Name: Cellular Lipidextraktion für Targeted Stable Isotope Dilution Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie-Analyse (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-17T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 26 s
Description: Erfahren Sie die zelluläre Lipidextraktion für präzise Quantifizierung bioaktiver Fettsäuren mittels Stable Isotope Dilution LC-MS. Diese Methode ermöglicht genaue Einblicke in zelluläre enzymatische Stoffwechselwege.

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Die meisten derzeit verfügbaren bioanalytischen Methoden zur Messung bioaktiver Lipide sind nicht so umfangreich, da sie keine chirale Normalphasenchromatographie oder SID beinhalten. Die chirale Normalphasen-LC ist entscheidend für die Trennung von Enantiomeren und für die Unterscheidung zwischen Enzym- und ROS-vermitteltem Metabolismus. Die Verwendung von SID stellt sicher, dass menschliches Versagen oder Komplikationen, die bei der Extraktion oder Analyse auftreten, bei der Quantifizierung berücksichtigt werden. Diese zusätzlichen Komponenten machen sie zusammen mit ECAPCI-MRM zur empfindlichsten und selektivsten Methode für die Analyse bioaktiver Lipide.

1. Standard- und interne Standardmischungen
<ol>
	<li>Vor der Lipidextraktion muss man eine Standardmischung (SM) und eine interne Standardmischung (ISM) herstellen. Für die SM aliquotiert das äquivalente Volumen von 1 μg jedes Standards (insgesamt 25), das in der nachstehenden Reagenzientabelle aufgeführt ist, unter Verwendung einer kalibrierten Spritze in einen 10-ml-Messkolben. Die Standards werden unter Stickstoff getrocknet und in 10 ml Acetonitril (ACN) rekonstituiert. Die Endkonzentration der Standardmischung beträgt 100 pg/μl. In 1 mL Aliquot aufteilen und bis zur Verwendung bei -80 °C lagern.</li>
	<li>Aus dieser Standardmischung können 6 Standardverdünnungen für insgesamt 7 Kalibrierstandards (1 pg/μL, 2 pg/μL, 5 pg/μL, 10 pg/μL, 20 pg/μL, 50 pg/μL und 100 pg/μL) hergestellt werden. Diese Standards sind mit jeder Probencharge durchzuführen, die vorbereitet wurde, um die Kalibrierkurve zu entwickeln, die in der quantitativen Analyse verwendet wird.</li>
	<li>Für die ISM aliquotieren Sie das äquivalente Volumen von 1 μg jedes IS (14 insgesamt), das in der nachstehenden Reagenzientabelle aufgeführt ist, unter Verwendung einer kalibrierten Spritze in einen 10-ml-Messkolben und trocknen Sie es unter Stickstoff ab. Rekonstituieren Sie das ISM in 10 mL ACN und teilen Sie es in 1 mL Aliquote. Die Endkonzentration des ISM sollte 100 pg/μL betragen. Es ist genug ISM vorhanden, um 1000 Proben zu verarbeiten.</li>
	<li>Lagern Sie SM und ISM bei -80 °C.</li>
</ol>
2. Sammlung von Medien und Zelllysat
<ol>
	<li>Für jede 10 cm große Platte mit adhärenten Zellen (~ 1 x 107) werden 3 ml Medium in einem 10-ml-Glaszentrifugenröhrchen gesammelt. Als nächstes waschen Sie die Zellen 2 Mal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS). Geben Sie 1 ml PBS in die Platte, kratzen Sie die Zellen von der Platte ab und pipettieren Sie sie in ein zweites 10-ml-Glaszentrifugenröhrchen. Zu diesem Zeitpunkt können Zellen und Medien gespeichert werden, wenn der Vorgang zu diesem Zeitpunkt nicht fortgesetzt wird. Lagern Sie die Proben für die Langzeitlagerung bei -80 °C oder weniger als eine Woche bei -20 °C.</li>
