Passagierung humaner neuraler Stammzellen

Hallo, ich bin Steve. Ich arbeite im Labor von Dr. Flanagan in der Abteilung für Pathologie an der UC, Irvine. Heute zeige ich Ihnen, wie man menschliche neuronale Vorläuferzellen spaltet.

Diese Technik beinhaltet die Kodierung eines neuen Kolbens mit einer Lösung von humanem Fibronektin, das Abheben der Zellen mit einem Zelldissoziationspuffer, dann das Neutralisieren des Dissoziationspuffers der Zellen mit einer 10%igen Serumlösung, das Zentrifusionieren der Zellsuspension und der Reanimation, das Suspendieren der Zellen in einem frischen, medium und das Übertragen der Zellsuspension in einen neuen Kolben. In unserem Labor kultivieren wir menschliche neuronale Vorläuferzellen, indem wir jeden zweiten Tag die Hälfte ihrer Medien wechseln, und wir passieren sie etwa einmal pro Woche, indem wir eine in zwei teilen. Wenn ich Zellen passiere, kann ich sie zählen, wenn ich sie gegen ein immunchemisches Experiment eintauschen möchte oder wenn ich eine Transfektion mit einem nuklearen Effektor durchführen möchte.

Es ist wichtig, beim Verpacken von Zellen einen Zelldissoziationspuffer zu verwenden, da er erstens im Gegensatz zu Trypsin nicht enzymatisch ist und viel schonender für die Zellen ist. Hallo, wir sind im Gewebekulturraum Nun, und bevor ich Ihnen zeige, wie ein konfluenter Kolben mit menschlichen Vorläuferzellen aussieht, werde ich zuerst die Gewebekultur vorbereiten. Zuerst schalte ich das UV-Licht aus und das Licht und den Luftstrom ein.

Als nächstes desinfiziere ich die Haube mit 70 % Ethanol, indem ich ein Papiertuch besprühe und die Haube abwische. Es ist wichtig, ein Papiertuch mit 70 % Ethanol und nicht direkt mit der Innenseite der Dunstabzugshaube zu besprühen, da das Besprühen der Dunstabzugshaube mit 70 % Ethanol den HEPA-Filter beschädigen kann, was sehr teuer ist. Als nächstes werde ich alle Reagenzien und Instrumente besprühen.

Und zum Schluss werde ich die Vakuumschläuche besprühen, und schon sind wir fertig. Werfen wir einen Blick auf diese Zellen. Diese Zellen sehen also zu etwa 80% konfluent aus.

Dabei handelt es sich um humane neurale Vorläuferzellen, die aus menschlichen Föten isoliert wurden und die wir in T-25-Kolben züchten. Wir teilen sie etwa jede Woche auf, ein bis zwei. Ich bin jetzt bereit, meine Zellen zu passieren.

Und zuerst bringe ich einen neuen T 25 Kolben mit, den ich vier Stunden lang mit humanem Fibronektin von BD biosciences beschichtet habe. Also entfernte ich die Fibronektinlösung. Ich werde diesen Kolben mit BBS spülen, bevor ich die Zellen in den Kolben beauftrage.

Und jetzt hole ich die Zellen aus dem 37-Grad-Inkubator. Da sind sie. Jetzt werde ich die PBS-Waschlösung aus dem neuen Kolben entfernen, der mit humanem Fibronektin beschichtet wurde.

Und ich werde zwei Milliliter altes konditioniertes Medium in den neuen Kolben geben. Jetzt muss ich also meine Zellen mit PBS spülen, bevor ich ihn von der Oberfläche nehmen kann. Zuerst entferne ich also das restliche Medium und füge sofort etwa zwei mil PBS hinzu, ohne dass die Zellen austrocknen.

Ich werde etwa zwei Minuten warten, bevor ich PBS entferne und Dissoziationspuffer in den Verkauf lege, um die Verkäufe von der Oberfläche der Flak zu nehmen. Jetzt werde ich PBS entfernen, und wieder werde ich versuchen, sofort Zelldissoziationspuffer hinzuzufügen, damit die Zellen nicht austrocknen. Also füge ich 1,5 mil Zelldissoziationspuffer hinzu.

Und im Gegensatz zu PBS werde ich es direkt auf die Zellen geben und versuchen, so viel Oberfläche wie möglich abzudecken. Also bewege ich den Kolben von einer Seite zur anderen, während ich diesen Puffer langsam auf die Zellen gebe. Und ich werde jetzt etwa fünf Minuten warten, bis sich die Zellen von der Oberfläche lösen.

Und ich werde den Kolben bei Raumtemperatur in der Haube lassen. Wie Sie hier sehen können, beginnen sich die Zellen zuerst aufzurunden und dann beginnen sie, sich von der Oberfläche zu lösen, und Sie können tatsächlich einige Zellen sehen, einige Zellen schwimmen bereits. Und wenn Sie den Kolben weit an der Seite antippen, hilft das, dass sie sich lösen.

Es sind also fünf Minuten vergangen, und wie Sie sehen können, ist die Lösung sehr dicht geworden mit Zellen, die sich von der Oberfläche gelöst haben. Und jetzt werde ich die Wirkung des Zelldissoziationspuffers neutralisieren, indem ich 4,5 mil Serum, das Medium enthält, hinzufüge. Ich werde also 10 % hitzeinaktiviertes fötales Rinderserum in D-M-E-M-F 12-Medien verwenden und es direkt auf die Oberfläche des Kolbens geben, um sicherzustellen, dass keine Zellen mehr anhaften.

Und ich werde vorsichtig auf und ab pipettieren, um alle verbleibenden Zellen zu entfernen. Und dann übertrage ich die Zelllösung in ein konisches 15-mil-Röhrchen. Und ich werde es eine Minute lang mit tausend Umdrehungen pro Minute drehen.

Die Zellen sind also fertig mit dem Spinnen und wir haben hier eine schöne Zellpalette. Ich werde das Serummedium sehr, sehr vorsichtig entfernen, ohne zu versuchen, die Palette zu stören. Und dann werde ich die Palette in vier mil des Mediums wieder aufhängen.

Also werde ich versuchen, das Pellet so zu resuspendieren, dass es keine Zellklumpen mehr gibt, so dass die Lösung homogen wird und keine Klumpen enthält. Und da ich eine Eins-zu-Zwei-Aufteilung durchführe, werde ich zwei der vier Mühlen nehmen und sie in den neuen Kolben übertragen, der bereits zwei mil des Zustandsmediums enthält. Und zum Schluss beschrifte ich den Kolben mit dem Zelltyp, der Durchgangsnummer und dem Datum.

Dies ist ein Blick auf die Zellen, die wir vor einer halben Stunde passiert haben. Und wie Sie sehen können, haben sie, die meisten von ihnen, an der Oberfläche befestigt und begonnen, Prozesse auszusenden. Das ist alles, Leute.

Und jetzt bin ich bereit zu zählen.