Name: Vergleicht man die Affinität der GTPase-bindende Proteine mit Competition-Assays (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 37 s
Description: Lernen Sie Competition-Assays zur Analyse der Bindungsaffinität von Rho-Familie-GTPasen wie Rac1 unter kontrollierten Nukleotid-Bedingungen mittels Western Blot.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Diese Arbeit wurde durch einen Zuschuss des Wellcome Trust unterstützt, der an MDB 088419 wurde.

1. Reinigung von GST-tagged GTPase <ol><li> Kultur ein E. coli-Stamm, wie beispielsweise BL21 mit pGEX-Rac1 O / N transformierten bei 37 ° C, bei 220 Upm Schütteln in 500 ml Autoinduktion Medium (25 mM Na 2 HPO 4, 25 mM KH 2 PO 4, 50 mM NH 4 Cl, 5 mM Na 2 SO 4, 2 mM MgSO 4, 2 mM CaCl 2, 0,5% Glycerin, 0,05% Glucose, 0,2% Lactose, 5 g Trypton, 2,5 g Hefeextrakt, 100 ug / ml Ampicillin). </li><li> Ernte Bakterien durch Zentrifugation für 10 min bei 10.000 × g, 4 ° C. </li><li> Resuspendieren Bakterienpellet in 20 ml Protein Extraktionsreagens, 1x Proteaseinhibitor und Inkubation für 20 min bei RT mit Inversion. </li><li> Klärung des Lysats durch Zentrifugation bei 40.000 xg für 30 min. </li><li> 2 ml Glutathion-magnetische Kügelchen, mit Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS: 10 mM Na 2 HPO 4, 1,8 mM KH 2 PO 4, 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl). </li><li> Inkubation für 2 h, das Mischen durch Inversion bei 4 ° C. </li><li> Viermal Waschen Kügelchen proteinbeladene mit 10 ml PBS unter Verwendung eines magnetischen Teilchens Sortierer, um die Perlen in jedem Schritt auszufällen. </li><li> Resuspendieren Protein beladenen Kügelchen in 2 ml PBS und bei -80 ° C in 100 ul Aliquots bis sie benötigt. </li></ol> 2. Expression von GTPase-bindenden Proteinen <ol><li> Am Tag vor dem Experiment Transfektion Plasmide grün fluoreszierende Protein (GFP) kodiert -markierte Versionen jedes GTPase-bindenden Proteins in einem separaten 75-cm 2 -Kolben von HEK293T wie folgt. Zur Validierung von Nukleotid-Laden, transfizieren GFP-markierten TrioD1 in ein drittes 75-cm 2-Kolben von HEK293T. <ol><li> Verdünnter polyethylamine bis 1 mg / ml in 100 &amp; mgr; l sterilem 150 mM NaCl. </li><li> In 27 ul verdünnt polyethylamine bis 223 &amp; mgr; l reduziert Serum Medien. </li><li> In 12 &amp; mgr; g Plasmid-DNA zu 250 &amp; mgr; l reduziert Serum Medien. </li><li> Inkubieren jedes Röhrchen für 2 min bei RT. </li&gt; <li> Kombinieren Sie die polyethylamine und DNA vermischt sich in einem einzigen Rohr und Vortex für 2 min. </li><li> Inkubieren Sie für 15-20 min bei RT. </li><li> Ersetzen Sie das Wachstumsmedium (Dulbeccos modifiziertem Eagle Medium, das 10% fötales Rinderserum, 2 mM L-Glutamin, keine Antibiotika), die auf 90% konfluent HEK293T mit 5 ml frisches Wachstumsmedium. </li><li> In der kombinierten polyethylamine / DNA-Gemisch in den Kolben und Inkubation O / N bei 37 ° C, 5% CO 2. </li></ol></li></ol> 3. Reinigung der GTPase-bindenden Proteinen <ol><li> Spülen Sie die Flasche aus transfizierten Zellen in PBS und Drain-Kolben für 5 min, Absaugen freie Flüssigkeit. </li><li> Abzukratzen Zellen in 500 ul Lysepuffer (50 mM Tris-HCl (pH 7,8), 1% Nonidet P-40, 1x Proteaseinhibitor) in Mikrozentrifugenröhrchen. </li><li> Zellen lysieren durch Mischen durch Inversion bei 4 ° C für 30 min. </li><li> Während der Lyse, waschen zwei Lose von 40 ul GFP-Trap-Kügelchen dreimal mit frischem Lysepuffer, sedimentierenden Perlen bei 2700 × g für 2 Minuten zwischen den Waschvorgängen. </li><li> Klärung Lysate durch Zentrifugation bei 21.000 × g für 10 min. </li><li> Übertragungs geklärte Lysat eines jeden der Wettbewerber Proteine ​​gewaschen GFP-trap Perlen abzutrennen und zu ermöglichen GFP-Fusionsproteine, für 2 h binden, Mischen durch Umdrehen bei 4 ° C. Halten Lysat aus GFP-TrioD1 Zellen auf Eis. </li><li> Zweimal waschen geladen GFP-Trap-Perlen in 50 mM Tris-HCl (pH 7,8), 50 mM NaCl, 0,7% (w / v) Nonidet P-40 und zweimal in 50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 20 mM MgCl 2 , sedimentierenden Perlen bei 2700 × g für 2 Minuten zwischen den Waschgängen. </li><li> Eluieren GFP-Fusionsproteinen durch Zugabe von 40 ul 0,2 M Glycin (pH 2,5) und Auf- und Abpipettieren für 30 sec. Sofort Sediment Kügelchen bei 21.000 × g für 60 s und Transferflüssigkeit auf ein neues Mikrozentrifugenröhrchen, enthaltend 4 &amp; mgr; l 1 M Tris-HCl (pH 10,4). Tun dies schnell zur Beschädigung des gereinigten Proteins zu begrenzen. </li><li> Analyse 1 ul jedes gereinigten Proteins durch Western-Blot und die Sonde mit einem anti-GFP-Antikörper, um die relative Ausbeute herzustellen unter Verwendung eines quantitativen Blotting System gemäß dem Protokoll des Herstellers. Alternativ bestimmen Proteinkonzentrationen von Bicinchoninsäure (BCA) Assay aber dies führt Fehler, wenn die Proteine ​​nicht mit dem Assay in einer identischen Weise reagiert oder es kontaminierende Proteine. </li><li> Leichen molaren Proteinkonzentration durch die Zugabe von 50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 20 mM MgCl 2. </li></ol> 4. Nucleotide Belastung der GTPase <ol><li> Tauwetter ein Aliquot von GST-Rac1 magnetische Kügelchen, die in Schritt 1 hergestellt. </li><li> Nehmen 90 ul von GST-Rac1 Perlen und dreimal mit 20 mM Tris-HCl (pH 7,6), 25 mM NaCl, 0,1 mM DTT, 4 mM EDTA, unter Verwendung eines magnetischen Partikelsortierer, um die Perlen in jedem Schritt auszufällen. </li><li> Saugen Sie Puffer aus Perlen und fügen Sie 100 ul 20 mM Tris-HCl (pH 7,6), 25 mM NaCl, 0,1 mM DTT, 4 mM EDTA. </li><li> Je nachdem, ob das BIP, GTP oder keine Nukleotid-Belastung für den Wettbewerb Experiment erforderlich, fügen Sie 12 ul 100 mM BIP, 12 &amp; mgr; l 10 mM guanosine 5 &#39;- [γ-thio] Triphosphat (GTP &amp; ggr;) oder keine Nukleotid bis 60 &amp; mgr; l GST-Rac1 Perlen. </li><li> Für die Nukleotid-Ladesteuerungen, teilen Sie die restlichen Perlen in drei 10-ul-Aliquots und fügen Sie 2 ul 100 mM GDP, 2 &amp; mgr; l 10 mM GTPyS oder keine Nukleotid in jedes Röhrchen. </li><li> Inkubieren Wulst Mischungen für 30 Minuten bei 30 ° C unter Rühren. </li><li> Stabilisierung Nucleotid gebundene Rac1 durch Zugabe von 1 M MgCl 2: 3 &amp; mgr; l auf die Versuchsmischung (Schritt 4.4), 0,5 &amp; mgr; l zu jeder der Kontrollmischungen (Schritt 4.5). </li></ol> 5. Wettbewerb bindend. <ol><li> Einrichten 6 Mikrozentrifugenröhrchen, die jeweils: 200 ul 50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 20 mM MgCl 2 10 &amp; mgr; experimentelle Nukleotid-beladenen Rac1-Perlen (ab Schritt 4.7) 5 ul Rac1-bindenden Protein A (Konstante Bindungsprotein) </li><li> Zu jedem Röhrchen hinzu 0, 1, 2,5, 5, 10 oder 20 ul Rac1-bindendes Protein B (variable Bindungsprotein). Diese Bände davon ausgehen, approximately gleich stock Konzentrationen der konstanten und variablen Bindungsproteine ​​und muss unter Umständen angepasst werden. <ol><li> Einstellen Volumina bindende Proteine ​​A und B, wenn es große Unterschiede in den Bindungsaffinitäten der beiden Proteine ​​und dies sollte empirisch durch die Versuchswiederholungen bestimmt werden. Bilden das Gesamtvolumen des Bindungsgemisch auf 235 &amp; mgr; l durch Zugabe von 50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 20 mM MgCl 2. </li></ol></li><li> Einrichtung eines Mikrozentrifugenröhrchen enthält: 200 ul 50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 20 mM MgCl 2 10 &amp; mgr; experimentelle Nukleotid-beladenen Rac1-Perlen (ab Schritt 4.7) 10 ul Rac1-bindenden Protein A (Konstante Bindungsprotein) </li><li> Einrichten des BIP, GTPyS und keine Nukleotid-Kontrollröhrchen: 200 ul 50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 20 mM MgCl 2 10 ul Steuer Rac1 Perlen in Schritt 4.5 mit dem BIP, GTPyS oder kein Nukleotid geladen und in Schritt 4.7 stabilisiert. 180 ul HEK293T GFP-TrioD1 Lysat, wie in Schritt 3.6 hergestellten 4 &amp; mgr; l 1 M MgCl 2 </li><li> Inkubieren der Mischung für 2 h, das Mischen durch Inversion bei 4 ° C. </li><li> Dreimal mit 50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 20 mM MgCl 2 Waschen der Kügelchen. </li><li> Eluieren die gebundenen Proteine ​​werden in 20 ul reduzierendem Probenpuffer (50 mM Tris-HCl (pH 7), 5% SDS, 20% Glycerin, 0,02 mg / ml Bromphenolblau, 5% β-Mercaptoethanol). </li></ol> 6. Analyse der Wettbewerbs <ol><li> Beheben 10 ul des gebundenen Proteins (Schritt 5.6), bestimmt durch Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) und Western-Blot. </li><li> Inkubieren der Membran bei 4 ° CO / N im anti-GFP-Antikörper, verdünnt 1/1000 in Blockierungspuffer verdünnt, in PBS 1X, 0,1% Tween-20 auf die beiden markierten GTPase-bindende Proteine ​​erkennen. </li><li> Dreimal 10 min mit PBS, 0,1% Tween-20 waschen der Membran. </li><li> Inkubieren der Membran für 30 min bei RT in 800 DyLight konjugiertem Anti-Kaninchen-secondary Antikörper, verdünnt 1 / 10.000 in Blockierungspuffer verdünnt, in PBS, 0,1% Tween-20 1 x auf. </li><li> Dreimal 10 min mit PBS, 0,1% Tween-20 waschen der Membran. </li><li> Scannen der Membran unter Verwendung eines Infrarot-Abbildungssystem mit der Software, um die Bandintensität nach dem Protokoll des Herstellers gemessen. </li><li> Zur Erstellung der Bandintensität jedes Proteins vor der Verstellpumpe Konkurrent (Protein B). </li><li> Teilen das Volumen der variable Konkurrent an dem Punkt, an dem die Linien sich durch das Volumen konstant Konkurrent (Protein A, 5 &amp; mgr; l), um den Konkurrenzverhältnis, bei dem ein Gleichgewicht erreicht bestimmen. </li><li> Zur Validierung der Nukleotid-Ladezustand, Sondenmembranen für p21-activated kinase 1 (PAK1) (ein Effektor) und GFP-TrioD1 (a GEF), wie in den Schritten 6.1-6.6 beschrieben. </li></ol>

