Die Analyse der Funktion von kleinen GTPasen durch Mikroinjektion von Plasmiden in polarisierten Epithelzellen

Dieses Verfahren untersucht die Auswirkungen kleiner GTP-ACEs auf den Transport polarisierter Membranen. Zuerst werden DNA-Plasmide, die für das kleine GTP ACE und die Reporterproteine kodieren, in Zellkerne polarisierter Zellen injiziert. Exprimieren Sie dann die DNA bei Temperaturen, die die Reporterproteine im endoplasmatischen Retikulum oder im TGN zum Stillstand bringen, während sich das kleine GTPA im Zytosol ansammelt, und jagen Sie das Reporterprotein in Gegenwart von Cycloheide an die Zelloberfläche, um eine weitere Proteinsynthese zu verhindern.

Markieren Sie schließlich das Reporterprotein an der Zelloberfläche für die Immunfluoreszenzanalyse. Die Ergebnisse dieses Assays ermöglichen die Visualisierung der Änderung der Oberflächenlokalisation durch konfokale Mikroskopie. Der Hauptvorteil dieser Technik bestehender Methoden wie trans transfect besteht darin, dass während der kurzen Zeiten der Überexpression, die mit der Mikroinjektion erreicht werden, die sekundären Effekte minimal sind, was es uns ermöglicht, die primären Effekte der interessierenden Proteine zu untersuchen.

Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im Bereich der Zellpolarität zu beantworten, z. B. wie kleine gtpa den Transport polarisierter Membranen regulieren. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da die einzelnen Schritte, die für eine erfolgreiche Mikroinjektion erforderlich sind, ohne visuelle Hilfe nur schwer zu erklären sind: Isolieren Sie endotoxinfreie Plasma-DNA mit dem Endotoxin-freien Maxi-Vorbereitungskit von Sigma Aldrich gemäß dem Protokoll des Herstellers. Verwenden Sie für dieses Experiment drei klare 12-Millimeter-Transwell-Filter mit einer Porengröße von 0,4 Mikrometern, um sie zu kultivieren.

Die Zellen setzen viermal 10 der fünften MDCK-Zellen auf jeden Filter. Untersuchen Sie die Kultur nach zwei Tagen unter einem Mikroskop, um sicherzustellen, dass die Zellen in einer geschlossenen Monoschicht wachsen. Für Mikroinjektionen.

Bereiten Sie am Tag der Mikroinjektion 360 x 15 Millimeter große Platten mit fünf Litern MM-Wachstumsmedien plus 15 Millimeter Heis vor und legen Sie sie in einen 39 Grad Celsius heißen Inkubator. Bereiten Sie außerdem drei 12-Well-Platten mit einem Milliliter MEM-Wachstumsmedium plus 50 Millimolar His und 0,1 Milligramm pro Milliliter Cycloheximid vor und geben Sie sie in einen 31 Grad Celsius heißen Inkubator. Schalten Sie das Mikroinjektionsmikroskop ein, das wie dieses inverse Mikroskop mit beheizten 10 x und 32 x Objektiven und einem Einor-Femto-Jet aufgebaut ist.

Stellen Sie die beheizte Stufe auf 39 Grad Celsius ein. Öffnen Sie auch die Zuführung des Stickstoffgastanks zum Lufttisch. Verdünnen Sie nun die DNA mit gefiltertem Wasser auf eine Endkonzentration von 0,2 Milligramm pro Milliliter.

Anschließend wird die DNA 30 Minuten lang in einer Einor-Mikrozentrifuge bei 13.000 U/min geschleudert. Entfernen Sie den oberen Teil und legen Sie ihn in eine neue Tube. Bereiten Sie anschließend die MDCK-Zellen vor, indem Sie mit der chirurgischen Klinge den ersten Filter aus der Kulturschale nehmen, den Filter aus dem Filterhalter ausschneiden und in die vorbereitete 60 x 15 Millimeter große Platte mit fünf Millilitern 39 Grad Celsius erwärmtem MEM-Wachstumsmedium plus 50 Millimolar heis legen.

Um den Filter in der Kulturplatte zu beschweren, platzieren Sie die chirurgische Klinge in der Mitte des Filters und schieben Sie die Kulturplatte dann auf den beheizten Tisch des Mikroskops. Laden Sie zwei bis drei Mikroliter der verdünnten DNA in eine Mikroinjektionsnadel. Drehen Sie die Schutzhülle der Nadel und lassen Sie sie auf den Boden fallen.

Um die Nadel in den Halter zu positionieren, drücken Sie die Menütaste der Injektion und stellen Sie sicher, dass das Ventil geschlossen ist. Schrauben Sie die Nadel in ihre Halterung. Achten Sie darauf, die Nadel nicht zu fest einzuschrauben.

Da dies zu einem Bruch führen kann, drücken Sie die Menütaste erneut. Der aufgebrachte Ausgleichsdruck verhindert also, dass das Medium während des Mikroinjektionsvorgangs in die Nadel gesaugt wird. Tippen Sie abschließend auf den Joystick, um gespeicherte Referenzfahrten zu löschen und die Nadel auf die Zellen abzusenken.

Verwenden Sie das 10 x Objektiv und bringen Sie die Nadel in den Lichtstrahl über der Flüssigkeit. Konzentrieren Sie sich nun auf die Zellen. Fokussieren Sie wieder nach oben, indem Sie das Fokusrad um 180 Grad nach oben drehen und die Nadel finden.

Bewegen Sie die Nadel langsam in den Fokus. Bringen Sie es dann wieder unscharf. Wir arbeiten daran, die Zellen wieder in den Fokus zu rücken.