</ol>
3. Extraktion von Lipiden aus Medien
<ol>
	<li>Freie bioaktive Lipide befinden sich in den Zellmedien und lassen sich mit einem einstufigen l-l-Extraktionsverfahren leicht extrahieren. Zu den gesammelten Medien (2.1) werden 10 μl ISM zugegeben. Zu diesem Zeitpunkt sollten 8 weitere 10-ml-Glaszentrifugenröhrchen für die Kalibrierstandards mit #0-7 gekennzeichnet werden. Geben Sie 3 mL PBS in jedes dieser Röhrchen und geben Sie dann 10 μl des entsprechenden SM in die Röhrchen 1-7 (1-7 von 1,1).</li>
	<li>Lassen Sie das ISM in jedem Kalibrierstandard und jeder Probe 10 Minuten lang äquilibrieren und fügen Sie dann 5 mL Diethylether hinzu. Die Proben und Kalibrierstandards werden dann bei niedriger Geschwindigkeit für 30 Minuten bei Raumtemperatur in den Schüttler gegeben.</li>
	<li>Nach dem Schütteln werden alle Kalibrierstandards und Proben 10 Minuten lang bei 1935 x g zentrifugiert. Anschließend wird die obere Phase (organisch) mit einer Pasteurpipette in ein neues 10-ml-Glaszentrifugenröhrchen überführt und unter Stickstoff getrocknet.</li>
</ol>
4. Extraktion von Lipiden aus Zelllysat
<ol>
	<li>Die Zellproben werden in den Glaszentrifugenröhrchen bei 1935 X g 5 Minuten lang heruntergeschleudert. Entsorgen Sie den Überstand; Geben Sie 2 ml PBS in jedes Röhrchen und wirbeln Sie es kurz auf. Entnehmen Sie 25 μl der Probe für die Proteinquantifizierung. Das Gesamtprotein wird für die Normalisierung des Zelllysats verwendet.</li>
	<li>Übertragen Sie anschließend die Hälfte des Lysat/PBS-Gemisches in ein separates 10-ml-Glaszentrifugenröhrchen. Fügen Sie jeder Probe weitere 2 mL PBS zusammen mit 10 μl ISM hinzu. Befolgen Sie den für Medien in 3.2 und 3.3 beschriebenen l-l-Extraktionsprozess. Dieses Aliquot wird verwendet, um freie Lipide in den Zellen zu messen und einen alkalischen Abbau von Lipiden, wie z.B. den Prostaglandinen, zu vermeiden. Dieses Aliquot wird den unten beschriebenen Schritten 4.3 und 4.4 nicht unterzogen.</li>
	<li>Der erste Schritt des Extraktionsprozesses für verestertes Lipid l-l erfordert die Zugabe von 5 mL CHCl3/MeOH (2:1) zu jeder der Proben. Die Proben werden in einem Shaker bei niedriger Geschwindigkeit für 30 Minuten eingestellt. Nach dem Schütteln werden die Proben bei 1935 x g für 10 Minuten zentrifugiert. Anschließend übertragen Sie mit einer Pasteurpipette die untere (organische) Schicht der l-l-Extraktion in ein neues 10-ml-Glaszentrifugenröhrchen und trocknen die Probe unter Stickstoff.</li>
	<li>Veresterte Lipide müssen vor der Quantifizierung verseift werden. Sobald die Proben trocken sind, geben Sie 0,5 mL 0,4 N KOH in 80 % MeOH in jedes Röhrchen. Die Proben werden dann 1 h lang bei 60°C inkubiert. Fügen Sie nach der Inkubation 2 ml PBS hinzu. Stellen Sie den pH-Wert mit konzentrierter HCl-Säure (~30 μL) auf 6 ein. Geben Sie 10 μl ISM zu jeder Probe. Der Rest des Verfahrens ist der gleiche wie bei der Lipidextraktion aus Medien und kann in 3.2 und 3.3 nachvollzogen werden.</li>
