Name: Passagierung humaner neuraler Stammzellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-08-22T00:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 16 s
Description: Lernen Sie die Passagierung humaner neuraler Stammzellen für die Neuroforschung mit Fibronektin-Beschichtung und Zellauflösungspuffer. Diese Methode verbessert die Reproduzierbarkeit in vitro.

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Die Autoren danken Dr. Philip H. Schwartz des National Human Neural Stem Cell Ressourcen an der Kinderklinik, Orange County Forschungsinstitut für die Bereitstellung hNSPCs und Einweisung in deren Kultivierung.

Hinweis: Für die routinemäßige Kultivierung unserer hNSPCs, ändern wir 50-100% der Medien jeden zweiten Tag und in der Regel Durchgang ihnen 01.02 einmal pro Woche. Die Kulturmedien enthält 20% BIT-9500, 1X Antibiotikum / Antimykotikum, und Wachstumsfaktoren (EGF, FGF und PDGF jeweils bei 40 ng / ml) in DMEM: F12 Basis-Medien. Vorbereiten des Coated Flask und Dissoziation der Zellen <ol><li> Um neue Flaschen für die passagiert Zellen, Mantel T25-Kolben mit 10 pg / ml humanem Fibronectin in EMEM für 4 Stunden oder über Nacht in einem 37 ° C Gewebekultur-Inkubator vorzubereiten. Kurz vor Passage der Zellen, entfernen Sie die Fibronektin-Lösung und spülen Sie die Flaschen mit PBS. </li><li> Übertragen Sie die alte &quot;konditioniert&quot; Medien aus den Zellen an die neuen Fibronektin-beschichteten Kolben (so dass die Hälfte der Endvolumen von Medien für jede Flasche die &quot;konditioniert&quot; Medien) passagiert werden. Diese Kultivierungsbedingungen helfen diese Zellen im undifferenzierten Zustand. </li><li> Sobald alle Medien aus den Zellen zu passagiert werden entfernt ist, waschen Sie die Zellen einmal mit PBS. Achten Sie darauf, nicht austrocknen der Zellen. </li><li> Add Zelldissoziation Buffer (CDB) direkt auf die Zellen (1,0-1,5 ml für eine T25 Flasche). Inkubieren Zellen in den Puffer für etwa 5 Minuten bei Raumtemperatur. Leichtes Antippen der Flasche wird zur Beschleunigung Zellablösung. </li></ol> Zentrifugieren, Resuspendieren und Plating Cells <ol><li> Add serumhaltigem Medium (DMEM: F12 mit 10% Hitze-inaktiviertes fötales Rinderserum) (Einsatz ~ 3X das Volumen der CDB) in den Kolben mit abgelösten Zellen. Entfernen Sie die Medien und die Zellen in ein 15 ml konischen Rohr. Mit einem kleinen Volumen von frischem Serum-haltigen Medien in den Kolben gespült und wieder Residualzellen. </li><li> Centrifuge die Medien und die Zellen bei 1000 rpm (~ 200xg) für 5 Minuten. </li><li> Absaugen des Serum-haltigen Medien und Zellen in frischem Kulturmedium, und Abpipettieren eine homogene Zellsuspension zu machen. </li><li> Übertragung der Hälfte der resuspendierten Zellen in jede neue Flasche für einen 1:2 aufgeteilt. Beachten Sie die neue Passage-Nummer auf der Flasche. </li></ol>

<ol><li>Flanagan, L. A., Rebaza, L. M., Derzic, S., Schwartz, P. H., Monuki, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+human+neural+precursor+cells+by+laminin+and+integrins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Res%22%5BJournal%5D)">Regulation of human neural precursor cells by laminin and integrins.</a> J. Neurosci. Res. 83, 845-856 (2006).</li>
<li>Nethercott, H. N., Maxwell, H., Schwartz, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+stem+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Stem+Cell+Manual%3A+A+Laboratory+Guide%22%5BJournal%5D)">Neural stem cell culture.</a> Human Stem Cell Manual: A Laboratory Guide. Loring, J. F., Wesselschmidt, R. W., Schwartz, P. H. , Elsevier/Cell Press. (2007).</li>
<li>Palmer, T. D., Schwartz, P. H., Taupin, P., Kaspar, B., Stein, S. A., Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+culture.+Progenitor+cells+from+human+brain+after+death%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cell culture. Progenitor cells from human brain after death.</a> Nature. 411, 42-43 (2001).</li>
<li>Schwartz, P. H., Bryant, P. J., Fuja, T. J., Su, H., O'Dowd, D. K., Klassen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+neural+progenitor+cells+from+post-mortem+human+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of neural progenitor cells from post-mortem human cortex.</a> J Neurosci Res. 74, 838-851 (2003).</li>
</ol>

