Name: Die Analyse der Funktion von kleinen GTPasen durch Mikroinjektion von Plasmiden in polarisierten Epithelzellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-31T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 38 s
Description: Lernen Sie die Mikroinjektion von Plasmiden zur Analyse kleiner GTPasen in polarisierten Epithelzellen. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung primärer Proteineffekte mit minimalen Sekundäreffekten.

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Diese Arbeit wurde durch ein Stipendium der National Institutes of Health (GM070736) zu H. Fölsch finanziert. SF Ang wurde von einem A * STAR Graduate Scholarship Award unterstützt, und RS Kang wurde von der Cellular and Molecular Basis of Disease Training Program (GM8061) unterstützt

1. Isolierung von Plasmid-DNA <ol><li> Verwenden Sie einen Sigma-Aldrich Endotoxin-freie Maxiprep Kit Endotoxin freie DNA nach dem Protokoll des Herstellers vorzubereiten. Dieses Kit arbeitet für uns, denn es entfernt zuverlässig alle Endotoxinen aus DNA-Präparationen. Endotoxine, die mit der DNA in den Zellkern gespritzt wird zum Zelltod führen. </li><li> 100 l Phenol / chlorofom / Isoamylalkohol (25:24:1), um die isolierten DNA-, Vortex-und Spin für 1 min bei 13.000 rpm in einer Eppendorf Mikrozentrifuge. Übertragen Sie die obere wässrige Phase in ein neues Röhrchen und 100 ul Chloroform / Isoamylalkohol (24:1), Vortex-und Spin wie oben. Übertragen Sie die obere wässrige Phase mit der DNA in ein neues Röhrchen. Dieser Schritt ist notwendig, um ein Protein aus der DNA, die aus der Mikroinjektion Verstopfen der Nadel verhindert zu entfernen. </li><li> Fällung der DNA durch Zugabe von Na-Acetat (pH 6,0) auf eine Endkonzentration von 300 mm und 2 x Vol. 100% Ethanol. Inkubation bei -20 ° C über Nacht. Spin DNA für 20 min bei 13.000 rpm in einer Eppendorf Mikrozentrifuge, einmal waschen mit 70% Ethanol und resuspendieren in 300 ul Endotoxin-freiem Wasser (Sigma-Aldrich). </li><li> Bestimmen DNA-Konzentration. Ein typisches DNA-Konzentration reicht von 1 bis 5 ug / ul. </li></ol> 2. Kultur von MDCK-Zellen <ol><li> Split MDCK-Zellen. Zählen von Zellen und Saatgut 4 X 10 5 Zellen auf klare 12-mm Transwell-Filter (0,4 um Porengröße, Corning Costar, 3460). Für ein Experiment mit einem Mock-Einspritz-und zwei verschiedene mutierte Rab-Proteine ​​müssen Sie Samen drei Filter. </li><li> Kultur MDCK-Zellen in MEM-Medium mit 2 mM L-Glutamin, 0,1 mg / ml Penicillin / Streptomycin und 7% (vol / vol) fötales Rinderserum (= MEM Nährmedien) bei 37 ° C und 5% CO 2. </li><li> Ändern Medien in der basolateralen Kammer jeden Tag. Dies hilft bei der Polarisation Prozess, weil es die Situation der Epithelzellen in Tiere nachahmt. </li><li> 2 Tage post-Seeding überprüfen in einem Mikroskop, ob die Zellen werden in einer geschlossenen Monolage wachsen. Wenn Sie nicht erkennen kann keine Löcher in die Monoschicht, führen Sie das Experiment an Tag 3. Wenn es noch Löcher, führen das Experiment an Tag 4. </li></ol> 3. Mikroinjektion Verfahren und Post-Injektion Inkubationen <ol><li> Am Tag der Vorbereitung des Experiments 5 ml MEM Wachstum Medien plus 50 mM HEPES in einer 60 x 15 mm-Platte für jeden Filter und in einen 39 ° C Inkubator. Darüber hinaus, bis eine Vertiefung einer 12-well-Platte mit 1 ml MEM Wachstum Medien plus 50 mM HEPES und 0,1 mg / ml Cycloheximid pro Filter, und in einen 31 ° C Inkubator gesetzt. </li><li> Schalten Sie Ihren Mikroinjektion Mikroskop und setzen Sie den Heiztisch bis 39 ° C. Wir verwenden ein inverses Mikroskop (Axiovert 200, Carl Zeiss MicroImaging, Inc.) mit einer beheizten Bühne, 10X und 32X Ziele und ein Eppendorf FemtoJet (InjectMan NI2). Schließlich, öffnen Sie das Stickstoff-Gas-Tank, der Luft-Tabelle liefert mit Stickstoff. </li><li> Verdünnen DNA mit gefiltertem Wasser (benutzen 0,2 um-Filter), um eine endgültige Konzentration von 0,2 mg / ml in einem Gesamtvolumen von 10 bis 100 ul. Anschließend Spin DNA in Eppendorf Mikrozentrifuge bei 13.000 rpm für 30 min. Entfernen oberen Teil und in einen neuen Schlauch. Dieser Schritt stellt sicher, dass, wenn Sie Ihre verdünnt DNA Last in die Mikroinjektionsnadel können Sie genau load "clean" DNA. Ihre DNA ist nun bereit für die Mikroinjektion. </li><li> Bereiten Sie Ihre Zellen, indem sie den ersten Filter aus der Kulturschale. Mit einem Skalpell (Feather Surgical Blade, Edelstahl, Nr. 11), den Filter aus dem Filterhalter und Ort geschnitten in 5 ml, 39 ° C warmen MEM Wachstum Medien plus 50 mM HEPES (60 x 15 mm-Platte). Beschweren sie die Filter in der Kulturschale mit dem chirurgischen Messer zum Schneiden Sie es aus verwendet werden. Legen Sie es auf dem Filter, so dass die Bohrung des Skalpells der Mitte des Filters umgibt. Zeigen Sie mit der Kultur Platte auf die beheizte des Mikroskops. </li><li> Legen Sie 2-3 ul der verdünnten DNA (in diesem Fall Plasmiden VSVGts045-GFP = mock Injektion control) in eine Mikroinjektionsnadel (Femtotip II, Eppendorf, 930000043), drehen Sie die Schutzkappe von der Nadel und ließ ihn auf den Boden fallen . Nun die Nadel ist bereit, in die Halterung geschraubt werden. Dazu drücken Sie die Menü-Taste Ihrer InjectMan und vergewissern Sie sich das Ventil abgeschaltet ist. Schrauben Sie die Nadel in die Halterung, Vorsicht, nicht in die Nadel zu fest Schraube, die zum Bruch führen kann. Nun drücken Sie die Menü-Taste erneut, wird die angelegte P c die Medien nicht in die Nadel während der microinjeciton Verfahren gesaugt zu verhindern. Schließlich, tippen Sie auf den Joystick, um gespeicherte Homing löschen. </li><li> Zum Absenken der Nadel auf die Zellen, die 10X-Objektiv und bringen Sie die Nadel in den Lichtstrahl über der Flüssigkeit. Jetzt konzentrieren sich auf die Zellen, bringen den Fokus wieder auf, indem der Fokus Rad um 180 ° auf, und finden Sie die Nadel. Anschließend langsam Nadel in den Fokus, dann bringen unscharf wieder (hinzuarbeiten bringen die Zellen in den Fokus wieder), bringen Nadel in fürKunden wieder. Wiederholen, bis die Nadel berührt die Oberfläche der Medien, an welcher Stelle alles, was Sie sehen, ist ein Heiligenschein. Wenn Sie einen Punkt, an dem die Zellen im Fokus zu erreichen, aber die Nadel ist noch unklar (dh aus der Brennebene) Änderung des 32X objektive und fein grob Einstellungen. </li><li> Stellen Sie die z-Grenze durch Berühren der apikalen Membran mit der Spitze der Nadel und Subtrahieren etwa 10 um die Kerne sind über ca. 10 pm