	<li>Werden diese Extraktionen gleichzeitig mit den Medienproben durchgeführt, können die gleichen Kalibrierstandards zur Erstellung einer Kalibrierkurve verwendet werden; werden diese Proben jedoch zu einem anderen Zeitpunkt durchgeführt, müssen auch die Kalibrierstandards wie in 3.1-3.3 beschrieben verarbeitet werden.</li>
</ol>
5. Derivatisierung von Pentafluorylbenzylbromid (PFB)
<ol>
	<li>Zu den getrockneten Proben und Kalibrierstandards werden 100 μl wasserfreies Dichlormethan (CH2Cl2) gegeben, gefolgt von 100 μl 20 % (v/v) N,N-Diisopropylethylamin in wasserfreiem CH2Cl2 und schließlich 100 μl 20 % (v/v) PFB in wasserfreiem CH2Cl2. </li>
	<li>Nach der Zugabe von Derivatisierungsreagenzien werden die Proben vortexed, 1 h bei 60°C inkubiert und unter Stickstoff getrocknet. Die Proben und Kalibrierstandards können bei -80 °C gelagert werden, wenn sie nicht sofort analysiert werden, oder bei -20 °C für bis zu einer Woche.</li>
</ol>
6. Analyse der stabilen Isotopenverdünnung Chirale Flüssigkeitschromatographie Elektroneneinfang Atmosphärendruck Chemische Ionisations-Massenspektrometrie (SID-LC-ECAPCI-MS)
<ol>
	<li>Die getrockneten Proben und Kalibrierstandards werden in 100 μl Hexan/Ethanol (97:3) rekonstituiert. Die gesamte Probe kann dann in das HPLC-Fläschchen mit Insert überführt werden. Geben Sie die Proben in den gekühlten Autosampler (4 °C) und erstellen Sie eine Probenliste für die Analyse.</li>
	<li>Richten Sie als Nächstes die HPLC- und MS-Methoden mit den in Tabelle 1 und Tabelle 2 beschriebenen Parametern ein. Tabelle 3 enthält spezifische Informationen zu Verbindungen, einschließlich der MRM-Übergangs- und Kollisionsenergie (CE) für jedes Lipid sowie der geschätzten Retentionszeit aus der Waters 2695/Thermo Fisher TSQ Quantum Ultra-Analyse. Die CE wird bestimmt, indem jedes einzelne Lipid während der Methodenentwicklung abgestimmt wird.</li>
	<li>Für die normale Phasentrennung wird eine auf 30°C beheizte Chiralpak AD-H Säule (4,6 x 250 mm, 5 μ) verwendet. Die mobile Ausgangsphase besteht zu 98 % aus Hexan und zu 2 % aus Methanol/Isopropanol (1:1). Nach der HPLC-Trennung wird Methanol nach der Säule (0,75 mL/min) zugegeben, um eine Ablagerung auf der Corona-Nadel zu vermeiden, die zu einer Abnahme der Empfindlichkeit führen würde. Der MS wird mit Hilfe der APCI-Quelle in den negativen Ionenmodus versetzt. Wenn die Quelle von ESI auf APCI umgestellt werden muss, stellen Sie sicher, dass Sie eine Corona-Nadel einführen.</li>
	<li>Die erste Probe, die ausgeführt werden sollte, ist immer ein Hexanrohling. Dadurch wird die Säule ausgeglichen und es wird auch festgestellt, ob sich auf der Säule Verunreinigungen befinden, die den Kalibrierstandard und die Probenanalyse beeinträchtigen könnten.</li>
	<li>Der nächste Probenlauf sollte die Kalibrierstandardproben in der Reihenfolge 0-7 sein (Erhöhung der SM-Konzentration). Diese Standards werden verwendet, um eine Kalibrierkurve zu erstellen, die das Verhältnis von Standardfläche/IS-Fläche auf der y-Achse und Standardkonzentration bzw. -masse auf der x-Achse enthält. Aus der aus diesem Diagramm abgeleiteten Gleichung y = mx + b kann das Verhältnis von Probenfläche/IS-Fläche (y) verwendet werden, um die Menge oder Konzentration (x) der Probe (unbekannt) zu bestimmen.</li>
