Vergleicht man die Affinität der GTPase-bindende Proteine ​​mit Competition-Assays

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die relativen Affinitäten von Protein-Bindungspartnern für GTPase-ACEs der Ras-Familie unter sorgfältig kontrollierten Nukleotid-Ladebedingungen zu vergleichen. Dies wird erreicht, indem zunächst mutmaßliche kompetitive Bindungspartner, jeweils markiert mit demselben Tag, beispielsweise grün fluoreszierendem Protein oder GFP, gereinigt werden. Der zweite Schritt besteht in der Reinigung der gewünschten GTPase.

Beispielsweise wird RAC1 mit dem geeigneten Nukleotid beladen, um den gewünschten GTPase-Signalisierungszustand zu erreichen. Anschließend wird die mit Nukleotid beladene GTPase mit einer festen Menge eines Bindungskonkurrenten und zunehmenden Mengen des anderen Bindungskonkurrenten inkubiert, um eine Titrations-Bindungskurve zu erhalten. Im letzten Schritt werden die an die immobilisierte GTPase gebundenen Proteine mittels Western Blot aufgetrennt und die Membran für das GFP-Epitop, das von beiden Bindungspartnern geteilt wird, probed.

Schließlich dient der Western-Blot dazu, die relativen Konzentrationen zu bestimmen, bei denen ähnliche Mengen jedes GFP-markierten Bindungspartners durch die GTPase gebunden werden. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber etablierten Methoden wie der Co-Präzipitation besteht darin, dass die Protein-Bindungseigenschaften der GTPase durch das gebundene Nukleotid in der Zelle bestimmt werden. Da das gebundene Nukleotid labil ist, erschwert dies die Interpretation der Protein-Bindungsdaten.

Beginnen Sie dieses Verfahren mit der Reinigung von GST-markiertem G tpa und der Expression von gtpa-Bindungsproteinen, wie im Textprotokoll beschrieben. Spülen Sie die Flaschen mit transfizierten Zellen mit Phosphatpuffer-Salzlösung oder PBS aus und lassen Sie die Flasche fünf Minuten lang abtropfen. Saugen Sie die freie Flüssigkeit ab und schaben Sie die Zellen in 500 µL Lysepuffer in ein Mikrozentrifugenröhrchen ab. Lysieren Sie die Zellen durch Vorsichtiges Umstülpen bei 4 °C für 30 Minuten.

Während der Lyse waschen Sie zwei Portionen von jeweils 40 Mikroliter GFP-Trapping-Perlen dreimal mit frischem Lysepuffer. Sedimentieren Sie die Perlen zwischen den Waschschritten durch Zentrifugation bei 2.700 × g für zwei Minuten. Klären Sie die Lysate nach der Lyse durch Zentrifugation bei 21.000 × g für 10 Minuten.

Überführen Sie das geklärte Lysat jedes der konkurrierenden Proteine auf separate gewaschene GFP-Träpperlen. Lassen Sie die GFP-Fusionsproteine zwei Stunden lang unter Rühren durch Inversion bei vier Grad Celsius binden. Waschen Sie die beladenen GFP-Träpperlen zweimal mit Lysepuffer und zweimal mit Konkurrenzpuffer.

Puffer zum Binden, bei dem die Kügelchen zwischen den Waschschritten bei 2.700 ×g für zwei Minuten sedimentiert werden. Eluieren Sie die GFP-Fusionsproteine, indem Sie 40 µL 0,2 M Glycin hinzufügen und 30 Sekunden lang auf- und abpipettieren; sedimentieren Sie die Kügelchen anschließend sofort bei 21.000 ×g für 60 Sekunden und überführen Sie die Flüssigkeit in ein neues Zentrifugenröhrchen, das vier µL 1 M Tris-HCl enthält. Führen Sie diesen Schritt schnell durch, um Schäden am gereinigten Protein zu begrenzen. Analysieren Sie je ein µL jedes gereinigten Proteins per Western Blot und verwenden Sie einen anti-GFP-Antikörper, um die relative Ausbeute mithilfe eines quantitativen Blotting-Systems gemäß Herstellerprotokoll zu bestimmen.

Stellen Sie die molare Protein-Konzentration durch Zugabe von Konkurrenzbindungs-Puffer ein. Nehmen Sie 90 Mikroliter des hergestellten GST-Rack-1-Beads und waschen Sie diese dreimal mit Nukleotid-Ladepuffer, wobei Sie bei jedem Schritt einen magnetischen Partikel-Sortierer verwenden, um die Beads auszufällen. Aspirieren Sie den Puffer von den Beads und fügen Sie 100 Mikroliter Nukleotid-Ladepuffer hinzu, abhängig davon, ob eine Beladung mit G-D-P-G-T-P oder keine Nukleotidbeladung erforderlich ist.

