Vergleicht man die Affinität der GTPase-bindende Proteine ​​mit Competition-Assays

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die relativen Affinitäten der Proteinbindungspartner für GT P ACEs der Reihenfamilie unter sorgfältig kontrollierten Nukleotidbeladungsbedingungen zu vergleichen. Dies wird erreicht, indem zunächst mutmaßliche kompetitive Bindungspartner gereinigt werden, die jeweils mit demselben Tag markiert sind, z. B. grün fluoreszierendes Protein oder GFP. Der zweite Schritt besteht darin, den interessierenden GTPA zu reinigen.

Zum Beispiel RAC one und laden Sie es mit dem entsprechenden Nukleotid, um den gewünschten GTPA-Signalzustand zu erreichen. Als nächstes wird das mit Nukleotiden beladene gtpa mit einer festen Menge des einen Bindungskonkurrenten und zunehmenden Mengen des anderen Bindungskonkurrenten inkubiert, um eine Titrationsbindungskurve zu erreichen. Der letzte Schritt besteht darin, Proteine, die an immobilisierte GT-Pase gebunden sind, mittels Western Blot aufzulösen und die Membran auf den GFP-Tag zu untersuchen, der von den beiden Bindungspartnern gemeinsam genutzt wird.

Letztendlich wird der Western Blot verwendet, um die relativen Konzentrationen zu identifizieren, bei denen ähnliche Mengen jedes GFP-markierten Bindungspartners von der GTPase eingefangen werden. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der Co-Präzipitation besteht darin, dass die Proteinbindungseigenschaften von gtpa durch das gebundene Nukleotid in der Zelle bestimmt werden. Das gebundene Nukleotid ist labil, was die Interpretation der Proteinbindungsdaten erschwert.

Beginnen Sie dieses Verfahren mit der Aufreinigung von GST-markierten G tpa und der Expression von gtpa-bindenden Proteinen, wie im Textprotokoll beschrieben. RINs die Kolben der transfizierten Zellen in Phosphatpuffer-Kochsalzlösung oder PBS und entleeren den Kolben fünf Minuten lang. Nach Aspirieren der freien Flüssigkeit und anschließendem Abkratzen der Zellen in 500 Mikrolitern Lysepuffer in ein Mikrofuge-Röhrchen mischten die Zellen so, dass sie 30 Minuten lang bei vier Grad Celsius invertiert wurden.

Während der Lyse werden zwei Chargen à 40 Mikroliter GFP-Trap-Kügelchen dreimal mit frischem Lysepuffersediment gewaschen. Die Perlen bei 2.700 mal G für zwei Minuten zwischen den Wäschen. Nach der Lyse klären Sie die Lysate durch Zentrifugation bei 21.000 mal G für 10 Minuten.

Übertragen Sie das geklärte Lysat jedes der konkurrierenden Proteine auf separate gewaschene GFP-Fallenkügelchen. Lassen Sie die GFP-Fusionsproteine zwei Stunden lang binden und mischen Sie sie durch Inversion bei vier Grad Celsius. Waschen Sie die geladenen GFP-Trap-Kügelchen zweimal in Lysepuffer und zweimal im Wettkampf.

Bindepuffer sedimentierende Kügelchen bei 2.700 mal G für zwei Minuten zwischen den Wäschen. Eluieren Sie GFP-Fusionsproteine, indem Sie 40 Mikroliter 0,2 molares Glycin hinzufügen und 30 Sekunden lang auf und ab pipettieren, die Kügelchen sofort bei 21.000 mal G für 60 Sekunden sedimentieren und die Flüssigkeit in ein neues Fuge-Röhrchen mit vier Mikrolitern eines molaren Tris HCL überführen. Führen Sie diesen Schritt schnell durch, um Schäden am gereinigten Protein zu begrenzen. Analysieren Sie einen Mikroliter jedes gereinigten Proteins mittels Western Blot und Sonde mit einem Anti-GFP-Antikörper, um die relative Ausbeute mit einem quantitativen Blotting-System gemäß dem Protokoll des Herstellers zu ermitteln.

Ausgleich der molaren Proteinkonzentration durch Zugabe von Konkurrenzbindungspuffer. Nehmen Sie 90 Mikroliter vorbereitete GST-Rack-One-Kügelchen und waschen Sie sie dreimal mit Nukleotid-Ladepuffer unter Verwendung eines Magnetpulversortierers, um die Kügelchen bei jedem Schritt auszufällen. Aspirieren Sie den Puffer aus den Kügelchen und fügen Sie 100 Mikroliter Nukleotidbeladungspuffer hinzu, je nachdem, ob G-D-P-G-T-P oder keine Nukleotidbeladung erforderlich ist.