	<li>Die Menge an bioaktiven Lipiden, die in den Medien gefunden wird, kann auf das Gesamtvolumen der Medien normiert werden, und die Menge an Lipiden, die im Zelllysat gefunden wird, kann entweder auf die Gesamtzahl der Zellen/Platte oder auf die Menge des Gesamtproteins/der Platte normalisiert werden. Während des Abschnitts 4.1 des Protokolls sollten Maßnahmen ergriffen werden, um sicherzustellen, dass die Zellen gezählt oder das Protein quantifiziert wird.</li>
</ol>
7. Repräsentative Ergebnisse:
Die Chromatogramme in Abbildung 1 sind repräsentativ für ein gezieltes Lipidomik-Profil. Das erste Bild (Abbildung 1A) zeigt 13- und 9-HODE zusammen mit dem entsprechenden 13- und 9-OxoODE, das von Linolsäure abgeleitet ist. Darüber hinaus ist 15-OxoETE, der oxidierte Metabolit von 15-HETE, im zweiten Panel ebenfalls dargestellt. Die unteren beiden Felder zeigen 20-HETE und das 20-HETE-IS, [2H6]-20-HETE. Abbildung 1B zeigt die Trennung und die eindeutigen Übergänge, die für die HETE-Stereoisomere bestimmt wurden und aus der enzymatischen Oxidation von AA oder durch ROS resultieren. Abbildung 1C ist eine Darstellung von PGs, isoPs und LTB4. Für einige der Standards ist kein deuteriertes IS im Handel erhältlich; Daher wird ein IS verwendet, der in der Retentionszeit ähnlich ist, zur Quantifizierung. Zum Beispiel wird [2H8]-12(S)-HETE verwendet, um 11-HETE- und 8-HETE-Spezies zusätzlich zu 12(R)-HETE und 12(S)-HETE zu quantifizieren.
Aus den repräsentativen Chromatogrammen geht hervor, dass es eine kleine Verschiebung in der Retention des deuterierten IS im Vergleich zum unmarkierten Standard gibt. Diese Verschiebung zu einer späteren Retentionszeit ist ein Ergebnis der Deuterium-Wechselwirkung mit der Normalphasensäule. Deuterium ist polarer als Wasserstoff; Daher kommt es zu einer stärkeren Wechselwirkung mit der Normalphase der Säule. Wenn diese Trennung mit einer umgekehrten Phasensäule stattfinden würde, würde die Verschiebung zu einer früheren Retentionszeit erfolgen, da eine polarere Einheit eine schwächere Wechselwirkung mit der umgekehrten Phase hätte.
<img src="/files/ftp_upload/3399/3399fig1.jpg" alt="Abbildung 1"> 
Abbildung 1. Diese Abbildung ist ein repräsentatives Beispiel für eine gezielte Lipidomik-Analyse. Abbildung 1A zeigt die Gesamtionenchromatogramme (TIC) für mehrere oxidierte LA- und AA-Metaboliten, darunter 13-OxoODE und 9-OxoODE im ersten Feld, 15-OxoETE im zweiten Feld, 13-HODE und 9-HODE (Felder 3 und 5) und 20-HETE (Feld 7). Die HODEs und 20-HETE haben einen entsprechenden deuterierten IS im Panel darunter (4, 6 und 8). Die TICs in Abbildung 2B zeigen die Trennung und die einzigartigen Übergänge der von AA abgeleiteten HETE-Stereoisomere. Abbildung 2C zeigt eine Darstellung von PGs, isoPs und LTs. Die Kollisionsenergie (CE), die MRM-Übergänge und die Retentionszeit (RT, min) wurden mit einem Waters 2695 LC optimiert, der mit einem Thermo Fisher TSQ Quantum Ultra gekoppelt ist, und sind in Tabelle 3 für jede Verbindung aufgeführt.