unterhalb der apikalen Membran. </li><li> Nachdem Sie die z-Limit setzen, finden Sie den richtigen Einspritzdruck. Start bei 95 PSI. Wenn der Druck zu hoch ist, werden Ihre Zellen die Luft zu sprengen. Wenn Ihr Druck zu niedrig ist, werden Sie sehen, ein weißer Punkt, dass Aufenthalte, aber sonst nichts passiert. Mit einer erfolgreichen Injektion, sehen Sie einen Phasenwechsel ohne eine Zelle zu ändern. Für die Injektion, bringen Sie die Nadel ein paar Mikrometer aus der Bildebene so schnell wie möglich. Zielen Sie mit der Nadel über dem Zellkern (dh der Mitte einer einzelnen Zelle) und drücken Sie die Injektion Button Ihres Joystick, aber nicht die Taste gedrückt halten. </li><li> Inject 100-500 Zellen in das Loch des Skalpells, die auf Ihrem Zellen liegt. Wenn Sie fertig sind, legen Sie Ihre Zellen mit der Kulturschale und chirurgische Klinge in einem 39 ° C Inkubator, und inkubieren für 2 h. Während dieser Zeit ist VSVGts045-GFP exprimiert und sezerniert in das ER. Doch bei 39 ° C, kann VSVGts045-GFP nicht korrekt zu falten und kann somit nicht aus dem ER. In der Zwischenzeit wird die kleine GTPase von Interesse im Cytosol in Co-Injektion Experimente zu sammeln. </li><li> Nach 2 h, platzieren Sie Ihre Zellen in 1 ml MEM Wachstum Medien plus 50 mM HEPES und 0,1 mg / ml Cycloheximid in einer 12-Well-Platte und Inkubation für 2 h bei 31 ° C. Während dieser Jagd Zeitraum wird VSVGts045-GFP korrekt zu falten, lassen Sie das ER und wird an die Zelloberfläche geliefert. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 3,1 bis 3,10 für Filter zwei (injizieren Plasmiden VSVGts045-GFP und zum Beispiel Rab13T22N V5-Tag) und drei (injizieren Plasmiden VSVGts045-GFP und zum Beispiel Rab13Q67L V5-Tag). Jede Injektion wird etwa 20 nehmen - 60 min. Allerdings ist es absolut entscheidend, um alle Filter die gleiche Weise in der gesamten Temperatur-Shift Inkubationen und Oberflächenbeschmutzung behandeln, bis Sie die Zellen zu fixieren. Nach der Fixierung, können Sie durchführen den Rest Ihres Färbeprotokoll für alle Filter gleichzeitig. </li></ol> 4. Oberflächenbeschmutzung für Immunfluoreszenz-Analyse Beachten Sie, um zu vermeiden, Ausbleichen der GFP-Signal von VSVGts045-GFP, zum Schutz der Proben vor Licht durch Abdecken mit Alufolie bei allen nachfolgenden Verfahren. <ol><li> Wenn Sie Oberflächenbeschmutzung durchführen möchten, platzieren Sie Ihre Zellen in einer Kulturschale auf eine Metallplatte auf dem Eis und waschen Sie Ihre Zellen 1x mit eiskaltem PBS 2 + (PBS [0,2 g / l KCl, 0,2 g / l KH 2 PO 4, 8 g / l NaCl und 2,17 g / l Na 2 HPO 4 x 7 H 2 O] plus 0,1 g / l CaCl 2 und 0,1 g / l MgCl 2 x 6 H 2 O). Anschließend werden 30 ul eines Antikörpers, der Ektodomäne des Protein erkennt, in diesem Fall die monoklonalen Maus-Antikörper TK1 (IgG 1, erhalten aus dem späten Thomas Kreis), auf saubere Parafilm auf die Metallplatte auf Eis gelegt. Setzen Sie den Filter mit Ihren Zellen kopfüber auf dem Tropfen und ein paar Tropfen von Antikörpern auf die Rückseite des Filters. Inkubation für 1 h auf Eis. </li><li> Legen Sie Zellen in einer 12-Well-Platte 3x mit eiskaltem PBS 2 + (oder RT warmen PBS 2 + ohne vorherige Oberfläche Färbung) und fix mit 3% Paraformaldehyd für 15 min bei RT. </li><li> Wash Zellen einmal mit PBS 2 + und verlassen in PBS 2 + für 5 min. </li><li> Inkubieren Zellen zu blockieren / Permeabilisierung Puffer (BPB) (2% [wt / vol] BSA, 0,4% [wt / vol] Saponin in PBS 2 +) mit 10% [v / v] Ziegenserum. Inkubieren 1 h bei RT. </li><li> Verdünnen primären Antikörper gegen das ausgedrückt Rab GTPase erkennen, in diesem Beispiel anti-V5 (monoklonalen Maus-Antikörper IgG 2a, Invitrogen), 1:200 in BPB. Spin verdünnt Antikörper in einer Eppendorf Mikrozentrifuge für 10 min bei 13.000 Umdrehungen pro Minute. Platz 30 ul der Antikörper-Lösung auf saubere Parafilm in eine feuchte Kammer. Legen Sie die Zellen auf Filterpapier kopfüber auf den Antikörper drop und Inkubation für 1 h bei RT. </li><li> Legen Zellen zurück (rechts oben) in einer 12-Well-Platte und waschen mehr als 30 min mit BPB bei RT 5X. </li><li> Verdünnen entsprechenden Sekundärantikörper, in diesem Fall Ziege anti-Maus IgG 1 Alexa 594-markierten (für VSVG Erkennung auf der Oberfläche, Invitrogen) und Cy5-markierten Sekundärantikörper Ihre Rab GTPase zu erkennen, in diesem Beispiel Ziege anti-Maus IgG 2a Cy5-markierten (Jackson ImmunoResearch), 1:200 in BPB und Spin wie oben. Platz 30 ul Antikörper-Lösung auf die saubere Parafilm in einer feuchten Kammer und geben dazu Zellen auf Filter kopfüber auf den Antikörper fallen. Inkubieren 1 h bei RT. </li><li> Wiederholen Sie Schritt 4.6. </li><li> Dip-Zellen auf Filterpapier 3X in deionisiertem Wasser und Ort right Seite nach oben auf Mikroobjekttragerglaschen. Add 10-15 ul Halterung (10% [wt / vol] DABCO, 50% [wt / vol] Glycerin in destilliertem Wasser) auf der Oberseite der Zellen. Legen 18x18 mm micro Deckglas auf und mit Kosmetiktücher sanft drücken Sie die Mikro-Deckglas auf die Zellen. Seal mit Nagellack. </li><li> Analysieren Proben mit einem konfokalen Mikroskop. Wir verwendeten eine Microsystem LSM 510, Carl Zeiss MicroImaging, Inc., die mit einem 63X Eintauchen in Wasser-Objektiv ausgestattet war. </li><li> Für die Herstellung von Figuren, anpassen und kombinieren Bilder mit Programmen wie Adobe Photoshop und Adobe Illustrator. </li></ol> 5. Repräsentative Ergebnisse Beispiele, wie die Co-Expression von kleinen GTPasen stört VSVG Sortierung verweisen wir auf veröffentlichte Artikel entweder apikale missorting 3, 4 oder Hemmung der Oberfläche Lieferung 7. <img src="/files/ftp_upload/2645/2645fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. In dem Modell-Injektion, dh eine Injektion von nur das Plasmid kodiert VSVGts045-GFP, ist das Protein an der basolateralen Oberfläche gut polarisierten MDCK-Zellen geliefert, wie Oberflächen-Färbung (in rot, Abbildung 1 A) beurteilt. Beachten Sie, dass nicht alle der VSVGts045-GFP in der basolateralen Membran wird während der Verfolgungsjagd auf 31 geförderte ° C durch das umfangreiche intrazelluläre Signal für den Gesamt-Protein nachgewiesen (in grün, Abbildungen 1 A und B). In Zellen, die nicht gut polarisiert VSVGts045-GFP wird auch der apikalen Membran (Abbildung 1 B) geliefert werden. Wenn das Steuerelement Exemplare wie die Zelle in Abbildung 1 B anschaut, kann man nicht vertrauen Ihre Daten und haben das Experiment mit einer besseren polarisierten Zellen wiederholen. Scale-Bars sind 5 um.

