Name: Lipidvesikel-vermittelte Affinitätschromatographie unter Verwendung von Magnetic Activated Cell Sorting (LIMACS): Eine neue Methode zur Protein-Lipid-Wechselwirkungen Analyze (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-26T16:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 33 s
Description: Erfahren Sie die LIMACS-Methode zur Analyse von Protein-Lipid-Wechselwirkungen unter Verwendung von Magnetic Activated Cell Sorting. Diese Technik ermöglicht die Aufreinigung und Untersuchung von Lipid-bindenden Proteinen in einer membranähnlichen Umgebung.

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Diese Arbeit wurde durch die NIH gewährt R01NS046835 und R01AG034389 und der March of Dimes gewähren 6FY08-322 unterstützt. Ein besonderer Dank an Frau Eleanor Brown (Miltenyi Biotec, Auburn, CA), die enorm mit ihren Einsichten halfen in die MACS-Technologie gewidmet ist. Miltenyi hat großzügig das Material für die Demonstration der Experimente ohne Kosten verwendet werden, vorausgesetzt. Ich bin auch dankbar, dass Dr. Guanghu Wang (Medical College of Georgia / Georgia Health Sciences University, Augusta, GA), die PKCζ exprimierende Zelllinien generiert. Unterstützung durch das Institut für Molekulare Medizin an der Medical College of Georgia / Georgia Health Sciences University (unter Leitung von Dr. Lin Mei) ist ebenfalls anerkannt.