<ol><li>Burridge, K., Rho Wennerberg, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((and+Rac+take+center+stage%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">and Rac take center stage.</a> Cell. 116 (2), 167-179 (2004).</li>
<li>Raftopoulou, M., Hall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+migration%3A+Rho+GTPases+lead+the+way%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell migration: Rho GTPases lead the way.</a> Dev Biol. 265 (1), 23-32 (2004).</li>
<li>Rossman, K. L., Der, C. J., Sondek, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GEF+means+go%3A+turning+on+RHO+GTPases+with+guanine+nucleotide-exchange+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">GEF means go: turning on RHO GTPases with guanine nucleotide-exchange factors.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (2), 167-180 (2005).</li>
<li>Worthylake, D. K., Rossman, K. L., Crystal Sondek, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((structure+of+Rac1+in+complex+with+the+guanine+nucleotide+exchange+region+of+Tiam1%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">structure of Rac1 in complex with the guanine nucleotide exchange region of Tiam1.</a> Nature. 408 (6813), 682-688 (2000).</li>
<li>Scheffzek, K., Ahmadian, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GTPase+activating+proteins%3A+structural+and+functional+insights+18+years+after+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">GTPase activating proteins: structural and functional insights 18 years after discovery.</a> Cell Mol Life Sci. 62 (24), 3014-3038 (2005).</li>
<li>Del Pozo,, A, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrins+regulate+GTP-Rac+localized+effector+interactions+through+dissociation+of+Rho-GDI%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Integrins regulate GTP-Rac localized effector interactions through dissociation of Rho-GDI.</a> Nat Cell Biol. 4 (3), 232-239 (2002).</li>
<li>Williamson, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coronin-1C+and+RCC2+guide+mesenchymal+migration+by+trafficking+Rac1+and+controlling+GEF+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Coronin-1C and RCC2 guide mesenchymal migration by trafficking Rac1 and controlling GEF exposure.</a> J Cell Sci. 127 (Pt 19), 4292-4307 (2014).</li>
<li>Del Pozo, M. A., Price, L. S., Alderson, N. B., Ren, X. D., Schwartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adhesion+to+the+extracellular+matrix+regulates+the+coupling+of+the+small+GTPase+Rac+to+its+effector+PAK%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+J%22%5BJournal%5D)">Adhesion to the extracellular matrix regulates the coupling of the small GTPase Rac to its effector PAK.</a> Embo J. 19 (9), 2008-2014 (2000).</li>
<li>Van Rijssel, J., Hoogenboezem, M., Wester, L., Hordijk, P. L., Van Buul, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+N-terminal+DH-PH+domain+of+Trio+induces+cell+spreading+and+migration+by+regulating+lamellipodia+dynamics+in+a+Rac1-dependent+fashion%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS%22%5BJournal%5D)">The N-terminal DH-PH domain of Trio induces cell spreading and migration by regulating lamellipodia dynamics in a Rac1-dependent fashion.</a> PLoS. 7 (1), e29912(2012).</li>
<li>Self, A. J., Hall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+intrinsic+nucleotide+exchange+and+GTP+hydrolysis+rates%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Measurement of intrinsic nucleotide exchange and GTP hydrolysis rates.</a> Methods Enzymol. 256, 67-76 (1995).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zum Vergleich der relativen Affinitäten von Paaren kleiner GTPase-bindender Proteine. Die wichtigsten Schritte sind die Aufbereitung der gereinigten GTPase-bindenden Proteine und die Nukleotidbeladung der GTPase. Die Verwendung von GTPase-bindenden Proteinen mit dem gleichen GFP-Tag ermöglicht es, die Konzentrationen, bei denen ähnliche Mengen jedes Konkurrenten binden, genau zu bestimmen. Die Verwendung von rekombinanter nukleotidbeladener GTPase ermöglicht die Abfrage der Bindungseigenschaften der GTPase unter spezifischen Aktivitätsbedingungen. Dieser Schritt ist auch der empfindlichste, da Nukleotide sowohl hydrolysieren als auch von der GTPase lösen, wenn die Magnesiumbedingungen nicht genau eingehalten werden.
In der Zelle macht die große Anzahl von GTPase-bindenden Proteinen in Kombination mit dem schnellen Nukleotidumsatz die Interpretation solcher Signalwege schwierig. Die Einfachheit dieser Methode, bei der nur Paare von Bindungsproteinen verglichen werden und sorgfältig kontrollierte Nukleotidbeladungsbedingungen verwendet werden, ermöglicht die Aufklärung von Signalwegen. Die größte Stärke des Protokolls ist jedoch auch die größte Schwäche, da es eine Vereinfachung der In-vivo-Situation darstellt. Konkurrenz-Assays können verwendet werden, um eine robuste Hypothese aufzustellen, aber diese sollte dann durch Knockdown-Experimente in Zellen getestet werden.
Es gibt drei Merkmale, die bei der Auswahl der GFP-markierten GTPase-bindenden Proteine, die im Experiment verwendet werden sollen, berücksichtigt werden müssen. Erstens müssen die Fusionsproteine in Säugetierzellen wie HEK293T gut exprimiert werden, da Konkurrenzassays eine angemessene Menge an Protein erfordern. Zweitens muss es möglich sein, das rekombinante Protein ohne signifikanten Abbau zu reinigen, und wo dies nicht möglich ist, sollte die Klonierung eines GTPase-bindenden Fragments in Betracht gezogen werden. Drittens müssen die beiden GTPase-bindenden Proteine auf SDS-PAGE voneinander aufgelöst werden, um eine Analyse in Abschnitt 6 zu ermöglichen.
Es gibt eine Reihe potenzieller Vorbehalte bei dem Experiment, die berücksichtigt und möglicherweise behoben werden müssen:
Mögliche Denaturierung von gereinigten GTPase-bindenden Proteinen während des Säureelutionsschritts oder sterische Behinderung durch den GFP-Tag. In unseren Händen waren diese kein Problem, müssen aber getestet werden. Die gereinigten Proteine können in funktionellen Assays 10 getestet werden. Inzwischen gibt es kommerzielle Kits, um die Aktivität von GEFs oder GAPs zu testen, ohne dass isotopenmarkierte Nukleotide benötigt werden. Sequestrierende Proteine schützen GTPasen von Natur aus vor GEF- oder GAP-Aktivität und können daher als kompetitive Inhibitoren in kommerziellen GEF- oder GAP-Assays verwendet werden, wie wir es in unserer jüngsten Veröffentlichung getan haben 7. Das relevante Merkmal von Proteinen, die GTPase transportieren, ist die Fähigkeit, die GTPase zu binden, und dies kann leicht in einem Pull-Down-Assay getestet werden. Ein alternativer Ansatz zum Testen der Proteinintegrität, der auf alle Bindungsproteine anwendbar ist, besteht darin, Proteine, die aus GFP-Fallenkügelchen eluiert wurden, mit Glycin zu titrieren, wobei das gleiche Protein aus GFP-Fallenkügelchen durch enzymatische Spaltung entfernt wird. Das Experiment würde analysiert, indem sowohl das GFP-markierte als auch das gespaltene Protein mit einem Antikörper gegen das Protein selbst untersucht werden. Wenn das Protein durch Elution nicht geschädigt wird, sollte ein Gleichgewicht im Verhältnis 1:1 erreicht werden. Dieser Ansatz würde auch anzeigen, ob das Vorhandensein des GFP-Tags selbst die Bindungseigenschaften des Kandidatenproteins beeinträchtigt, obwohl dies die Herstellung eines Konstrukts mit einer enzymatischen Spaltstelle zwischen dem Tag und dem Bindungsprotein erfordert. Unabhängig davon, ob das Protein durch den Tag oder den Elutionsschritt kompromittiert wird, könnte das Problem durch eine Änderung des Protokolls gelöst werden, um eine alternative Aufreinigungsmethode zu verwenden. Anstelle von GFP könnten bindende Proteine mit His-markiert, mit Ni-NTA gereinigt und mit einem Antikörper gegen den His-Tag analysiert werden. Das wichtige Merkmal ist, dass beide Bindungsproteine eine gemeinsame Markierung haben müssen, obwohl bei Bedarf zwei Tags zu einem Protein hinzugefügt werden können, einer für die Reinigung und der andere für den Nachweis.
Das Protokoll wurde entwickelt, um den Wettbewerb zwischen den Wechselwirkungen mit den Switch-I/II-Domänen zu untersuchen. Obwohl die Mehrzahl der GTPase-Wechselwirkungen durch dieses Motiv vermittelt wird, gibt es einige Ausnahmen, vor allem die Wechselwirkungen von GDIs, die an den Prenylschwanz binden und die Schalterdomänen verschleiern. Prinzipiell könnte das Protokoll so angepasst werden, dass GTPase verwendet wird, die aus Säugetierzellen gereinigt wurde, so dass die GTPase prenyliert ist, jedoch erschwert das Vorhandensein mehrerer Bindungsstellen oder allosterischer Effekte die Interpretation von Konkurrenzbindungsdaten. Weitere Probleme, die mit einer solchen Modifikation verbunden sind, sind, dass GDIs mit GTPase aus Säugetierzellen co-reinigen, was die Reinheit der isolierten Proteine beeinträchtigt, und die hydrophobe Natur der Prenylgruppen bedeutet, dass prenylierte GTPasen entweder mit GDI oder Lipidmembran assoziiert sind und solche Faktoren im Experiment berücksichtigt werden müssten.
Die Menge an GST-Rac1, die im Assay verwendet wird. Das konstante GTPase-bindende Protein muss eine höhere Konzentration als das Rac1 haben, oder wenn der Konkurrent hinzugefügt wird, bindet es einfach an freies Rac1. Es wird sofort offensichtlich, wenn dies geschehen ist, da die Bindung des Konkurrenten ohne Verlust des konstanten Proteins auf die gleiche Weise nachgewiesen wird, wie wenn die beiden konkurrierenden Proteine aneinander binden, wie in Abbildung 3B gezeigt. Als zusätzliche Kontrolle (Schritt 5.3) sollte eine Bindungsreaktion eingeschlossen werden, die die doppelte Menge an konstantem Bindungsprotein und kein variables Bindungsprotein enthält (Schritt 5.3). Wenn der Rac1 im Titrationsexperiment gesättigt ist, hat eine Verdopplung der Menge an konstant bindendem Protein keinen Einfluss auf die Ausgabe. Die im Protokoll vorgeschlagenen Volumina sollten angemessen sein, aber die Menge an Rac1 kann leicht reduziert werden. Wenn eine Bindung des Konkurrenten ohne Verlust des konstanten Bindungspartners beobachtet wird, sollte versucht werden, die Menge an Rac1 zu reduzieren, bevor versucht wird, Bindungsstellen zu kartieren, um die Bildung ternärer Komplexe zu vermeiden.
Unspezifische Interaktion von GTPase-bindenden Proteinen mit dem GST oder Bead sowie spezifisch mit Rac1. Dieses Problem würde sich in einer Restbindung des konstanten GTPase-bindenden Proteins manifestieren, selbst wenn das variable GTPase-bindende Protein bei hoher Konzentration ein Plateau erreicht hat. Die Identifizierung dieses Problems wird durch die Durchführung reziproker Experimente unterstützt, bei denen die konstanten und variablen GTPase-bindenden Proteine ausgetauscht werden. Reziproke Experimente verbessern auch die Genauigkeit der Schätzung des Gleichgewichtspunktes erheblich und sollten daher immer einbezogen werden. In Fällen unspezifischer Bindung können die relativen Konzentrationen, bei denen ein Gleichgewicht erreicht wird, immer noch berechnet werden, indem die Bandenintensität zwischen den Maxima und Minima für jedes Protein verglichen wird, oder indem das Ausmaß der unspezifischen Bindung gemessen wird, indem GST-Kügelchen anstelle von GST-Rac1 als Köder verwendet werden.
Pull-Down-Assays mit unterschiedlichen Nukleotidbeladungsbedingungen sollten verwendet werden, um den in diesem Protokoll beschriebenen Wettbewerbsassay zu ergänzen. Die Bestimmung der Nukleotidpräferenz der Partner ist wichtig, um sowohl das Wettbewerbsgeschehen als auch den Signalweg zu verstehen, an dem das GTPase-bindende Protein beteiligt ist. In Abbildung 2B analysieren wir die Bindung von Proteinen mit einer etablierten Präferenz für GTP-beladene oder nukleotidfreie GTPase als Mittel zur Validierung der Nukleotidbeladung. Es ist jedoch sinnvoll, auch die Auswirkungen der Nukleotidbeladung auf jeden der Wettbewerber zu untersuchen. Wenn die hypothetischen Konkurrenten unterschiedliche Präferenzen zeigen, wird die Konkurrenz weniger zum Signalweg beitragen, und in der Tat ist der Nukleotidumsatz wahrscheinlich der Mechanismus, der den Austausch der Bindungsproteine steuert.