Wir haben festgestellt, dass dieses Protokoll zuverlässig Kulturen hNSPCs bietet. Ein kritischer Faktor für unsere Zellen ist, dass sie als ziemlich dichte Kulturen gehalten werden und kann nicht bis zu dem Punkt, dass die Zellen spärlich sind passagiert werden müssen. In unseren Händen, wachsen spärlich Kulturen nur sehr langsam oder endgültig einzustellen Division. Aus diesem Grund haben wir in der Regel aufgeteilt unseren Kulturen 1:2 oder 1:3, wenn eine Kultur ist extrem dicht. Die Beschichtung der Oberfläche einer Kulturschale mit Fibr...

<table><tbody><tr><td>BIT-9500 (BSA, Insulin, Transferrin)</td><td>Reagenz</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>09500</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotikum-Antimykotikum</td><td>Reagenz</td><td>Invitrogen</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>DMEM:F12 (1X)</td><td>Reagenz</td><td>Invitrogen</td><td>11330-032</td><td></td></tr><tr><td>EMEM (1X)</td><td>Reagenz</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>MT-10-010-CV</td><td>Vertrieb durch Fisher unter der angegebenen Katalognummer</td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>Reagenz</td><td>Invitrogen</td><td>10437-028</td><td></td></tr><tr><td>FGF, humanes basisches rekombinantes Protein</td><td>Reagenz</td><td>PeproTech Inc</td><td>100-18B</td><td></td></tr><tr><td>PDGF-AB</td><td>Reagenz</td><td>PeproTech Inc</td><td>100-00AB</td><td></td></tr><tr><td>EGF, humanes rekombinantes Protein</td><td>Reagenz</td><td>BD Biosciences</td><td>CB40052</td><td>Vertrieb durch Fisher unter der angegebenen Katalognummer</td></tr><tr><td>Zellkulturgefäß, 25 cm²</td><td>Werkzeug</td><td>Corning</td><td>10-126-28</td><td>Vertrieb durch Fisher unter der angegebenen Katalognummer</td></tr><tr><td>Fibronectin, human, natürlich</td><td>Reagenz</td><td>BD Biosciences</td><td>CB40008A</td><td>Vertrieb durch Fisher unter der angegebenen Katalognummer</td></tr><tr><td>Humane neuronale Stamm-/Vorläuferzellen</td><td>Zellen</td><td>National Human Neural Stem Cell Resource</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Puffer zur Zelldissoziation</td><td>Reagenz</td><td>Invitrogen</td><td>13150-016</td><td></td></tr></tbody></table>

passagierung humaner neuraler stammzellen

Passaging Human Neural Stem Cells

Die Fähigkeit, menschliche neurale Stammzellen / Vorläuferzellen (hNSPCs) in vitro zu manipulieren bietet ein Mittel, um ihren Nutzen als Zell-Transplantationen für therapeutische Zwecke zu untersuchen sowie viele grundlegende Prozesse des menschlichen neuronalen Entwicklung und Pathologie zu erkunden. Dieses Protokoll stellt eine einfache Methode zur Kultivierung und Passagierung hNSPCs in der Hoffnung, die Standardisierung dieser Technik und die Reproduzierbarkeit erhöht der Forschung mit menschlichen Stammzellen. Die hNSPCs wir wurden von Leichen postnatalen Gehirn Kortex durch die National Human Neural Stem Cell Ressourcen isoliert und gezüchtet als adhärente Kulturen auf Flaschen mit Fibronektin (Palmer et al, 2001..; Schwartz et al, 2003) beschichtet. Wir Kultur unserer hNSPCs in DMEM: F12 serum-freien Medien mit EGF, FGF und PDGF ergänzt und Passage ihnen 01.02 etwa alle 7 Tage. Mit diesen Bedingungen halten die Mehrheit der Zellen in der Kultur eine bipolare Morphologie und auszudrücken Marker für undifferenzierte neurale Stammzellen (wie Nestin und Sox2).