1. Einführung Die Lipid-Vesikel-vermittelten Affinitätschromatographie unter Verwendung magnetischer Zellsortierung (LIMACS)-Technik wurde in unserem Labor entwickelt zu isolieren Ceramid-associated Protein-Komplexe 1-3. Ursprünglich waren die Lipidvesikel von Ceramid und Phosphatidylserin, die für MACS mit magnetischen Partikel-konjugierten Annexin V (hoch affine zu Phosphatidylserin) zu den Vesikeln und deren assoziierten Proteinen zu isolieren erlaubt hat. Wir haben die LIMACS verwendete Technik für die in vitro Rekonstitution eines Ceramid-assoziierten Polarität komplexer und die Isolierung von Ceramid-bindenden Proteinen aus Zelllysaten 3. LIMACS modifiziert mit anderen Interaktionspartner für die Isolierung der Vesikel (zB Glycolipid-specifc Lektine oder Lipid-Antikörper) sein. 2. Experimentelle Verfahren Herstellung von Lipid-Vesikel und aPKCBinding Assays <ol><li> Lipidvesikel sind aus getrockneten Mischungen von äquimolaren Mengen von Phosphatidylserin (105 ug) und C16-Ceramid (85 ug) folgende modifizierte Verfahren für große Liposomenzubereitung 1,4-7 erhalten. </li><li> Die Lipid-Gemische werden dann resuspendiert und beschallt für 1 h in 100 ul Vesikel Puffer bestehend aus 50 mM Tris / HCl (pH 7,5) und 150 mM NaCl. </li><li> Nach Zugabe von 300 ul Vesikel-Puffer mit 0,1 mM MnCl 2 ergänzt, werden die Proben bei 12.000 μ g für 20 min bei 4 ° C zentrifugiert </li><li> Das Pellet (große Lipidvesikel) ist in 100 ul Vesikel-Puffer resuspendiert und mit 1 nmol Vybrant CM-DII für 1 h bei 37 ° C, um die Vesikelfraktion nach MACS Trennung zu visualisieren. Vybrant CM-DII ist ein roter Fluoreszenzfarbstoff speziell zur Einbindung in Lipidmembranen. </li><li> Ein Waschmittel-free Zelllysat wird durch Beschallung / Homogenisierung von Zellen in 300 ul hypotonischen Puffer (10 mM Tris / HCl (pH 7,0) mit Protease-und Phosphatase-Inhibitoren) durch Entfernung des membranösen Schutt, gefolgt von Zentrifugation vorbereitet. Ein Zentrifugationsschritt bei 100.000 xg für 1 h sollte hinzugefügt werden, um eine Verunreinigung des Zelllysat mit endogenen Membranen, die Phosphatidylserin zu vermeiden. </li><li> Das geklärte Lysat wird auf die Lipid-Vesikel Suspension zugegeben und das Gemisch wird für 2 h bei 4 ° C inkubiert </li><li> Das Reaktionsgemisch wird mit 20 ul 20x Annexin V-Bindungspuffer und 50 ul einer Lösung mit magnetischen Beads konjugiert Annexin V ergänzt, gefolgt von Inkubation für 1 h bei 4 ° C. </li><li> MACS ist nach Angaben des Herstellers (Miltenyi Biotec, Inc.) Protokoll durchgeführt. Das Vorhandensein und die Menge der Lipid-Vesikel wird durch die Überwachung der Vybrant CM-DII Fluoreszenz in den Flow-Through-und Elutionsfraktionen mit einem Mikrotiterplatten-Fluoreszenz-Reader bestimmt. </li><li> Die lineare Korrelation zwischen der Höhe der vesikulären Lipid-und Fluoreszenz-Intensität der Vesikel-gebundenem Vybrant CM-DII wird durch quantitative Hochleistungs-Dünnschichtchromatographie (HPTLC) der Lipid-Gemisch aufgetragen, um Annexin V-basierten Macs überprüft. </li><li> Die Spezifität der Bindungsreaktion aPKC oder andere Proteine, die Ceramid / Phosphatidylserin Vesikel wird durch einen Antikörper Kompetitionsassay mit 1 ug anti-PKCζ polyklonalen Kaninchen-Antikörpers gegen das Zelllysat für 1 h bei 4 ° C inkubieren vor der Inkubation mit verifizierten die Lipid-Vesikel. </li><li> Die Proteinbindung an Ceramid / Phosphatidylserin Vesikel in der MACS Eluat wird durch SDS-PAGE und Immunoblot analysiert. </li></ol> In-vitro-Lipid-Protein-Komplex Polarität <ol><li> Die in vitro Rekonstitution eines Lipid-Protein-Polarität Komplex ist nach dem LIMACS Verfahren wie im vorherigen Abschnitt beschrieben, durchgeführt. In kurzen, Phosphatidylserin (420 ug) und C16-Ceramid (107 ug) wird aus organischen Lösungsmittel getrocknet. </li><li> Die getrockneten Lipide sind unter Beschallung in 500 ul der Vesikel-Puffer (; 150 mM NaCl 50 mM Tris / HCl, pH 7,5) resuspendiert. </li><li> Fünf ul 10 mM MnCl 2, 1 ul Vybrant CM-DII, und 500 ng PKCζ (humaner rekombinanter) wird zugegeben und das Reaktionsgemisch inkubiert undergentle Agitation für 60 min bei 4 ° C. </li><li> Vybrant CM-DII gebeizt Phosphatidylserin / Ceramid Vesikel werden durch Zentrifugation bei 12.000 xg für 60 min bei 4 ° C wieder </li><li> Das Pellet (pink) wird in 100 ul Tris-Puffer und ergänzt mit γS-GTP (100 uM), BIP (1 mM), GST-Par6 (100 ng), oder GST-Cdc42 (500 ng) und weitere 3 inkubiert h bei 4 ° C (jede andere Kombination von rekombinanter Proteine ​​von Interesse kann hier eingesetzt werden). </li><li> Annexin V-Puffer (5 ul einer 20x Stammlösung) und Annexin V-konjugierten magnetischen Beads (50 ul) zugegeben und die Reaktionsmischung unter leichtem Schütteln für weitere 30 min bei 4 ° C inkubiert </li><li> Annexin V-MACS ist im Anschluss an die Lieferanten-Protokoll wie oben beschrieben durchgeführt. </li> Die Elutionsfraktion (1 ml) wird mit 10 pg des reinen Ovalbumin als Niederschlag Hilfe ergänzt. Das Protein wird durch Wessel-Flügge Fällung konzentriert und analysiert SDS-PAGE/immunoblotting wie zuvor 8 beschrieben. <li> Die Menge der eluierten Lipidvesikel wird durch den Nachweis von Vybrant CM-DII (rosa) in der organischen (Chloroform / Methanol) Phase des Wessel Flügge Fällungsreaktion quantifiziert. Die Menge an Protein analysiert wird auf gleiche Mengen von Lipidvesikeln normalisiert. </li></ol> 3. Ergebnisse LIMACS Reinigung von PKCζ-EGFP und die Ceramid-bindende Domäne C20ζ-EGFP Ein Waschmittel-free Lysat von MDCK-Zellen, die in voller Länge PKCζ C-terminal in Verbindung mit grün fluoreszierende Protein (FLζ-EGFP) oder Ceramid-bindende Domäne in der C-Terminus von PKCζ (C20ζ-EGFP) wurde mit Phosphatidylserin / Ceramid Vesikeln inkubiert beschrieben in experimentelle Verfahren. Nach der Elution der MACS-Säule wurde Protein analysiert mittels Immunoblot und Antikörper gegen PKCζ und EGFP für die Detektion der eluierten Protein 2. <img src="/files/ftp_upload/2657/2657fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. LIMACS von EGFP-markierten PKCζ und seine C-terminale Fragment C20ζ mit Phosphatidylserin / Ceramid Vesikel. Waschmittel-free Lysaten von MDCK-Zellen, die EGFP (als eine unverbindliche Regelung), in voller Länge PKCζ-EGFP oder der Ceramid Bindung, C-terminale Fragment C20ζ-EGFP wurden mit Phosphatidylserin / Ceramid Vesikeln inkubiert, wie in den experimentellen Verfahren beschrieben . Nach der Verwendung LIMACS, wurde Protein mit SDS-Probenpuffer eluiert und durch SDS-PAGE und Immunoblot. Die linke Tafel zeigt, dass EGFP nicht auf die Vesikel mit der Annexin V-linked magnetischen Kügelchen zurückgehalten zu binden. Die mittlere und rechte Bild zeigt die volle Länge PKCζ-EGFP und C20ζ-EGFP wurden durch die Bindung an Ceramid beibehalten.