Das Aktin-Zytoskelett, das die Form, Polarität und Migrationseigenschaften von Säugetierzellen bestimmt, wird durch die Rho-Familie kleiner GTPasen reguliert. Zu den GTPasen der Rho-Familie gehören RhoA, das die Kontraktion des Zytoskeletts stimuliert, Rac1, das die Aktinverzweigung und den Membranvorsprung stimuliert, und Cdc42, das ähnliche Auswirkungen auf die Aktinpolymerisation wie Rac1 hat und die Bildung von Filopodien 1,2 verursacht. Die GTPase-Signalaktivität wird durch die Bindung eines Nukleotids bestimmt, das die Kontraktion und Entspannung der Schalter-I- und Schalter-II-Schleifen steuert, die die Protein-Protein-Wechselwirkungen sowohl mit Regulatoren als auch mit Effektoren vermitteln. Guanosin-5'-Triphosphat (GTP)-gebundene GTPasen aktivieren nachgeschaltete Effektoren, während die an Guanosin 5'-Diphosphat (GDP) gebundene Form inaktiv ist. In der Zelle ermöglichen Zyklen der GTP-Hydrolyse und des Nukleotidaustauschs einen schnellen Austausch von GTPase-Signalen, die für die Dynamik des Zytoskeletts notwendig sind. Der Nukleotidumsatz wird durch drei Mechanismen reguliert. Guanin-Nukleotid-Austauschfaktoren (GEFs) stabilisieren die nukleotidfreie GTPase, katalysieren den Austausch von GDP gegen GTP und stimulieren dadurch die GTPase-Signalaktivität 3,4. GTPase-aktivierende Proteine (GAPs) katalysieren die Hydrolyse von GTP zu GDP und hemmen dadurch die GTPase-Signalaktivität 5. Sequestrierende Moleküle, wie z. B. der Regulator der Chromatinkondensation 2 (RCC2) und die Guanin-Nukleotid-Dissoziationsinhibitoren (GDIs), verdecken die Schaltschleifen und entfernen im Falle von GDIs die GTPase aus der Membran durch Wechselwirkung mit dem Prenylschwanz 6,7. Jede der drei Klassen von regulatorischen Molekülen interagiert mit den Schaltschleifen, ebenso wie die nachgeschalteten Effektoren und einige Transportregulatoren wie Coronin-1C 7. Der Zweck dieses Protokolls besteht darin, die Konkurrenz um die Bindungsstelle des Schalters I/II zwischen mutmaßlichen Regulatoren und nachgeschalteten Signalmolekülen zu messen. Es sollte beachtet werden, dass Konkurrenzassays die Bindung an eine gemeinsame Bindungsstelle testen, so dass dieses Protokoll nicht geeignet ist, um Wechselwirkungen mit anderen Stellen zu testen, wie z. B. die Bindung von GDIs an den Prenylschwanz.
Die Feinheit der Konformationsunterschiede zwischen aktiven und inaktiven Formen, kombiniert mit der labilen Natur des gebundenen Nukleotids, hat die Untersuchung von GTPase-Bindungsereignissen erschwert. Die Rolle des gebundenen Nukleotids bedeutet, dass herkömmliche Bindungsassays wie Immunpräzipitation oder Oberflächenplasmonenresonanz nicht gut für die Untersuchung geeignet sind, da das Nukleotid nicht kontrolliert werden kann. Dieses Hindernis wird durch die Überlappung der Bindungsstellen von GEFs, GAPs, Effektoren, sequestrierenden Molekülen und Transportmolekülen noch verschärft, was die Interpretation von Bindungsdaten für eine einzelne Interaktion im Kontext der Konkurrenz, die in der Zelle stattfinden wird, erschwert. Insbesondere die Immunpräzipitation wird durch die Konkurrenz zwischen den Bindungspartnern beeinträchtigt, da unter bestimmten zellulären Bedingungen ein Bindungspartner auf Kosten aller anderen identifiziert werden kann, während unter anderen Bedingungen ein anderer Partner dominieren kann. Die dynamische Natur des GTPase-Signalwegs ist essentiell für die Funktion der GTPase und muss bei der Analyse der Beziehungen zwischen den Bindungsinteraktionen verschiedener Regulatoren berücksichtigt werden. In der Tat haben wir kürzlich einen Weg beschrieben, der stark auf kompetitiver Bindung beruhte. Wir identifizierten Coronin-1C als ein Transportmolekül, das an die Schaltschleifen von GDP-Rac1 bindet 7. In Gebieten mit geringer GEF-Aktivität würde der illegale Handel dominieren und Rac1 aus diesen Regionen entfernen. Wenn Rac1 jedoch in Regionen der Zelle abgegeben wird, in denen die GEF-Aktivität hoch ist, würde das GEF Coronin-1C übertreffen und dadurch sowohl Rac1 aktivieren als auch die Coronin-1C-vermittelte Entfernung von Rac1 aus diesem Bereich verhindern. Das Modell geht noch weiter, denn die Wirkung des GEF tauscht gebundenes BIP gegen GTP aus, wodurch sich das Gleichgewicht noch weiter von Coronin-1C entfernt. Folglich könnte die Rac1-Aktivität vollständig durch Wettbewerb und relative Affinität erklärt werden.
In diesem Protokoll beschreiben wir eine Methode zum Vergleich der relativen Affinitäten verschiedener Bindungspartner für kleine GTPasen am Beispiel von Rac1. Durch die Verwendung eines gereinigten Proteinansatzes ist es möglich, eine Kette von Signalereignissen durch paarweisen Vergleich in einem Experiment zusammenzusetzen, bei dem das gebundene Nukleotid genau kontrolliert werden kann.