Die Fähigkeit, menschliche neurale Stammzellen / Vorläuferzellen (hNSPCs) in vitro zu manipulieren, um ihre Eignung als Zelltransplantaten für therapeutische Zwecke zu untersuchen und für die menschliche Entwicklung des Nervensystems zu erforschen. Dieses Protokoll stellt eine Methode zur Kultivierung und Passagierung hNSPCs in der Hoffnung, steigende Reproduzierbarkeit der Forschung mit menschlichen Stammzellen.

Passagierung humaner neuraler Stammzellen

Die Fähigkeit, humane neurale Stamm- und Vorläuferzellen (hNSPCs) in vitro zu manipulieren, bietet eine Möglichkeit, deren Eignung als Zelltransplantate für ... zu untersuchen.

Hallo, ich bin Steve. Ich arbeite im Labor von Dr. Flanagan in der Abteilung für Pathologie an der UC Irvine. Heute zeige ich Ihnen, wie man humane neuronale Vorläuferzellen aufspaltet.Diese Technik beinhaltet das Beschichten eines neuen Kolbens mit einer Lösung aus humanem Fibronectin, das Ablösen der Zellen mit einem Zelldissoziationspuffer, anschließendes Neutralisieren des Zelldissoziationspuffers mit einer 10 %igen Serumlösung, Zentrifugation der Zellsuspension und Wiederaufschlämmen der Zellen in frischem Medium sowie das Überführen der Zellsuspension in einen neuen Kolben. In unserem Labor kultivieren wir humane neuronale Vorläuferzellen, indem wir alle zwei Tage die Hälfte des Kulturmediums wechseln, und wir passagieren sie etwa einmal pro Woche im Verhältnis von eins zu zwei. Wenn ich Zellen passagiere, zähle ich sie gegebenenfalls, wenn ich sie für ein Immunchemie-Experiment benötige oder wenn ich eine Transfektion mit einem nukleären Effektor durchführen möchte.Es ist wichtig, einen Zelldissoziationspuffer bei der Verpackung von Zellen zu verwenden, da dieser im Gegensatz zu Trypsin nicht enzymatisch wirkt und viel schonender für die Zellen ist. Hallo, wir befinden uns j

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Die Einführung eines Gens in eine Zelle ist eine leistungsfähige Methode für die Aufklärung ihrer Funktion in vivo. Dieses Protokoll beschreibt eine effiziente Methode zur Transfektion von einer Kultur des menschlichen neuronalen Stammzellen / Vorläuferzellen (hNSPCs) mit Hilfe der Elektroporation Nucleofector Apparat Amaxa gemacht.

Transfektion humaner neuraler Stammzellen mit dem Amaxa Nucleofector

Die Kenntnis der genauen Anzahl der lebensfähigen Zellen ist für viele Gewebekultur Manipulationen erforderlich. Dieses Protokoll beschreibt, wie man zwischen lebenden und toten Zellen zu unterscheiden und zu quantifizieren Zellen unter Verwendung eines Hämozytometers. Obwohl es das Zählen menschliche neurale Stammzellen / Vorläuferzellen (hNSPCs) beschreibt, kann es für andere Zelltypen verwendet werden.

Counting Nervenstammzellen

Neurale Stammzellen wurden aus dem Hippocampus von erwachsenen, nicht überwinternde einjährige Arctic Erdhörnchen (AGS) aufgestellt. Diese neuralen Stammzellen können durch zahlreiche Passagen erweitert werden, differenziert und gepflegt wie ein fast 50:50 Neuron zu Gliazellen Kultur.