<ol><li>Mellman, I., Nelson, W. J. Nature reviews. 9 (11), 833-833 (2008).</li>
<li>Rodriguez-Boulan, E., Kreitzer, G., Musch, A. Nature reviews. 6 (3), 233-233 (2005).</li>
<li>Ang, A. L., Fölsch, H., Koivisto, U. M. The Journal of cell biology. 163 (2), 339-339 (2003).</li>
<li>Kroschewski, R., Hall, A., Mellman, I. Nature cell biology. 1 (1), 8-8 (1999).</li>
<li>Moskalenko, S., Henry, D. O., Rosse, C. Nature cell biology. 4 (1), 66-66 (2002).</li>
<li>Schuck, S., Gerl, M. J., Ang, A. Traffic (Copenhagen, Denmark). 8 (1), 47-47 (2007).</li>
<li>Nokes, R. L., Fields, I. C., Collins, R. N. The Journal of cell biology. 182 (5), 845-845 (2008).</li>
<li>Collins, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+cell%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Molecular cell.</a> 12, 1064-1064 (2003).</li>
<li>Hall, A. Science (New York, N.Y. 279 (5350), 509-509 (1998).</li>
<li>Scales, S. J., Pepperkok, R., Kreis, T. E. Cell. 90 (6), 1137-1137 (1997).</li>
<li>Keller, P., Toomre, D., Diaz, E. Nature cell biology. 3 (2), 140-140 (2001).</li>
</ol>