<table><tbody><tr><td>Bugbuster</td><td>Novagen</td><td>70584-3</td><td></td></tr><tr><td>COMPLETE Proteaseinhibitor</td><td>Roche</td><td>05 056 489 001</td><td></td></tr><tr><td>Glutathion-Magnetkügelchen</td><td>Pierce</td><td>88821</td><td></td></tr><tr><td>Polyethylenimin, verzweigt, durchschnittlich Mw ~25.000</td><td>Sigma Aldrich</td><td>408727-100ML</td><td></td></tr><tr><td>OPIMEM</td><td>Life Technologies</td><td>31985-047</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Media</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D5796</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>Life Technologies</td><td>10270-1-6</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Life Technologies</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>GFP-Trap_A</td><td>Chromotec</td><td>gta-20</td><td></td></tr><tr><td>GDP</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G7127</td><td>Sehr instabil. Aliquotieren und sofort nach der Rekonstrutution bei -80 lagern GTP</td></tr><tr><td>&gamma; S</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G8634</td><td>Sehr instabil. Aliquotieren und sofort nach der Rekonstitution bei -80 lagern</td></tr><tr><td>Blockierungspuffer</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B6429</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9416</td><td></td></tr><tr><td>Anti-GFP-Antikörper</td><td>Living Colors</td><td>632592</td><td>Verwendung bei 1/1000 Verdünnung</td></tr><tr><td>DyLight 800 konjugierter Ziegen-Anti-Kaninchen-Sekundärantikörper</td><td>Fisher Scientific</td><td>10733944</td><td></td></tr><tr><td>Anti-PAK1-Antikörper</td><td>Cell Signaling</td><td>2602S</td><td>Verwendung bei einer Verdünnung von 1/1000</td></tr><tr><td>Odyssey SA Infrarot-Bildgebungssystem</td><td>Li-cor</td><td>9260-11PC</td><td></td></tr></tbody></table>

