Lipidvesikel-vermittelte Affinitätschromatographie unter Verwendung von Magnetic Activated Cell Sorting (LIMACS): Eine neue Methode zur Protein-Lipid-Wechselwirkungen Analyze

Um die Wechselwirkung eines Proteins mit seiner Ziel-Lipid verwendeten wir MACS und Annexin V-konjugierten magnetischen Kügelchen und Lipid-Vesikel, die aus der Ziel-Lipid-und Annexin V-Bindung Phosphatidylserin synthetisiert testen. Gebundene Proteine ​​zum Ziel Lipid sind co-gereinigt und analysiert nach der Elution von den Beads.

Dieses Experiment dient der Identifizierung von Lipid-bindenden Proteinen und der Analyse der Lipidprotein-Interaktion in einer definierten Membranumgebung von Lipid-Sles-Proteinen des Zellhomogenats werden mit den frisch präparierten Lipidvesikeln aus Phosphatwaden und Ceramid inkubiert. Das Reaktionsgemisch wird dann mit einem Xin V konjugierten magnetischen Kügelchen ergänzt, um das mit den Lipidvesikeln assoziierte Protein an den magnetischen Kügelchen zu verankern. Als nächstes werden Protein-Lipid-Vesikel durch magnetisch aktivierte Zellsortierung gereinigt.

Um die Ergebnisse des lipidgebundenen Proteins zu identifizieren, verwenden Sie die SDS-Seite Western Blotting, um die Lyxreinigung von endogenen und rekombinanten atypischen PKC und eine spezifische Ceramid-Bindungsdomäne zu zeigen, die in MDCK-Zellen exprimiert wird. Der Hauptvorteil dieser neuartigen Technik gegenüber bestehenden Methoden wie Eliza oder Plasmaresonanzspektroskopie wie der Oberflächenbindung besteht darin, dass die Lipidprotein-Interaktion in einer membranähnlichen Umgebung erreicht wird und dass die Bindungsproteine gereinigt und analysiert werden können. Die Auswirkungen dieser Technik erstrecken sich auf die Therapie und Diagnose von Krankheiten, an denen Lipide beteiligt sind, da bei diesen Erkrankungen die physiologische Lipidprotein-Interaktion beeinträchtigt ist.

Für einige dieser Krankheiten sind die Proteinziele nicht einmal bekannt und müssen identifiziert werden. Um eine lipidbasierte Therapie zu entwickeln, beginnen Sie mit Lipidseln, die aus einer getrockneten Mischung aus Äquimolaren, Mengen Phosphatidylwaden und C 16-Ceramid in 100 Mikrolitern sical-Puffer hergestellt werden. Nach Zugabe von 300 Mikrolitern iCal-Puffer, ergänzt mit 0,1 Millimolar Manganchlorid, wird die Proben eine Stunde lang bei 12.000 g und 20 Minuten bei vier Grad Celsius zentrifugiert, dann das Pellet der großen Lipidvesikel in 100 Mikrolitern sical-Puffer resuspendiert. Fügen Sie ein Nanomolar des vibrierenden cm-DII-Fluoreszenzfarbstoffs hinzu und inkubieren Sie eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius, um die Visualisierung der SLE-Fraktion nach maximaler Trennung zu erleichtern, gewinnen Sie ein rosa Pellet aus vibrierendem cm-dai-gefärbtem Phosphat, ein syrisches Ceramid-Sles durch Zentrifugation und Resus in 100 Mikrolitern Tris-Puffer aus.

Als nächstes, zur Herstellung eines detergenzienfreien Zelllysats beschallen Zellen in 300 Mikrolitern hypertonen Puffers von 10 millimolaren Tris, Chlorwasserstoff enthaltenden Protease- und Phosphatase-Hemmern und Zentrifuge. Um membranöse Trümmer zu entfernen, geben Sie nun das klare Zelllysat in die physikalische Lipidsuspension und inkubieren Sie die Mischung zwei Stunden lang bei vier Grad Celsius. Da Zelllysate endogene Membranen mit Phosphat Aerin enthalten können, wird empfohlen, das Lysat durch zusätzliche Zentrifugationsschritte von diesen Membranen zu entfernen.