Für das Wettbewerbsexperiment geben Sie 12 µL 100 Millimolar GDP, 12 µL 10 Millimolar GTPγS oder kein Nukleotid zu 60 µL GST-Raf1-Beads für die Nukleotid-Ladungskontrollen hinzu. Verteilen Sie die restlichen Beads auf drei Portionen zu je 10 µL und geben Sie 2 µL 100 Millimolar GDP, 2 µL 10 Millimolar GTPγS oder kein Nukleotid zu jedem Ansatz. Inkubieren Sie die Bead-Gemische 30 Minuten bei 30 °C unter Schütteln.

Stabilisieren Sie das gebundene Nukleotid-Rack durch Zugabe von einem molaren Magnesiumchlorid zur experimentellen Mischung und den Kontrollmischungen, um die Wettbewerbsbindung durchzuführen. Bereiten Sie sechs Mikrozentrifugenröhrchen vor, von denen jedes 200 Mikroliter Wettbewerbsbindungs-Puffer enthält.

Jeder Kolben sollte außerdem 10 µL des Nukleotid-beladenen Racks, eine Perle und 5 µL des Racks enthalten. Geben Sie 0, 1, 2, 0,55, 10 oder 20 µL des Racks 1 Bindungsproteins B als variabels Bindungsprotein sowie jeweils eine konstante Menge von Bindungsprotein A zu jedem Kolben hinzu. Diese Volumina setzen annähernd gleiche Stammlösungskonzentrationen der konstanten und variablen Bindungsproteine voraus und müssen gegebenenfalls angepasst werden.

Füllen Sie das Gesamtvolumen der Bindungsmischung durch Zugabe des Konkurrenzbindungs-Puffers auf 235 Mikroliter auf. Bereiten Sie anschließend ein Mikrozentrifugenröhrchen mit 200 Mikrolitern des Konkurrenz-Puffers vor. Geben Sie 10 Mikroliter experimentelle Nukleotid-beladene Rack-eins-Perlen und 10 Mikroliter Rack-eins-Bindungsprotein A hinzu. Bereiten Sie danach die G-D-P-G-T-P gamma S- und die Nukleotid-freie Kontrollröhrchen wie im Textprotokoll beschrieben vor.

Die Röhrchen zwei Stunden bei vier Grad Celsius inkubieren und während der Inkubation durch Vorsichtiges Umstülpen mischen. Die Kügelchen dreimal mit dem Konkurrenzbindungs-Puffer waschen. Schließlich die gebundenen Proteine in 20 Mikrolitern reduzierendem Probenpuffer eluieren.

Die quantitative Westernblot-Analyse des GFP-Tags der gereinigten GFP-RCC2- und GFP-Corona1C-Propeller-Domäne zeigt, dass das Protein in dem oberen Band, GFP-RCC2, 1,4-mal stärker vertreten ist als das in dem unteren Band und verdünnt werden muss, um ein molares Verhältnis von eins zu eins für das Wettbewerbsexperiment zu erreichen. Ein Kontrollexperiment zeigt, dass der Nukleotid-Beladungszustand von Rack1 die Bindungsspezifität bestimmt, indem zunehmende Volumina von GFP-RCC2 gegen ein festes Volumen äquimolarer GFP-Corona1C-Propeller-Domäne titriert und anschließend geblottet wird. Die Proteine, die an Rack1 binden, ermöglichen es, relative Änderungen der gebundenen Proteine sichtbar zu machen, indem die GFP-Bandintensitäten beider Konkurrenten in einem gemeinsamen Diagramm dargestellt werden. Durch Identifizierung des Schnittpunkts der Kurven lässt sich das Volumen des variablen bindenden Proteins im Gleichgewicht bestimmen.

Es ist jedoch darauf zu achten, dass Probleme wie Wechselwirkungen zwischen Konkurrenten oder ein Überschuss an Bait-GTPA das Experiment nicht beeinträchtigen. Ein Anstieg eines Konkurrenten ohne Verlust des anderen, wie hier gezeigt, weist auf ein Problem während des Durchführens dieses Verfahrens hin. Es ist wichtig, darauf zu achten, dass eine reziproke Beziehung zwischen der Häufigkeit der konkurrierenden Bindungspartner besteht.

Es gibt eine Reihe von Problemen, die die Ergebnisse verfälschen können, die sich jedoch beheben lassen, solange sie durch die Überprüfung der Daten erkannt werden.