Bringen Sie die Nadel wieder in den Fokus. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis die Nadel die Oberfläche des Mediums berührt, woraufhin ein Halo zu sehen ist. Erreichen Sie weiterhin den Punkt, an dem die Zellen scharf sind, die Nadel jedoch immer noch unscharf aus der Fokusebene heraus ist.

Wechsle nun zum 32 x Ziel und finde die Kurseinstellungen. Stellen Sie die Z-Grenze ein, indem Sie die apikale Membran mit der Nadelspitze berühren und etwa 10 Mikrometer subtrahieren. Da die Kerne etwa 10 Mikrometer unter der apikalen Membran liegen.

Bringen Sie nun die Nadel so schnell wie möglich ein paar Mikrometer aus der Fokusebene heraus. Zielen Sie mit der Nadel über dem Kern und drücken Sie kurz die Injektionstaste des Joysticks. Beginnen Sie bei 95 PSI, um den richtigen Einspritzdruck zu finden.

Ist der Druck zu hoch, explodieren die Zellen. Wenn der Druck zu niedrig ist, bleibt ein weißer Punkt bestehen, aber sonst passiert nichts. Führen Sie eine erfolgreiche Injektion mit einem Phasenwechsel ohne Änderung der Zellgröße durch.

Injizieren Sie 100 bis 500 Zellen in das Loch der chirurgischen Klinge, das auf den Zellen liegt. Legen Sie dann die Zellen mit der Kulturschale und der chirurgischen Klinge in einen 39 Grad Celsius heißen Inkubator und inkubieren Sie zwei Stunden lang. Zum Schluss werden die Zellen in die vorbereitete 12-Well-Platte von einem Milliliter, MEM plus 50 Millimolar 0,1 Milligramm pro Milliliter, Cycloheide überführt und zwei Stunden bei 31 Grad Celsius inkubiert.

Um ein Ausbleichen des exprimierten GFP-Signals zu vermeiden, schützen Sie die Proben vor Licht, indem Sie sie bei allen nachfolgenden Verfahren zur Oberflächenfärbung mit Aluminiumfolie abdecken. Legen Sie die Zellen in eine Kulturschale auf eine Metallplatte auf Eis und waschen Sie sie. Sobald Sie mit eiskaltem PBS plus versorgt sind, positionieren Sie ein sauberes Stück Paraform auf der Metallplatte auf Eis pipettieren Sie 30 Mikroliter eines Antikörpers, der die Ektodomäne des interessierenden Proteins erkennt.

Setzen Sie nun den Filter mit den Zellen kopfüber auf den Tropfen und geben Sie einige Tropfen Antikörper auf die Rückseite des Filters. Eine Stunde auf Eis inkubieren. Waschen Sie die Zellen dreimal mit eiskaltem PBS plus plus und fixieren Sie sie mit 3%Paraformaldehyd für 15 Minuten bei Raumtemperatur.

Waschen Sie die Zellen einmal mit PBS plus plus und äquilibrieren Sie fünf Minuten lang in PBS plus plus. Inkubieren Sie nun die Zellen in blockierendem permeablem Puffer. Eine Stunde lang bei Raumtemperatur inkubieren, Primärantikörper von eins zu 200 in BPB verdünnen, um die exprimierte RAB GTP ACE-Zentrifuge 10 Minuten lang nachzuweisen. Bei 13.000 U/min pipettieren, 30 Mikroliter der Antikörperlösung auf einen sauberen Parameter geben und in eine Nasskammer geben.

Legen Sie die Zellen kopfüber auf den Filter auf die Antikörpertropfen und inkubieren Sie sie eine Stunde lang. Platzieren Sie die Zellen bei Raumtemperatur mit der rechten Seite nach oben in eine 12. Nach der Inkubation mit geeigneten Sekundärantikörpern, einschließlich eines Waschschritts, fünfmal über 30 Minuten mit BPB bei Raumtemperatur anrichten und waschen.

Tauchen Sie die Zellen auf dem Filter dreimal in entionisiertes Wasser und legen Sie sie mit der rechten Seite nach oben auf Mikroobjektträger mit 10 Mikrolitern Halterung. Platzieren Sie ein 18 x 18 Millimeter großes, mikroabgedecktes Glas darauf, und drücken Sie mit einem Kosmetiktuch vorsichtig auf die Zellen. Zum Schluss versiegeln Sie mit Nagellack in der Scheininjektion nur des Plasmids, das für V-S-V-G-T-S-O 45 GFP kodiert. Das Protein wird auf die basolaterale Oberfläche gut polarisierter MDCK-Zellen abgegeben, wie anhand der Färbung der roten Oberfläche in Zellen beurteilt wird, die nicht gut polarisiert sind.

Ein Teil des GFP-Fusionsproteins wird an die apikale Membran abgegeben. Wenn Kontrollproben so aussehen, kann den Daten nicht vertraut werden, und das Experiment sollte mit besser polarisierten Zellen wiederholt werden. Beachten Sie, dass nicht die gesamte exprimierte GFP-Fusion während der Jagd von 31 Grad Celsius an die basolaterale Membran abgegeben wird, wie das umfangreiche intrazelluläre grüne Signal für das Gesamtprotein zeigt. Sobald diese Technik gemeistert ist, sollte sie etwa 10 bis 12 Stunden nach ihrer Entwicklung dauern.

Diese Technik ebnete Forschern auf dem Gebiet des Membrantransports den Weg, um regulatorische Proteine in polarisierten Epithelzellen zu erforschen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Proteine in polarisierten Epithelzellen mit Hilfe der Mikroinjektionstechnik exprimiert werden.