpotentials, des reaktiven Sauerstoffgehalts, der mitochondrialen Atmungskettenzusammensetzung und der mitochondrialen DNA zu erkennen.

Durchflusszytometrische Analyse multipler mitochondrialer Parameter in humaninduzierten pluripotenten Stammzellen und deren neuronalen und glialen Derivaten

Erfahren Sie die Differenzierung menschlicher neurale Stammzellen in 3D-Kulturen mit MicroRNA-Profiling und Validierung von Ziel-mRNAs durch PCR-Arrays und Dual-Luciferase-Assays.

Differenzierung einer Menschen Neural Stem Cell Line auf Dreidimensional Kulturen, Analyse der MicroRNA und mutmaßlichen Zielgene (Video) | JoVE Journal

Differenzierung einer Menschen Neural Stem Cell Line auf Dreidimensional Kulturen, Analyse der MicroRNA und mutmaßlichen Zielgene

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