vergleicht man die affinität der gtpase-bindende proteine ​​mit competition-assays

Comparing the Affinity of GTPase-binding Proteins using Competition Assays

In diesem Protokoll demonstrieren wir eine Methode zum Vergleich der Konkurrenz zwischen GTPase-bindenden Proteinen. Ein solcher Ansatz ist aus zwei Gründen wichtig für die Bestimmung der Bindungsfähigkeit von GTPasen: Die Tatsache, dass alle Wechselwirkungen die gleiche Oberfläche der GTPasen betreffen, bedeutet, dass Bindungsereignisse im Kontext von Wettbewerbern betrachtet werden müssen, und die Tatsache, dass das gebundene Nukleotid auch kontrolliert werden muss, bedeutet, dass herkömmliche Ansätze wie die Immunpräzipitation für die GTPase-Biochemie ungeeignet sind. Der Assay beruht auf der Verwendung von gereinigten Proteinen. Als Köderprotein wird gereinigtes Rac1 immobilisiertes Rac1 verwendet, das mit GDP, einer nicht hydrolysierbaren Version von GTP, beladen oder nukleotidfrei gelassen werden kann, so dass die zu untersuchende Signalstufe kontrolliert werden kann. Die zu untersuchenden Bindungsproteine werden mit Hilfe eines GFP-Tags aus Säugetierzellen aufgereinigt, um eine korrekte Faltung zu ermöglichen. Die Verwendung desselben Tags auf beiden Proteinen ist wichtig, da dies nicht nur eine schnelle Aufreinigung und Elution ermöglicht, sondern auch den Nachweis beider Konkurrenten mit demselben Antikörper während der Elution. Das bedeutet, dass die relativen Mengen der beiden gebundenen Proteine genau bestimmt werden können.