Die wichtigsten Schritte für eine erfolgreiche Mikroinjektion Experiments sind die Qualität und Reinheit der DNA und die Polarität der Zellen. Ohne polarisierten Zellen, wird die Injektion Kontrolle bereits VSVG mistargeted haben und das Experiment kann nicht verwendet werden. Wenn die DNA ist von schlechter Qualität, kann die DNA verstopfen die Injektionsnadel, die zu schlechte oder gar keine Expression des gewünschten Proteins an alle. Auch ist es ratsam, Expressionsplasmide, die bekanntermaßen eine hohe Expression wi...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenz </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td></tr><tr><td> Axiovert 200 Mikroskop mit Heiztisch </td><td> Carl Zeiss Inc </td><td> Auftragsbezogene </td></tr><tr><td> InjectMan NI2 FemtoJet Mikromanipulator </td><td> Eppendorf </td><td> Auftragsbezogene </td></tr><tr><td> Femtotips II (Mikroinjektion Nadeln) </td><td> Eppendorf </td><td> 930000043 </td></tr><tr><td> Microloader Tipps </td><td> Eppendorf </td><td> 930001007 </td></tr><tr><td> Klare 12-mm Transwell-Filter unterstützt </td><td> Corning Costar </td><td> 3460 </td></tr><tr><td> Endotoxin-freie Plasmid Maxiprep kit </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> NA0400 </td></tr></tbody></table>

die analyse der funktion von kleinen gtpasen durch mikroinjektion von plasmiden in polarisierten epithelzellen

Analyzing the Function of Small GTPases by Microinjection of Plasmids into Polarized Epithelial Cells