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Zeit (min)</td>
			<td>% A</td>
			<td>% B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0</td>
			<td>98</td>
			<td>arabische Ziffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3</td>
			<td>98</td>
			<td>arabische Ziffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>11</td>
			<td>96,4</td> kg
			<td>3,6</td> kg
		</tr>
		<tr>
			<td>Nr. 15</td>
			<td>92</td>
			<td>8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27</td>
			<td>92</td>
			<td>8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30</td>
			<td>Nr. 50</td>
			<td>Nr. 50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>38</td>
			<td>Nr. 50</td>
			<td>Nr. 50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>39</td>
			<td>98</td>
			<td>arabische Ziffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>45</td>
			<td>98</td>
			<td>arabische Ziffer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabelle 1. HPLC-Gradientenbedingungen für die chirale Normalphasen-Lipidomik-Trennung. Lösungsmittel A besteht zu 100 % aus Hexanen und Lösungsmittel B aus Methanol/Isopropanol (1:1).
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Parameter der Massenspektrometrie</td>
			<td>Einstellung</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quelle</td>
			<td>APCI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Modus</td>
			<td>Negatives Ion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Länge der Methode</td>
			<td>ca. 40 Minuten</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MRM-Scan-Breite</td>
			<td>0,002 m/z</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MRM-Scan-Zeit</td>
			<td>0,15 Sek.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MRM Peak Breite</td>
			<td>0,70 FWHM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubus-Linse</td>
			<td>164 V</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quelle CID</td>
			<td>10 eV</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q2 Kollisionsgas</td>
			<td>1,5 Stück</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperatur des Verdampfers</td>
			<td>450°C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kapillar-Temperatur</td>
			<td>250°C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Entladestrom</td>
			<td>0 μA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mantel Gasdruck</td>
			<td>25 Stück</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ionen-Sweep-Druck</td>
			<td>3 Stück</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hilfsgasdruck</td>
			<td>5 Stück</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabelle 2. Oben aufgeführt sind die optimierten massenspektrometrischen Parameter für die Messung von bioaktiven Lipiden. Diese Parameter wurden von einem Thermo Fisher TSQ Quantum Ultra übernommen.
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Verbindung</td>
			<td>Übergang</td>
			<td>CE (eV)</td>
			<td>RT (min)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13-OxoODE</td>
			<td>293,03 → 113,10</td>
			<td>21</td>
			<td>9,9</td> kg
		</tr>
		<tr>
			<td>9-OxoODE</td>
			<td>293,03 → 113,10</td>
			<td>21</td>
			<td>17,9</td> kg
		</tr>
		<tr>
			<td>15-OxoETE</td>
			<td>317.05 → 113.18</td>
			<td>18</td>
			<td>8,1</td> kg
		</tr>
		<tr>
			<td>13(R)-HODE</td>
			<td>295,03 → 195,12</td>
			<td>18</td>
			<td>12,5</td> kg
		</tr>
		<tr>
			<td>13(S)-HODE</td>