Für das Wettbewerbsexperiment fügen Sie 12 Mikroliter 100 Millimolar GDP, 12 Mikroliter 10 Millimolar GTP gamma S oder kein Nukleotid zu 60 Mikrolitern GST Rack One Kügelchen für die Nukleotidbeladungskontrollen hinzu. Teilen Sie die restlichen Kügelchen in drei 10-Mikroliter-Quats auf und fügen Sie jedem Röhrchen zwei Mikroliter 100 Millimolar GDP, zwei Mikroliter 10 Millimolar GTP, Gamma S oder kein Nukleotid hinzu. Inkubieren Sie die Bead-Mischungen 30 Minuten lang bei 30 Grad Celsius unter Rühren.

Stabilisieren Sie das nukleotidgebundene Rack, indem Sie ein molares Magnesiumchlorid zu der Versuchsmischung und den Kontrollmischungen hinzufügen, um die Wettbewerbsbindung durchzuführen. Richten Sie sechs Mikro-Zündrohre ein. Jeweils mit 200 Mikrolitern Wettkampf-Bindungspuffer.

Jedes Röhrchen sollte außerdem 10 Mikroliter des mit Nukleotiden beladenen Racks, eine Perle und fünf Mikroliter des Racks enthalten. Ein Bindungsprotein A als konstantes Bindungsprotein zu jedem Röhrchen fügen Sie 0, 1, 2, 0,55, 10 oder 20 Mikroliter Rack, ein Bindungsprotein B als variables Bindungsprotein hinzu. Diese Volumina gehen von ungefähr gleichen Stammkonzentrationen der konstanten und variablen Bindungsproteine aus und müssen möglicherweise angepasst werden.

Das Gesamtvolumen der Bindungsmischung wird durch Zugabe des Wettkampf-Bindungspuffers auf 235 Mikroliter erhöht. Stellen Sie als Nächstes ein Mikrofuge-Röhrchen auf, das 200 Mikroliter des Wettkampfpuffers enthält. 10 Mikroliter experimentelles nukleotidbeladenes Rack, ein Beads und 10 Mikroliter Rack ein Bindungsprotein A. Dann richten Sie das G-D-P-G-T-P-gamma S und keine Nukleotidkontrollröhrchen ein, wie im Textprotokoll beschrieben.

Inkubieren Sie die Röhrchen zwei Stunden lang und mischen Sie sie durch Inversion bei vier Grad Celsius nach der Inkubation. Waschen Sie die Perlen dreimal mit dem Wettkampf-Bindungspuffer. Zum Schluss eluieren Sie die gebundenen Proteine in 20 Mikrolitern reduzierendem Probenpuffer.

Die quantitative Western-Blotting des GFP-Tags von gereinigtem GFP RCC zwei und GFP Corona in einer C.Propeller-Domäne zeigt, dass das Protein in der oberen Bande, GFP RCC zwei, 1,4-mal häufiger vorkommt als die untere Bande und verdünnt werden sollte, um ein molares Verhältnis von eins zu eins für das Wettbewerbsexperiment zu erreichen. Ein Kontrollexperiment zeigt, dass der Nukleotidbeladungsstatus von Rack eins die Bindungsspezifität bestimmt, titrifiziert zunehmende Volumina von GFP RCC zwei gegen ein festes Volumen äquimolare GFP Corona in einer C-Propellerdomäne und Blotting. Die Proteine, die an Rack eins binden, ermöglichen die Visualisierung einer relativen Änderung des gebundenen Proteins, indem die GFP-Bandenintensitäten für beide Konkurrenten auf demselben Diagramm dargestellt werden und die Identifizierung des Punktes, an dem sich die Linien schneiden, ermöglicht die Identifizierung des Volumens des variablen Bindungsproteins im Gleichgewicht.

Es muss jedoch darauf geachtet werden, dass Probleme wie die Interaktion zwischen Wettbewerbern oder überschüssige Köder-GTPA den Versuch nicht beeinträchtigen. Die Zunahme eines Mitbewerbers ohne Verlust des anderen, wie hier gezeigt, deutet auf ein Problem beim Versuch dieses Verfahrens hin. Es ist wichtig, daran zu denken, zu überprüfen, ob es eine wechselseitige Beziehung zwischen der Häufigkeit der konkurrierenden Bindungspartner gibt.

Es gibt eine Reihe von Problemen, die die Ergebnisse verzerren und/oder behoben werden können, solange sie durch Untersuchen der Daten identifiziert werden.