Epithelzellen polarisieren ihrer Plasmamembran in biochemisch und funktionell unterschiedliche apikalen und basolateralen Bereichen, in denen die apikale Domäne Gesichter der &quot;freien&quot; Flächen und der basolateralen Membran in Kontakt mit dem Substrat und den benachbarten Zellen. Sowohl Membran-Domänen sind durch Tight Junctions, die eine Diffusionsbarriere Form getrennt. Apical-basolateralen Polarisation kann erfolgreich in Kultur rekapituliert werden, wenn Epithelzellen wie Madin-Darby Canine Kidney (MDCK)-Zellen in hoher Dichte auf Polycarbonat-Filtern ausgesät und kultiviert für mehrere Tage 1 2. Aufbau und Pflege von Zellpolarität ist durch eine Reihe von kleinen GTPasen der Ras-Superfamilie wie Rala, Cdc42, Rab8, RAB10 und Rab13 3 4 5 6 7 geregelt. Wie alle GTPasen diese Proteine ​​Zyklus zwischen einem inaktiven GDP-gebundenen Zustand und einem aktiven GTP-gebundenen Zustand. Spezifische Mutationen in der Nukleotid-bindenden Regionen stören mit diesem Rad 8. Zum Beispiel ist Rab13T22N dauerhaft in der GDP-Form gesperrt und damit Beinamen &quot;dominant negative&quot;, während Rab13Q67L nicht mehr hydrolysieren können GTP und ist somit in eine &quot;beherrschende active &#39;Zustand 7 gesperrt. Zur Analyse ihrer Funktion in Zellen sowohl dominant negative und dominant aktiven Allele GTPasen sind in der Regel auf einem hohen Niveau zum Ausdruck gebracht, mit der Funktion der körpereigenen Proteinen 9 eingreifen. Eine elegante Methode zur hohen Überexpression in kürzester Zeit zu erreichen, ist die Plasmide der entsprechenden Proteine ​​direkt in den Kernen der polarisierten Zellen auf Filterpapier unterstützt die Verwendung von Mikroinjektionstechnik gewachsen einzuführen. Dies ist oft mit dem Co-Injektion von Reporter-Plasmide, die Plasmamembran-Rezeptoren, die speziell auf die apikalen oder basolateralen Domäne sortiert kodieren kombiniert. Eine Ladung häufig verwendet, um Fracht zu analysieren Sortierung der basolateralen Domäne ist eine temperaturempfindliche Allel des vesikulären Stomatitis Virus Glycoprotein (VSVGts045) 10. Dieses Protein kann nicht richtig falten bei 39 ° C und wird somit in das endoplasmatische Retikulum (ER) zurückgehalten werden, während das regulatorische Protein von Interesse im Cytosol zusammengebaut wird. Eine Verschiebung um 31 ° C lassen sich dann VSVGts045 richtig falten, verlassen das ER und Reisen in die Plasmamembran 11. Diese Jagd ist in der Regel in Gegenwart von Cycloheximid durchgeführt, um weitere Proteinsynthese, was zu saubereren Ergebnisse zu verhindern. Hier haben wir im Detail beschreiben das Verfahren der Mikroinjektion Plasmide in polarisierten Zellen und anschließender Inkubation wie Temperatur verschiebt sich, dass eine umfassende Analyse von regulatorischen Proteinen in basolateralen Sortierung beteiligt zu ermöglichen.

Dieser Artikel beschreibt die Verfahren in Überexpression und Analyse von kleinen GTPasen in polarisierten Epithelzellen mit Mikroinjektionstechnik beteiligt.

Die Analyse der Funktion von kleinen GTPasen durch Mikroinjektion von Plasmiden in polarisierten Epithelzellen

Epithelzellen polarisieren ihre Plasmamembran in biochemisch und funktionell unterschiedliche apikale und basolaterale Domänen, wobei die apikale Domäne ... zugewandt ist