<ol><li>Wang, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+binding+to+ceramide+activates+protein+kinase+Czeta+before+the+formation+of+a+pro-apoptotic+complex+with+PAR-4+in+differentiating+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Direct binding to ceramide activates protein kinase Czeta before the formation of a pro-apoptotic complex with PAR-4 in differentiating stem cells.</a> J Biol Chem. 280, 26415-26424 (2005).</li>
<li>Wang, G., Krishnamurthy, K., Umapathy, N. S., Verin, A. D., Bieberich, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+carboxyl-terminal+domain+of+atypical+protein+kinase+Czeta+binds+to+ceramide+and+regulates+junction+formation+in+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The carboxyl-terminal domain of atypical protein kinase Czeta binds to ceramide and regulates junction formation in epithelial cells.</a> J Biol Chem. 284, 14469-14475 (2008).</li>
<li>Chalfant, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De+novo+ceramide+regulates+the+alternative+splicing+of+caspase+9+and+Bcl-x+in+A549+lung+adenocarcinoma+cells.+Dependence+on+protein+phosphatase-1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">De novo ceramide regulates the alternative splicing of caspase 9 and Bcl-x in A549 lung adenocarcinoma cells. Dependence on protein phosphatase-1.</a> J Biol Chem. 277, 12587-12595 (2002).</li>
<li>Simon, C. G., Holloway, P. W., Gear, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exchange+of+C%2816%29-ceramide+between+phospholipid+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Exchange of C(16)-ceramide between phospholipid vesicles.</a> Biochemistry. 38, 14676-14682 (1999).</li>
<li>Goni, F. M., Contreras, F. X., Montes, L. R., Sot, J., Alonso, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biophysics+%28and+sociology%29+of+ceramides%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Soc+Symp%22%5BJournal%5D)">Biophysics (and sociology) of ceramides.</a> Biochem Soc Symp. , 177-188 (2005).</li>
<li>Kumagai, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CERT+mediates+intermembrane+transfer+of+various+molecular+species+of+ceramides%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">CERT mediates intermembrane transfer of various molecular species of ceramides.</a> J Biol Chem. 280, 6488-6495 (2005).</li>
<li>Wessel, D., Flugge, U. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+the+quantitative+recovery+of+protein+in+dilute+solution+in+the+presence+of+detergents+and+lipids%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">A method for the quantitative recovery of protein in dilute solution in the presence of detergents and lipids.</a> Anal Biochem. 138, 141-143 (1984).</li>
</ol>

Um zu testen, die spezifische Interaktion zwischen einem Lipid-und Protein wird durch die Einbettung von Lipiden in der Zellmembran behindert. Die Zellmembran besteht aus einer Mischung von mehreren Lipiden und Proteinen, und es ist in Lipid-Mikrodomänen oder Flöße organisiert. Daher kann die Co-Reinigung von Mikrodomänen und Proteine ​​nicht klar unterscheiden, ob ein Protein direkt bindet an ein Lipid oder nur in einem Mikrodomänenstruktur bereichert. Andere Methoden anhand definierter Lipide auf Oberflächen wie Lipid...

Annexin V-konjugierten magnetischen Beads und MACS Mikro-und Minisäulen wurden von Miltenyi Biotec, Inc. (Auburn, CA) zur Verfügung gestellt. Alle Lipide wurden von höchster Reinheit und erhielt von Avanti Polar Lipids (Alabaster, AL).

lipidvesikel-vermittelte affinitätschromatographie unter verwendung von magnetic activated cell sorting (limacs): eine neue methode zur protein-lipid-wechselwirkungen analyze

Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting (LIMACS): a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction

Die Analyse der Lipid-Protein-Wechselwirkung ist schwierig, da Lipide in Zellmembranen eingebettet sind und somit nicht zugänglich sind, die meisten Reinigungsverfahren. Als Alternative können Lipide auf flachen Oberflächen beschichtet werden, wie für die Lipid-ELISA und Plasmon-Resonanz-Spektroskopie eingesetzt. Allerdings tun Oberflächenbeschichtung Lipide bilden keine Mikrodomänenstruktur Strukturen, die möglicherweise für die Lipid-bindenden Eigenschaften wichtig. Darüber hinaus sind diese Methoden nicht für die Reinigung von größeren Mengen an Proteinen Bindung an ihr Ziel Lipide ermöglichen. Zur Überwindung dieser Grenzen testen Lipid-Protein-Interaktions-und Lipid-bindende Proteine ​​zu reinigen entwickelten wir eine neuartige Methode bezeichnet Lipidvesikel-vermittelte Affinitätschromatographie unter Verwendung magnetischer Zellsortierung (LIMACS). In diesem Verfahren werden Lipidvesikel mit dem Ziel Lipid Phosphatidylserin und als Anker für die Lipid-Annexin V MACS vorbereitet. Phosphatidylserin ist ein allgegenwärtiges Zellmembran Phospholipid, die eine hohe Affinität zum Protein Annexin V. Mit Magnetic Beads konjugiert Annexin V die Phosphatidylserin-enthaltende Lipid-Vesikel werden die magnetischen Kügelchen binden zeigt. Wenn die Lipid-Vesikel mit einer Zelle inkubiert Lysat die Proteinbindung an die Ziel-Lipid wird auch auf die Kügelchen gebunden und kann co-gereinigt werden mittels MACS. Diese Methode kann auch verwendet werden, um zu testen, ob rekombinanten Proteinen rekonstituieren einen Protein-Komplex Bindung an die Ziel-Lipid. Wir haben diese Methode benutzt, um die Interaktion von atypischen PKC (aPKC) mit den Sphingolipid Ceramid und die Zusammenarbeit zu reinigen Prostata Apoptose Antwort 4 (PAR-4), ein Protein-Bindung an Ceramid-assoziierten aPKC zeigen. Wir haben auch diese Methode für die Wiederherstellung eines Ceramid-assoziierten Komplex von rekombinanten aPKC mit der Zellpolarität-verwandte Proteine ​​Par6 und Cdc42 verwendet. Da Lipidvesikel mit einer Vielzahl von Sphingo-oder Phospholipiden hergestellt werden können, bietet LIMACS eine vielseitige Test für die Lipid-Protein-Wechselwirkung in einer Lipid-Umgebung, die sehr ähnlich ist, dass der Zellmembran. Weitere Lipid-Protein-Komplexe können unter Verwendung Proteomanalyse von Lipid-bindenden Proteins mit der Lipid-Vesikel co-gereinigt werden.

Um die Wechselwirkung eines Proteins mit seiner Ziel-Lipid verwendeten wir MACS und Annexin V-konjugierten magnetischen Kügelchen und Lipid-Vesikel, die aus der Ziel-Lipid-und Annexin V-Bindung Phosphatidylserin synthetisiert testen. Gebundene Proteine ​​zum Ziel Lipid sind co-gereinigt und analysiert nach der Elution von den Beads.

Lipidvesikel-vermittelte Affinitätschromatographie unter Verwendung von Magnetic Activated Cell Sorting (LIMACS): Eine neue Methode zur Protein-Lipid-Wechselwirkungen Analyze

Die Analyse der Lipid-Protein-Interaktion ist schwierig, da Lipide in Zellmembranen eingebettet sind und daher für die meisten Reinigungsverfahren unzugänglich sind ...

Dieses Experiment dient der Identifizierung von Lipid-bindenden Proteinen und der Analyse der Wechselwirkung zwischen Lipiden und Proteinen in einer definierten Membranumgebung. Proteine von Lipid-Schichten aus Zellhomogenat werden mit frisch hergestellten Lipidvesikeln aus Phosphatidylserin und Ceramid inkubiert. Anschließend wird das Reaktionsgemisch mit an magnetische Kügelchen konjugiertem Xin V ergänzt, um die an die Lipidvesikel gebundenen Proteine an den magnetischen Kügelchen zu verankern. Danach werden die Protein-Lipid-Vesikel mittels magnetischer Aktivierungszellseparation gereinigt.Um das lipidgebundene Protein anhand der dargestellten Ergebnisse zu identifizieren, verwenden Sie die SDS-Page-Western-Blotting-Methode, um die Lyx-Reinigung endogener und rekombinanter atypischer PKC sowie einer spezifischen Ceramid-bindenden Domäne nachzuweisen, die in MDCK-Zellen exprimiert sind. Der Hauptvorteil dieser neuartigen Technik gegenüber bestehenden Methoden wie ELISA oder Plasmonenresonanzspektroskopie zur Oberflächenbindung besteht darin, dass die Lipid-Protein-Interaktion in einer membranähnlichen Umgebung erfolgt und dass die bindenden Proteine gereinigt und analysiert werd

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