Dieses Protokoll wurde entwickelt, um die relativen Affinitäten von Bindungspartnern für Rac1 zu berechnen, ohne die Notwendigkeit, die genaue Konzentration der Wettbewerber zu geben (Abbildung 1). Bestimmung der Proteinkonzentration führt Fehler und bei der Betrachtung der Wettbewerb zwischen Molekülen in einem Signalweg, ist nicht erforderlich. Jedoch ist es wichtig zu wissen, dass die beiden Wettbewerber haben die gleiche molare Konzentration in der Stammlösungen für einfache, Verhältnisse berechnet werden, wenn die Zugabe verschiedener Volumina auf den Test. 40 ul von GFP-Trap-Perlen eine Bindungskapazität von ~ 300 pmol so eine konfluente 75 cm 2-Kolben hoch exprimierenden Zellen werden die Perlen zu sättigen, mit dem Ergebnis, dass die Vorbereitungen der beiden unterschiedlichen Bindungsproteine ​​ähnlich vor Anpassung (Abbildung 2A). Wenn eines der Proteine ​​schlecht exprimiert, kann dieses Problem durch Reinigen dieses Proteins aus mehr als einem Kolben von Zellen überwunden werden können. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Die Bindung der meisten GTPase Effektoren und Regler abhängig von der Nukleotid-Beladung des Köder GTPase, so ist es wichtig zu untersuchen, ob Laden erfolgreich gewesen ist. Belastung kann durch Ausfällen bekannten Bindungsproteinen aus Zellysaten überprüft werden. Effektor-Proteine, wie PAK1 binden an GTP-Rac1 und kann leicht aus Lysaten präzipitiert und durch Western Blotting 8 (2B) erfasst werden. GEFs Substanzen binden Nukleotid freien GTPase den Übergangszustand zu stabilisieren. Wie GEFs sind von geringer Menge, in der Regel nicht aktiv und häufig schlecht auslöschen, ist es besser, ein GEF oder GEF-Fragment zu Test Nukleotid-freien GTPase überexprimieren. Wir verwenden häufig die erste Dbl Homologie von Trio, ausgedrückt als GFP-Fusions (GFP-TrioD1 9) (2B) aber jede GEF funktionieren würde. Proteine, die an der BIP-geladen GTPase binden, sind seltener. Vor kurzem berichteten wir RCC2 als eine solche Protein 7 oder BIP-Belastung kann einfach als bindi validiert werdenng bis weder GEF noch Effektorzellen. Der Ausgang aus dem Experiment wird ein Western-Blot-Darstellung die beiden GFP-markierten Bindungspartner für die GTPase gebunden sein. Durch die Verwendung eines einzelnen Antikörpers, beide Proteine ​​zu erkennen, können die Konzentrationen, bei denen gleiche Mengen der beiden Wettbewerber binden bestimmt und daher die relativen Affinitäten abgeleitet. In diesem Beispiel ist der Wettbewerb zwischen dem Propeller-Domäne des Rac1-Trafficking-Protein Coronin-1C (Rac1-bindenden Protein A) und die Rac1 sequestrierenden Protein RCC2 (Rac1-bindendes Protein B) wird nachgewiesen (3A). Unter Verwendung eines konstanten Volumens Coronin 1C Propeller (5 ul), und das Hinzufügen von steigenden Mengen von RCC2, wir von der GFP sehen auslöschen, dass ein Gleichgewicht bei 1,25-2,5 ul RCC2 (Sternchen) erreicht ist, was zeigt, dass RCC2 hat eine stärkere Affinität für Rac1 als Coronin-1C. Durch Messen der Intensität der Banden mittels quantitativer Western Blot und Aufzeichnen der Mittelwerte für jede competitor kann der Gleichgewichtspunkt genau durch Ermittlung der Mengen an denen die Kurven schneiden (3B) berechnet werden. Eine der möglichen Hindernisse für eine erfolgreiche Konkurrenz-Assay ist, wenn die Bindungspartner miteinander sowie die Bindung an Rac1 binden. In 3A + B zeigen wir den Wettbewerb zwischen RCC2 und Propeller-Domäne von Coronin-1C, anstatt voller Länge Coronin-1C. Der Grund für die Verwendung des trunkierten Coronin dass Coronin 1C bindet ebenfalls RCC2 durch die Schwanzdomäne. Bei voller Länge Coronin-1C gegen RCC2 titriert, Bindung beider Proteine ​​erkannt wird, aufgrund von ternären Komplexbildung, anstatt den Wettbewerb (3C). Wenn Konkurrenz auftritt, wird Bindung eines Proteins, während das andere abnimmt erhöhen und gesamte gebundene GFP-Fusions konstant. In Fällen, in denen ein ternärer Komplex bildet es notwendig ist, eine der GTPase-bindendes Protein abzuschneiden, so dass der competitors nicht mehr interagieren. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/53254/53254fig1.jpg" /> Abbildung 1. Arbeitsablauf. Schematische Darstellung der Arbeitsablauf zur Bestimmung der Affinität der GTPase-bindende Proteine ​​mit Konkurrenz-Assays. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53254/53254fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/53254/53254fig2.jpg" /> Abbildung 2. Validierung von gereinigten Proteinen. (A) gereinigtes GFP-markierten Rac1 bindenden Proteinen durch Western-Blot analysiert, Sondierung mit Anti-GFP, um die relative Ausbeute der beiden Proteine ​​zu bestimmen. Diese Art von Entzerrung während des Experiments kann die Konzentration der beiden Proteine ​​angepasst werden, so dass sie in dem Bindungsexperiment übereinstimmen. (B) GDP, GTPyS und keine Nukleotid-beladenen GST-Rac1 mit Lysat aus HEK293T, die GFP-TrioD1 Proteine ​​durch Auftragen einer endogenen PAK1 oder überexprimiert GFP-TrioD1 erkannt inkubiert und gebunden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53254/53254fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/53254/53254fig3.jpg" /> Abbildung 3. Western-Blot-Analyse der relativen Proteinbindung. Beispiel Ausgaben von Konkurrenz-Bindungs-Assays. (A) BIP belasteten Rac1 wurde mit 5 ul GFP-Coronin-1C-Propellerdomäne gemischt und steigenden Mengen von GFP-RCC2 wurden titriert. Durch Westernblot gebundenen Proteine ​​GFP, sind Probleme mit der Differenzerfassung der beiden Proteine ​​vermieden und das GFP-Signal meldet das Molverhältnis zwischen den beiden Fusionsproteinen. Sternchen zeigen die Wettbewerbsverhältnisse auf either Seite des Gleichgewichtspunkt. (B) Bandenintensitäten von gebundenem GFP-Fusionsproteinen aus drei unabhängigen Experimenten wurden durch quantitative Western-Blotting gemessen, wobei Fluorophor-konjugierten sekundären Antikörpern und Mittelwerte aufgetragen, um die Menge an RCC2 Berechnung erforderlich, um das Gleichgewicht zu erreichen. (C ) Ausgabe aus einem Experiment, wo Rac1-bindende Proteine ​​binden aneinander und bilden einen ternären Komplex, anstatt konkurrierende. BIP belasteten Rac1 wurde mit 5 ul GFP-RCC2 gemischt und steigenden Mengen von GFP-Coronin-1C in voller Länge wurden ohne Verlust an gebundenem GFP-RCC2 titriert. Der Anstieg der gebundenen GFP-Coronin-1C zeigt ternären Komplexbildung. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53254/53254fig3large.jpg" target="_blank">Bitte Klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

Dieses Protokoll vergleicht die relativen Affinitäten von Bindungspartnern für GTPasen der Rho-Familie, einschließlich Rac1. In vivo konkurrieren Rac1-bindende Proteine um eine einzige Bindungsgrenzfläche, deren Konformation durch ein gebundenes Nukleotid bestimmt wird. Das Nukleotid ist aufgrund der hohen Hydrolyserate sowohl wichtig als auch experimentell schwer zu kontrollieren.