Dieses Verfahren dient zur Untersuchung der Wirkung kleiner GTP-Acylase-Enzyme (GTP ACEs) auf die polarisierte Membranvesikeltransport. Zunächst werden DNA-Plasmide, die die kleine GTP ACE und die Reportereiweiße kodieren, in die Zellkerne polarisierter Zellen koinjiziert. Anschließend wird die DNA unter Temperaturbedingungen exprimiert, die die Reportereiweiße im endoplasmatischen Retikulum oder im trans-Golgi-Netzwerk (TGN) arretieren, während die kleine GTPA im Cytosol akkumuliert; danach wird der Transport der Reportereiweiße zur Zelloberfläche in Gegenwart von Cycloheximid verfolgt, um eine weitere Proteinsynthese zu verhindern.Schließlich markieren Sie das Reporterprotein an der Zelloberfläche zur Immunfluoreszenzanalyse. Die mit diesem Assay erhaltenen Ergebnisse ermöglichen die Visualisierung der Veränderung der Oberflächenlokalisation mittels konfokaler Mikroskopie. Der Hauptvorteil dieser Technik im Vergleich zu bestehenden Methoden wie trans transfect besteht darin, dass bei der kurzen Dauer der Überexpression, die durch Mikroinjektion erreicht wird, sekundäre Effekte minimal sind, sodass wir die primären Effekte der Proteine von Interesse untersuchen können.Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Zellpolarität zu beantworten, beispielsweise wie kleine GTPas den polarisierten Membrantransport regulieren. Eine visuelle Demonstration dieses Verfahrens ist entscheidend, da die einzelnen Schritte, die für eine erfolgreiche Mikroinjektion erforderlich sind, ohne visuelle Unterstützung schwer zu erklären sind. Isolieren Sie endotoxinfreie Plasmadesoxyribonukleinsäure mit dem Endotoxin-Free-Maxi-Prep-Kit von Sigma Aldrich gemäß dem Herstellungsprotokoll. Verwenden Sie für dieses Experiment drei klare Transwell-Filter mit 12 Millimeter Durchmesser und einer Porengröße von 0,4 Mikrometer zur Kultivierung.Die Zellen werden mit viermal 10 hoch fünf MDCK-Zellen pro Filter beimpft. Nach zwei Tagen die Kultur unter dem Mikroskop untersuchen, um zu überprüfen, ob die Zellen in einer geschlossenen Einzelschicht wachsen. Für die Mikroinjektion.Am Tag der Mikroinjektion 360 mal 15 Millimeter Platten mit fünf Litern MM-Wachstumsmedium plus 15 Millimeter Heis vorbereiten und in einen 39 Grad Celsius warmen Inkubator stellen. Zusätzlich drei 12-Loch-Platten mit je einem Milliliter MEM-Wachstumsmedium plus 50 Millimolar Heis und 0,1 Milligramm pro Milliliter Cycloheximid vorbereiten und in einen 31 Grad Celsius warmen Inkubator stellen. Das Mikroinjektionsmikroskop einschalten, das wie dieses umgekehrte Mikroskop mit beheiztem Objekttisch, 10×- und 32×-Objektiven sowie einem Eppendorf Femto-Jet eingerichtet ist.Stellen Sie die beheizte Probebühne auf 39 Grad Celsius ein. Öffnen Sie außerdem den Stickstoffgasbehälter, der mit dem Lufttisch verbunden ist. Verdünnen Sie nun die DNA mit filtriertem Wasser auf eine Endkonzentration von 0,2 Milligramm pro Milliliter.Anschließend DNA in einer Einor-Mikrozentrifuge 30 Minuten bei 13.000 U/min zentrifugieren. Den oberen Anteil abnehmen und in ein neues Röhrchen überführen. Danach bereiten Sie die MDCK-Zellen vor, indem Sie mit dem Skalpell den ersten Filter aus der Kulturschale entnehmen, den Filter aus dem Filterhalter ausschneiden und in die vorbereitete 60 mal 15 Millimeter große Platte geben, die fünf Milliliter auf 39 Grad Celsius erwärmtes MEM-Wachstumsmedium plus 50 Millimolar Heis enthält.Um den Filter in der Kulturplatte zu beschweren, platzieren Sie das chirurgische Skalpell in der Mitte des Filters und übertragen Sie anschließend die Kulturplatte auf den beheizten Objekttisch des Mikroskops. Geben Sie zwei bis drei Mikroliter der verdünnten DNA in eine Mikroinjektionsnadel. Drehen Sie die Schutzkappe der Nadel ab und lassen Sie sie zu Boden fallen.Um die Nadel in den Halter einzusetzen, drücken Sie die Menütaste der Injektionseinheit und vergewissern Sie sich, dass das Ventil geschlossen ist. Schrauben Sie die Nadel in ihren Halter ein. Achten Sie darauf, die Nadel nicht zu fest anzuziehen.Da dies zu einer Beschädigung führen könnte, drücken Sie erneut die Menütaste. So wird der angewendete Kompensationsdruck verhindern, dass das Medium während des Mikroinjektionsverfahrens in die Nadel gesaugt wird. Tippen Sie abschließend auf den Joystick, um die gespeicherte Nullposition zu löschen und die Nadel auf die Zellen abzusenken.Verwenden Sie das 10x-Objektiv und bringen Sie die Nadel in den Lichtstrahl über der Flüssigkeit. Fokussieren Sie nun auf die Zellen. Fokussieren Sie erneut nach oben, indem Sie das Fokusrad um 180 Grad nach oben drehen, und finden Sie die Nadel.Bewegen Sie die Nadel langsam in den Fokus. Bringen Sie sie dann erneut aus dem Fokus. Arbeiten Sie darauf hin, die Zellen erneut in den Fokus zu bringen.Bewegen Sie die Nadel erneut in den