Ergänzen Sie das Reaktionsgemisch mit 20 Mikrolitern eines XNV-Bindungspuffers und 50 Mikrolitern einer Lösung, die magnetische Beads enthält, die eine Stunde lang bei vier Grad Celsius an ein XNV-Inkubat konjugiert wurden, und führen Sie die magnetisch aktivierte Zellsortierung durch, wie im Protokoll des Herstellers empfohlen. Überwachen Sie als Nächstes die lebendige CM-DII-Fluoreszenz in den Durchfluss- und Elutionsfraktionen mit einem Mikroplatten-Fluoreszenz-Reader, um das Vorhandensein und die Menge von Lipid-LES in einem Antikörper-Konkurrenzassay zu bestimmen. Um die Spezifität der Bindungsreaktion von A PKC für die Ceramidphopho-Seine-Vesikel zu überprüfen, inkubieren Sie ein Mikrogramm des polyklonalen Anti-P-KC-Zeta-Kaninchen-Antikörpers mit einem Zelllysat für eine Stunde bei vier Grad Celsius, gefolgt von einer Inkubation mit den Lipidvesikeln.

Fahren Sie fort mit der SDS-Seite und der Immunblotting-Analyse der Proteinbindung an die Ceramidphosphat-Serin-Vesikel im max. Eluat für die In-vitro-Rekonstitution eines Lipidprotein-Polaritätskomplexes, beginnen Sie mit einer rosa Pellet-Zubereitung aus lebendigen cm DII-gefärbten Phosphat-Serian-Ceramid-Vesikel, wie zuvor gezeigt, reus suspendieren Sie die Vesikel in 100 Mikrolitern Tri-Puffer, ergänzt mit 100 mikromolaren gamma S GT P ein Millimolar, GDP und einer Kombination von rekombinanten Proteinen von Interesse. Dann inkubieren Sie die Reaktion drei Stunden lang bei vier Grad Celsius. Als nächstes fügen Sie fünf Mikroliter einer 20-fachen Stammlösung eines X in V-Puffers und 50 Mikroliter eines konjugierten magnetischen X-in-V-Beads hinzu.

Inkubieren Sie die Mischung unter leichtem Rühren weitere 30 Minuten bei vier Grad Celsius. Führen Sie weiterhin die magnetisch aktivierte Zellsortierung NX NV durch, wie im Protokoll des Herstellers empfohlen, um die Ausfällung zu erleichtern. Ergänzung der Elutionsfraktion mit 10 Mikrogramm reinem E-Albumin.

Konzentrieren Sie die Proteine durch Weyl-Rauchfällung. Die untere Phase besteht aus Chloroform-Methanol mit angereichertem vibrierendem cm dii. Die bräunliche Interphase enthält die magnetischen Kügelchen und das gefällte Protein.

Quantifizieren Sie die Ellu-Lipid-Vesikel durch Nachweis von rosafarbenem, lebendigem cm dii in der organischen Chloroform-Methanol-Phase der Weyl-Grippe-Reaktion. Verwenden Sie gleiche Mengen an Lipidvesikeln, um die Proteinmengen zwischen den Proben zu normalisieren und anhand der SDS-Seite zu analysieren. Immun-Blotting.

Ein detergentifreies Lysat von MDCK-Zellen, das PKC Zetta C in voller Länge exprimiert und terminally an ein grün fluoreszierendes Protein oder eine Ceramid-Bindungsdomäne gebunden ist. Im C-Terminus von pkc. Zetta wurde mit Phosphowaden inkubiert.

Ceramid-Vesikel nach Elucian der max-Säule wurden Proteine mittels Immunoblotting analysiert. Das Ceramid-Bindungsfragment C 20 Zeta, EGFP und P KC Zeta in voller Länge wurden aus dem EIT der max-Säule gewonnen, was mit der Spezifität und Wirksamkeit des Lyx-Verfahrens übereinstimmt. Die Negativkontrolle EGFP, die nicht an Phosphat, unsere syrischen Ceramid-Vesikel, bindet, war in der eit nicht nachweisbar.

Wenn Linx mit anderen Methoden wie SDS-Seite und Western Blot oder Proteomik-Analyse ergänzt wird, können zusätzliche Fragen beantwortet werden, z. B. welche Proteine sich im lipidbindenden Proteinkomplex befinden. Nach seiner Entwicklung hat LabX den Weg für Forscher im Forschungsbereich S-Einzellipide geebnet, um die Ceramid-induzierte Apoptose und Zellpolarität in neurologischen Stamm- und Epithelzellen zu erforschen.