Vergleicht man die Affinität der GTPase-bindende Proteine ​​mit Competition-Assays

In this protocol we demonstrate a method for comparing the competition between GTPase-binding proteins. Such an approach is important for determining the ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die relativen Affinitäten von Protein-Bindungspartnern für GTPase-ACEs der Ras-Familie unter sorgfältig kontrollierten Nukleotid-Ladebedingungen zu vergleichen. Dies wird erreicht, indem zunächst mutmaßliche kompetitive Bindungspartner, jeweils markiert mit demselben Tag, beispielsweise grün fluoreszierendem Protein oder GFP, gereinigt werden. Der zweite Schritt besteht in der Reinigung der gewünschten GTPase.Beispielsweise wird RAC1 mit dem geeigneten Nukleotid beladen, um den gewünschten GTPase-Signalisierungszustand zu erreichen. Anschließend wird die mit Nukleotid beladene GTPase mit einer festen Menge eines Bindungskonkurrenten und zunehmenden Mengen des anderen Bindungskonkurrenten inkubiert, um eine Titrations-Bindungskurve zu erhalten. Im letzten Schritt werden die an die immobilisierte GTPase gebundenen Proteine mittels Western Blot aufgetrennt und die Membran für das GFP-Epitop, das von beiden Bindungspartnern geteilt wird, probed.Schließlich dient der Western-Blot dazu, die relativen Konzentrationen zu bestimmen, bei denen ähnliche Mengen jedes GFP-markierten Bindungspartners durch die GTPase gebunden werden. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber etablierten Methoden wie der Co-Präzipitation besteht darin, dass die Protein-Bindungseigenschaften der GTPase durch das gebundene Nukleotid in der Zelle bestimmt werden. Da das gebundene Nukleotid labil ist, erschwert dies die Interpretation der Protein-Bindungsdaten.Beginnen Sie dieses Verfahren mit der Reinigung von GST-markiertem G tpa und der Expression von gtpa-Bindungsproteinen, wie im Textprotokoll beschrieben. Spülen Sie die Flaschen mit transfizierten Zellen mit Phosphatpuffer-Salzlösung oder PBS aus und lassen Sie die Flasche fünf Minuten lang abtropfen. Saugen Sie die freie Flüssigkeit ab und schaben Sie die Zellen in 500 µL Lysepuffer in ein Mikrozentrifugenröhrchen ab. Lysieren Sie die Zellen durch Vorsichtiges Umstülpen bei 4 °C für 30 Minuten.Während der Lyse waschen Sie zwei Portionen von jeweils 40 Mikroliter GFP-Trapping-Perlen dreimal mit frischem Lysepuffer. Sedimentieren Sie die Perlen zwischen den Waschschritten durch Zentrifugation bei 2.700 × g für zwei Minuten. Klären Sie die Lysate nach der Lyse durch Zentrifugation bei 21.000 × g für 10 Minuten.Überführen Sie das geklärte Lysat jedes der konkurrierenden Proteine auf separate gewaschene GFP-Träpperlen. Lassen Sie die GFP-Fusionsproteine zwei Stunden lang unter Rühren durch Inversion bei vier Grad Celsius binden. Waschen Sie die beladenen GFP-Träpperlen zweimal mit Lysepuffer und zweimal mit Konkurrenzpuffer.Puffer zum Binden, bei dem die Kügelchen zwischen den Waschschritten bei 2.700 ×g für zwei Minuten sedimentiert werden. Eluieren Sie die GFP-Fusionsproteine, indem Sie 40 µL 0,2 M Glycin hinzufügen und 30 Sekunden lang auf- und abpipettieren; sedimentieren Sie die Kügelchen anschließend sofort bei 21.000 ×g für 60 Sekunden und überführen Sie die Flüssigkeit in ein neues Zentrifugenröhrchen, das vier µL 1 M Tris-HCl enthält. Führen Sie diesen Schritt schnell durch, um Schäden am gereinigten Protein zu begrenzen. Analysieren Sie je ein µL jedes gereinigten Proteins per Western Blot und verwenden Sie einen anti-GFP-Antikörper, um die relative Ausbeute mithilfe eines quantitativen Blotting-Systems gemäß Herstellerprotokoll zu bestimmen.Stellen Sie die molare Protein-Konzentration durch Zugabe von Konkurrenzbindungs-Puffer ein. Nehmen Sie 90 Mikroliter des hergestellten GST-Rack-1-Beads und waschen Sie diese dreimal mit Nukleotid-Ladepuffer, wobei Sie bei jedem Schritt einen magnetischen Partikel-Sortierer verwenden, um die Beads auszufällen. Aspirieren Sie den Puffer von den Beads und fügen Sie 100 Mikroliter Nukleotid-Ladepuffer hinzu, abhängig davon, ob eine Beladung mit G-D-P-G-T-P oder keine Nukleotidbeladung erforderlich ist.Für das Wettbewerbsexperiment geben Sie 12 µL 100 Millimolar GDP, 12 µL 10 Millimolar GTPγS oder kein Nukleotid zu 60 µL GST-Raf1-Beads für die Nukleotid-Ladungskontrollen hinzu. Verteilen Sie die restlichen Beads auf drei Portionen zu je 10 µL und geben Sie 2 µL 100 Millimolar GDP, 2 µL 10 Millimolar GTPγS oder kein Nukleotid zu jedem Ansatz. Inkubieren Sie die Bead-Gemische 30 Minuten bei 30 °C unter Schütteln.Stabilisieren Sie das gebundene Nukleotid-Rack durch Zugabe von einem molaren Magnesiumchlorid zur experimentellen Mischung und den Kontrollmischungen, um die Wettbewerbsbindung durchzuführen. Bereiten Sie sechs Mikrozentrifugenröhrchen vor, von denen jedes 200 Mikroliter Wettbewerbsbindungs-Puffer enthält.Jeder Kolben sollte außerdem 10 µL des Nukleotid-beladenen Racks, eine Perle und 5 µL des Racks enthalten. Geben Sie 0, 1, 2, 0,55, 10 oder 20 µL des Racks 1 Bindungsproteins B als variabels Bindungsprotein sowie jeweils eine konstante Menge von Bindungsprotein A zu jedem Kolben hinzu. Diese Volumina setzen annähernd gleiche Stammlösungskonzentrationen der konstanten und variablen Bindungsproteine voraus und müssen gegebenenfalls angepasst werden.Füllen Sie das Gesamtvolumen der Bindungsmischung durch Zugabe des Konkurrenzbindungs-Puffers auf 235 Mikroliter auf. Bereiten Sie anschließend ein Mikrozentrifugenröhrchen mit 200 Mikrolitern des Konkurrenz-Puffers vor. Geben Sie 10 Mikroliter experimentelle Nukleotid-beladene Rack-eins-Perlen und 10 Mikroliter Rack-eins-Bindungsprotein A hinzu. Bereiten Sie danach die G-D-P-G-T-P gamma S- und die Nukleotid-freie Kontrollröhrchen wie im Textprotokoll beschrieben vor.Die Röhrchen zwei Stunden bei vier Grad Celsius inkubieren und während der Inkubation durch Vorsichtiges Umstülpen mischen. Die Kügelchen dreimal mit dem Konkurrenzbindungs-Puffer waschen. Schließlich die gebundenen Proteine in 20 Mikrolitern reduzierendem Probenpuffer eluieren.Die quantitative Westernblot-Analyse des GFP-Tags der gereinigten GFP-RCC2- und GFP-Corona1C-Propeller-Domäne zeigt, dass das Protein in dem oberen Band, GFP-RCC2, 1,4-mal stärker vertreten ist als das in dem unteren Band und verdünnt werden muss, um ein molares Verhältnis von eins zu eins für das Wettbewerbsexperiment zu erreichen. Ein Kontrollexperiment zeigt, dass der Nukleotid-Beladungszustand von Rack1 die Bindungsspezifität bestimmt, indem zunehmende Volumina von GFP-RCC2 gegen ein festes Volumen äquimolarer GFP-Corona1C-Propeller-Domäne titriert und anschließend geblottet wird. Die Proteine, die an Rack1 binden, ermöglichen es, relative Änderungen der gebundenen Proteine sichtbar zu machen, indem die GFP-Bandintensitäten beider Konkurrenten in einem gemeinsamen Diagramm dargestellt werden. Durch Identifizierung des Schnittpunkts der Kurven lässt sich das Volumen des variablen bindenden Proteins im Gleichgewicht bestimmen.Es ist jedoch darauf zu achten, dass Probleme wie Wechselwirkungen zwischen Konkurrenten oder ein Überschuss an Bait-GTPA das Experiment nicht beeinträchtigen. Ein Anstieg eines Konkurrenten ohne Verlust des anderen, wie hier gezeigt, weist auf ein Problem während des Durchführens dieses Verfahrens hin. Es ist wichtig, darauf zu achten, dass eine reziproke Beziehung zwischen der Häufigkeit der konkurrierenden Bindungspartner besteht.Es gibt eine Reihe von Problemen, die die Ergebnisse verfälschen können, die sich jedoch beheben lassen, solange sie durch die Überprüfung der Daten erkannt werden.