Wachstum und Differenzierung von adulten Hippocampus Arctic Ground Squirrel Neural Stem Cells

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Hirntumor-Patienten routinemäßig durchlaufen kranialen Strahlentherapie, und während von Vorteil, diese Behandlung führt oft lähmenden kognitive Dysfunktion. Dieser ernste ungelöste Problem hat derzeit keine klinischen Inanspruchnahme und getrieben hat unsere Anstrengungen zur Stammzell-basierten Therapien für die Verwertung von Strahlung induzierte kognitive dekrementiert zu entwickeln.

Stem Cell Transplantation Strategien für die Wiederherstellung der kognitiven Dysfunktion von Cranial Strahlentherapie verursachten Schäden

Dieses Video demonstriert die Methode zur Unterscheidung menschlicher neuraler Stammzellen aus Neurosphären in neuronale und Astrozyten-Vorläuferzellen durch enzymatische Behandlung und Kultivierung in einem wachstumsfaktorreichen Medium, was schließlich zur Reifung zu spezialisierten Vorläuferzellen führt.

Differenzierung humaner neuraler Stammzellen in neurale und Astrozyten-Vorläuferzellen

Neuronale Stammzellen aus dem erwachsenen Gehirn geerntet steigen in Anwendungen, die von der Grundlagenforschung der Entwicklung des Nervensystems zu erforschen mögliche klinische Anwendungen in der regenerativen Medizin eingesetzt. Dies macht eine strenge Kontrolle bei der Isolierung und Kultivierungsbedingungen verwendet werden, um diese Zellen entscheidend für experimentelle Ergebnisse klingen wachsen.

Wachsende neuronale Stammzellen aus konventionellen und Nonconventional Regionen der Volks Nagetier Gehirn

Dieses Protokoll beschreibt einen neuartigen mechanischen Schneideverfahren, das die Erweiterung der sphärischen neuralen Stamm-und Vorläuferzellaggregate ohne Dissoziation zu einer Einzelzellsuspension ermöglicht. Die Aufrechterhaltung Zell / Zell-Kontakt ermöglicht eine schnelle und stabile Wachstum seit über 40 Passagen.

Ein cGMP-Verfahren zur Erweiterung anwendbar Aggregate von humanen neuralen Stamm-und Vorläuferzellen, abgeleitet von pluripotenten Stammzellen oder fetalen Hirngewebe

Es wurde eine Methode entwickelt, um direkt abzuleiten humanen neuralen Stammzellen aus hämatopoetischen Vorläuferzellen aus peripherem Blut Zellen angereichert.

Direkte Induktion von humanen neuralen Stammzellen aus peripherem Blut hämatopoetischen Vorläuferzellen

Mit der Absicht, Veränderungen in miRNAs auf differenzierten humanen neuralen Stammzellen (hNSCs) zu charakterisieren, beschreiben wir die hNSC-Differenzierung auf einem dreidimensionalen System, die Bewertung von Veränderungen in der microRNA-Expression durch miRNA-PCR-Arrays und computergestützte Analysen zur Vorhersage von miRNA-Zielen und deren Validierung durch duale Luciferase-Assays.

Differenzierung einer Menschen Neural Stem Cell Line auf Dreidimensional Kulturen, Analyse der MicroRNA und mutmaßlichen Zielgene

Das Rückenmark eines adulten Säugetieres enthält neurale Stamm-/Vorläuferzellen (NSPCs), die in Kultur isoliert und erweitert werden können. Dieses Protokoll beschreibt die Entnahme, Isolierung, Kultivierung und Passage von NSPCs, die aus der periventrikulären Region des adulten Rückenmarks von der Ratte und von menschlichen Organtransplantatspendern erzeugt wurden.

Isolierung von Neural Stamm- / Vorläuferzellen aus dem Periventrikuläre Region der erwachsenen Ratte und Human Spinal Cord

Lernen Sie die Passagierung humaner neuraler Stammzellen für die Neuroforschung mit Fibronektin-Beschichtung und Zellauflösungspuffer. Diese Methode verbessert die Reproduzierbarkeit in vitro.

Passagierung humaner neuraler Stammzellen

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