Fokus. Wiederholen Sie dies, bis die Nadel die Oberfläche des Mediums berührt, wobei ein Halo beobachtet wird. Fahren Sie fort, bis die Zellen scharf im Fokus sind, die Nadel jedoch weiterhin unscharf außerhalb der Fokusebene liegt.Wechseln Sie nun zum 32x-Objektiv und finden Sie die groben Einstellungen. Stellen Sie die Z-Grenze ein, indem Sie die apikale Membran mit der Nadelspitze berühren und etwa 10 Mikrometer subtrahieren, da sich die Kerne ungefähr 10 Mikrometer unterhalb der apikalen Membran befinden.Bewegen Sie die Nadel nun so schnell wie möglich einige Mikrometer aus der Fokusebene heraus. Zielen Sie mit der Nadel über den Zellkern und drücken Sie die Injektionstaste des Joysticks kurz an und wieder los. Beginnen Sie mit 95 PSI, um den richtigen Injektionsdruck zu finden.Wenn der Druck zu hoch ist, platzen die Zellen. Wenn der Druck zu niedrig ist, bleibt ein weißer Punkt sichtbar, aber sonst geschieht nichts. Führen Sie eine erfolgreiche Injektion durch, bei der ein Phasenwechsel stattfindet, ohne dass sich die Zellgröße verändert.Injizieren Sie 100 bis 500 Zellen in das Loch der chirurgischen Klinge, die auf den Zellen liegt. Anschließend stellen Sie die Zellen zusammen mit der Kulturschale und der chirurgischen Klinge in einen Inkubator bei 39 Grad Celsius und inkubieren für zwei Stunden. Schließlich überführen Sie die Zellen in die vorbereitete 12-Loch-Platte mit einem Milliliter MEM plus 50 Millimolar 0,1 Milligramm pro Milliliter Cyclohecid und inkubieren zwei Stunden bei 31 Grad Celsius.Um eine Ausbleichung des exprimierten GFP-Signals zu vermeiden, schützen Sie die Proben während aller nachfolgenden Schritte für die Oberflächenfärbung vor Licht, indem Sie sie mit Aluminiumfolie abdecken. Geben Sie die Zellen in eine Kulturschale auf eine Metallplatte auf Eis und waschen Sie sie einmal mit eiskaltem PBS plus plus. Platzieren Sie ein sauberes Stück Paraform auf der Metallplatte auf Eis und pipettieren Sie 30 µL-Tropfen eines Antikörpers, der die ecto-Domäne des Proteins von Interesse erkennt.Platzieren Sie nun den Filter mit den Zellen verkehrt herum auf den Tropfen und geben Sie einige Tropfen Antikörper auf die Rückseite des Filters. Inkubieren Sie eine Stunde auf Eis. Waschen Sie die Zellen dreimal mit eiskaltem PBS plus plus und fixieren Sie sie 15 Minuten lang bei Raumtemperatur mit 3 % Paraformaldehyd.Spülen Sie die Zellen anschließend einmal mit PBS plus plus und äquilibrieren Sie sie fünf Minuten lang in PBS plus plus. Inkubieren Sie die Zellen nun in einem blockierenden permeabilisierenden Puffer. Führen Sie die Inkubation eine Stunde bei Raumtemperatur durch, verdünnen Sie die primären Antikörper im Verhältnis 1:200 im BPB, um das exprimierte RAB GTP ACE nachzuweisen, zentrifugieren Sie 10 Minuten bei 13.000 U/min und pipettieren Sie 30 Mikroliter der Antikörperlösung auf eine saubere Param, die in einer feuchten Kammer platziert ist.Platzieren Sie die Zellen umgedreht auf die Antikörpertropfen und inkubieren Sie eine Stunde lang. Danach bringen Sie die Zellen bei Raumtemperatur wieder richtig herum in eine 12-Loch-Platte zurück und waschen sie nach der Inkubation mit den geeigneten sekundären Antikörpern fünfmal innerhalb von 30 Minuten mit BPB bei Raumtemperatur, einschließlich eines Waschschritts.Tauchen Sie die Zellen auf dem Filter dreimal in entionisiertes Wasser und geben Sie sie mit der richtigen Seite nach oben auf Objektträger mit 10 Mikrolitern Montagemedium. Legen Sie ein 18 mal 18 Millimeter großes Deckglas darauf und drücken Sie vorsichtig mit einem Papiertaschentuch das Deckglas auf die Zellen. Versiegeln Sie abschließend mit Nagellack bei der Scheininjektion, bei der nur das Plasmid zur Kodierung von V-S-V-G-T-S-O 45 GFP verwendet wird. Das Protein wird auf die basolaterale Oberfläche gut polarisierter MDCK-Zellen gebracht, wie die rote Oberflächenfärbung in Zellen zeigt, die nicht gut polarisiert sind.Ein Teil des GFP-Fusionsproteins wird an die apikale Membran transportiert. Wenn die Kontrollpräparate so aussehen, sind die Daten nicht vertrauenswürdig, und das Experiment sollte mit besser polarisierten Zellen wiederholt werden. Beachten Sie, dass nicht die gesamte exprimierte GFP-Fusion während der Verfolgung bei 31 Grad Celsius an die basolaterale Membran geliefert wird, wie das ausgedehnte intrazelluläre grüne Signal für das Gesamtprotein zeigt. Sobald die Technik beherrscht ist, sollte sie nach ihrer Entwicklung etwa 10 bis 12 Stunden in Anspruch nehmen.Diese Technik ebnete den Weg für Forscher im Bereich des Membrantransports, regulatorische Proteine in polarisierten epithelialen Zellen zu untersuchen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Proteine in polarisierten epithelialen Zellen mittels Mikroinjektionstechnik exprimiert werden können.