comparing-affinity-gtpase-binding-proteins-using-competition

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Das hier vorgestellte Verfahren beschreibt ein Assay zur spezifischen Aktivierung von RhoA GDP / GTP (GEFs) in kultivierten Zellen unter Verwendung eines mutierten RhoA GST-Fusionsprotein, das eine hohe Affinität für aktiviert GEFs hat folgen. GEFs aus Zelllysaten durch Western-Blotting und quantifiziert durch Densitometrie erkannt ausgefällt.

Affinity Niederschlag von Active Rho-GEFs Mit Hilfe eines GST-markiertes Mutant Rho-Protein (GST-RhoA (G17A)) aus epithelialen Zelllysate

Dieses Video zeigt einen Wettbewerbsassay zur Untersuchung von GTPase-bindenden Proteinpartnern. Unter Verwendung von nukleotidgebundenem GTPase-Protein, das auf magnetischen Beads immobilisiert ist, kann die kompetitive Bindung zwischen zwei interagierenden Proteinpartnern für dieselbe Bindungsstelle auf der GTPase untersucht werden, um die Bindungsaffinitäten der Proteinpartner zu beurteilen.

Wettbewerbsbindungsassay zur Untersuchung konkurrierender GTPase-bindender Proteinpartner

Die dynamische Differential-Fluorimetrie ist eine weit verbreitete Methode zum Screening von Bibliotheken kleiner Moleküle auf Wechselwirkungen mit Proteinen. Hier stellen wir eine einfache Methode vor, um diese Analysen zu erweitern, um eine Schätzung der Dissoziationskonstante zwischen einem kleinen Molekül und seinem Proteinpartner zu erhalten.

Bestimmung der Protein-Ligand-Wechselwirkungen mit Differential Scanning Fluorimetrie

Die Proteinphosphorylierung ist ein zentrales Merkmal der Art und Weise, wie Zellen Informationen in ihrem extrazellulären Milieu interpretieren und darauf reagieren. Hier stellen wir ein Hochdurchsatz-Screening-Protokoll vor, bei dem Kinasen verwendet werden, die aus Säugetierzellen gereinigt wurden, um schnell Kinasen zu identifizieren, die ein oder mehrere Substrate von Interesse phosphorylieren.

Identifikation von Kinase-Substrat-Pairs Mit High Throughput Screening

Guanosintriphosphat (GTP) -Bindung ist eine der frühesten Ereignisse in der G-Protein-Coupled Receptor (GPCR) -Aktivierung. Dieses Protokoll beschreibt die pharmakologisch charakterisierende spezifische GPCR-Ligand-Wechselwirkungen durch die Überwachung der Bindung des radioaktiv markierten GTP-Analogs [ 35 S] Guanosin-5'-O- (3-thio) triphosphats ([ 35 S] GTPγS) in Antwort auf einen Liganden von Interesse.

Messung der G-Protein-gekoppelten Rezeptorsignalisierung über radioaktiv markierte GTP-Bindung

Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren, um die Fähigkeit eines Proteins zu testen, mit filamentösem Actin (F-Aktin) zu coedimieren und, falls die Bindung beobachtet wird, die Affinität der Wechselwirkung zu messen.

Messung der Proteinbindung an F-Aktin durch Co-Sedimentation

Hier beschreiben wir ein Protokoll, um die Prenylation und Guanosin-5'-Triphosphat (GTP) untersuchen-Laden von Rho GTPase. Dieses Protokoll besteht aus zwei detaillierte Methoden, nämlich Membran Fraktionierung und ein GTPase verbundene Immunosorbentprobe assay. Das Protokoll kann verwendet werden, zur Messung der Prenylation und GTP Laden von verschiedenen anderen kleinen GTPasen.

Erkennung von kleine GTPase Prenylation und GTP binden mit Membran Fraktionierung und GTPase verbundene Immunosorbentprobe Assay

Ein Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid (NADH)-gekoppelter ATPase-Assay wurde an das semihohe Durchsatzscreening von kleinen Molekül-Myosininhibitoren angepasst. Dieser kinetische Assay wird in einem 384-Well-Mikroplattenformat mit einem Gesamtreaktionsvolumen von nur 20 l pro Brunnen ausgeführt. Die Plattform sollte für praktisch jedes ADP-produzierende Enzym gelten.

Eine semi-High-Throughput-Anpassung des NADH-gekoppelten ATPase-Assays zum Screening kleiner Molekülinhibitoren

Da GPCRs attraktive arzneimittelfähige Ziele sind, ist das GPCR-Ligandenscreening daher für die Identifizierung von Bleiverbindungen und für Deorphanisierungsstudien unerlässlich. Im Rahmen dieser Bemühungen beschreiben wir PRESTO-Tango, eine Open-Source-Ressourcenplattform, die für die gleichzeitige Profilierung der vorübergehenden Rekrutierung von "Arrestin2" bei ca. 300 GPCRs mit einem TEV-basierten Reportertest verwendet wird.

Parallele Vernehmung der Rekrutierung von '-Arrestin2 für Ligand Screening auf einer GPCR-weiten Skala mit PRESTO-Tango Assay

Der Differential Radial Capillary Action of Ligand Assay (DRaCALA) kann verwendet werden, um kleine ligandenbindende Proteine eines Organismus unter Verwendung einer ORFeome-Bibliothek zu identifizieren.

Identifizierung der Bindungsproteine kleiner Liganden mit der differentiellen radialen Kapillarwirkung des Ligandenassays (DRaCALA)

Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung von BRET-basierten Biosensoren zur Echtzeitmessung der G-Protein-Aktivierung in lebenden HEK293-Zellen nach Stimulation durch G-Protein-gekoppelte Rezeptorliganden. Hier dienen der β2-adrenerge Rezeptor und der Cannabinoid-Typ-1-Rezeptor als Beispiele, um die Effizienz von Sensoren für mehrere G-Protein-Subtypen und über verschiedene GPCRs hinweg zu demonstrieren.

BRET-basierte G-Protein-Biosensoren zur Messung der G-Protein-gekoppelten Rezeptoraktivität in lebenden Zellen

Lernen Sie Competition-Assays zur Analyse der Bindungsaffinität von Rho-Familie-GTPasen wie Rac1 unter kontrollierten Nukleotid-Bedingungen mittels Western Blot.

Vergleicht man die Affinität der GTPase-bindende Proteine ​​mit Competition-Assays

Weitere Videos entdecken

Vergleicht man die Affinität der GTPase-bindende Proteine mit Competition-Assays