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Forschung

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Biologie

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Verfahren zum räumlichen-zeitlichen Steuerung der GTPase-Aktivität durch Licht beschrieben. Dieses Verfahren basiert auf Rapamycin-FKBP-induzierte FRB Heterodimerisierung und Foto einschließende Systeme. Optimierung der Licht-Bestrahlung ermöglicht die raum-zeitlich kontrollierte Aktivierung der kleinen GTPasen auf subzellulärer Ebene.

Räumlich-zeitliche Manipulation kleiner GTPase-Aktivität in subzellulären Ebene und auf Zeitskala von Sekunden in lebenden Zellen

Eine Technik, genetisch zu manipulieren Epithelzellen innerhalb der...

Genetic Modification und Rekombination von Speicheldrüsen Organkulturen

Diese Präsentation demonstriert eine Methode, bei der die Elektroporation von adhärenten, kultivierten Zellen zur Untersuchung der interzellulären, junktionalen Kommunikation verwendet wird, während die Zellen auf einem Objektträger wachsen, der mit leitfähigem und transparentem Indium-Zinnoxid beschichtet ist.

Ein Funktionstest für Gap Junction-Prüfung; Elektroporation von adhärenten Zellen auf Indium-Zinn-Oxid

Dieses Protokoll vergleicht die relativen Affinitäten von Bindungspartnern für GTPasen der Rho-Familie, einschließlich Rac1. In vivo konkurrieren Rac1-bindende Proteine um eine einzige Bindungsgrenzfläche, deren Konformation durch ein gebundenes Nukleotid bestimmt wird. Das Nukleotid ist aufgrund der hohen Hydrolyserate sowohl wichtig als auch experimentell schwer zu kontrollieren.

Vergleicht man die Affinität der GTPase-bindende Proteine ​​mit Competition-Assays

Wir beschreiben eine Methode für Depletion-Rescue-Experimente, die die zelluläre Integrität und Proteinhomöostase bewahrt. Die Adenofektion ermöglicht funktionelle Analysen von Proteinen innerhalb biologischer Prozesse, die auf fein abgestimmter Aktin-basierter Dynamik beruhen, wie z. B. mitotische Zellteilung und Myogenese, auf Einzelzellebene.

Adenofection: eine Methode zur Untersuchung der Rolle von molekularen Chaperonen in Cellular Morphodynamik von Depletion-Rettungs-Experimente

Guanosintriphosphat (GTP) -Bindung ist eine der frühesten Ereignisse in der G-Protein-Coupled Receptor (GPCR) -Aktivierung. Dieses Protokoll beschreibt die pharmakologisch charakterisierende spezifische GPCR-Ligand-Wechselwirkungen durch die Überwachung der Bindung des radioaktiv markierten GTP-Analogs [ 35 S] Guanosin-5'-O- (3-thio) triphosphats ([ 35 S] GTPγS) in Antwort auf einen Liganden von Interesse.

Messung der G-Protein-gekoppelten Rezeptorsignalisierung über radioaktiv markierte GTP-Bindung

Wir beschreiben, wie Mikro- und Fotomanipulation Techniken wie FRAP und photoaktivierungen ermöglichen die Bestimmung der Motilität Parameter und die räumlich-zeitliche Dynamik der Proteine innerhalb Migration Zellen. Experimentellen Messwerte sind subzelluläre Dynamik und Umsatz der Motilität Regulierungsbehörden oder des zugrunde liegenden Aktin-Zytoskeletts.

Mikromanipulation Techniken Analyse der morphogenetischen Dynamik und Umsatz des Zytoskeletts Regulatoren

Hier beschreiben wir ein Protokoll, um die Prenylation und Guanosin-5'-Triphosphat (GTP) untersuchen-Laden von Rho GTPase. Dieses Protokoll besteht aus zwei detaillierte Methoden, nämlich Membran Fraktionierung und ein GTPase verbundene Immunosorbentprobe assay. Das Protokoll kann verwendet werden, zur Messung der Prenylation und GTP Laden von verschiedenen anderen kleinen GTPasen.

Erkennung von kleine GTPase Prenylation und GTP binden mit Membran Fraktionierung und GTPase verbundene Immunosorbentprobe Assay

Hier stellen wir ein reproduzierbares In-vitro-Elektroporationsprotokoll für die genetische Manipulation von primären Kleinhirn-Granulazellvorläufern (GCPs) vor, das kostengünstig, effizient und lebensfähig ist. Darüber hinaus demonstriert dieses Protokoll auch eine einfache Methode für die molekulare Untersuchung primärer Cilium-abhängiger Hedgehog-Signalwege in primären GCP-Zellen.

Effiziente und kostengünstige Elektroporationsmethode zur Untersuchung primärer Cilium-abhängiger Signalwege im Granulatzellvorläufer

Lernen Sie die Mikroinjektion von Plasmiden zur Analyse kleiner GTPasen in polarisierten Epithelzellen. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung primärer Proteineffekte mit minimalen Sekundäreffekten.

Die Analyse der Funktion von kleinen GTPasen durch Mikroinjektion von Plasmiden in polarisierten Epithelzellen

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