			<td>295,03 → 195,12</td>
			<td>18</td>
			<td>14,8</td> kg
		</tr>
		<tr>
			<td>[2H4]-13(S)-HODE</td>
			<td>299,03 → 198,12</td>
			<td>18</td>
			<td>14,9</td> kg
		</tr>
		<tr>
			<td>9(R)-HODE</td>
			<td>295,03 → 171,10</td>
			<td>18</td>
			<td>13,7</td> kg
		</tr>
		<tr>
			<td>9(S)-HODE</td>
			<td>295,03 → 171,10</td>
			<td>18</td>
			<td>21,2</td> kg
		</tr>
		<tr>
			<td>[2H4]-9(S)-HODE</td>
			<td>299,03 → 172,12</td>
			<td>18</td>
			<td>21,2</td> kg
		</tr>
		<tr>
			<td>20-HETE</td>
			<td>319.03 → 289.10</td>
			<td>18</td>
			<td>12,4</td> kg
		</tr>
		<tr>
			<td>[2H6]-20-HETE</td>
			<td>325.03 → 295.10</td>
			<td>18</td>
			<td>12,4</td> kg
		</tr>
		<tr>
			<td>5(R)-HETE</td>
			<td>319.04 → 115.04</td>
			<td>16</td>
			<td>15,7</td> kg
		</tr>
		<tr>
			<td>5(S)-HETE</td>
			<td>319.04 → 115.04</td>
			<td>16</td>
			<td>16,2</td> kg
		</tr>
		<tr>
			<td>[2H8]-5(S)-HETE</td>
			<td>327.04 → 116.04</td>
			<td>16</td>
			<td>16,4</td> kg
		</tr>
		<tr>
			<td>12(R)-HETE</td>
			<td>319.04 → 179.11</td>
			<td>14</td>
			<td>11,7</td> kg
		</tr>
		<tr>
			<td>12(S)-HETE</td>
			<td>319.04 → 179.11</td>
			<td>14</td>
			<td>12.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>[2H8]-12(S)-HETE</td>
			<td>327.13 → 184.11</td>
			<td>14</td>
			<td>12,5</td> kg
		</tr>
		<tr>
			<td>15(R)-HETE</td>
			<td>319.04 → 219.12</td>
			<td>13</td>
			<td>12,4</td> kg
		</tr>
		<tr>
			<td>15(S)-HETE</td>
			<td>319.04 → 219.12</td>
			<td>13</td>
			<td>15,9</td> kg
		</tr>
		<tr>
			<td>[2H8]-15(S)-HETE</td>
			<td>327.03 → 226.12</td>
			<td>13</td>
			<td>16.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>11(R)-HETE</td>
			<td>319.04 → 167.11</td>
			<td>16</td>
			<td>11.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>11(S)-HETE</td>
			<td>319.04 → 167.11</td>
			<td>16</td>
			<td>12,5</td> kg
		</tr>
		<tr>
			<td>8(R)-HETE</td>
			<td>319.04 → 155.09</td>
			<td>16</td>
			<td>11,7</td> kg
		</tr>
		<tr>
			<td>8(S)-HETE</td>
			<td>319.04 → 155.09</td>
			<td>16</td>
			<td>12,6</td> kg
		</tr>
		<tr>
			<td>LTB4</td>
			<td>335,03 → 195,10</td>
			<td>18</td>
			<td>32,0</td> kg
		</tr>
		<tr>
			<td>[2H4]-LTB4</td>
			<td>339,03 → 197,10</td>
			<td>18</td>
			<td>32,0</td> kg
		</tr>
		<tr>
			<td>PGE2</td>
			<td>351,03 → 271,15</td>
			<td>18</td>
			<td>31,2</td> kg
		</tr>
		<tr>
			<td>[2H4]-PGE2</td>
			<td>355,03 → 275,15</td>
			<td>18</td>
			<td>31,2</td> kg
		</tr>
		<tr>
			<td>PID2</td>
			<td>351,03 → 271,15</td>
			<td>25</td>
			<td>32,5</td> kg
		</tr>
		<tr>
			<td>[2H4]-PID2</td>
			<td>355,03 → 275,15</td>
			<td>25</td>
			<td>32,5</td> kg
		</tr>
		<tr>
			<td>8-iso-PGE2</td>
			<td>351,03 → 271,15</td>
			<td>18</td>
			<td>37,4</td> kg
		</tr>
		<tr>
			<td>11β-PGF2</td>
			<td>353,03 → 193,11</td>
			<td>25</td>
			<td>27,6</td> kg
		</tr>
		<tr>
			<td>[2H4]-11β-PGF2</td>
			<td>357,03 → 197,11</td>
			<td>25</td>
			<td>27,6</td> kg
		</tr>
		<tr>
			<td>PGF2α</td>
			<td>353,03 → 193,11</td>
			<td>25</td>
			<td>33,1</td> kg
		</tr>
		<tr>
			<td>[2H4]-PGF2α</td>
			<td>357,03 → 197,11</td>
			<td>25</td>
			<td>33,1</td> kg
		</tr>
		<tr>
			<td>8-Iso-PGF2α</td>
			<td>353,03 → 193,11</td>
			<td>25</td>
			<td>34,4</td> kg
		</tr>
		<tr>
			<td>[2H4]-8-iso-PGF 2α</td>
			<td>357,03 → 197,11</td>
			<td>25</td>
			<td>34,4</td> kg
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabelle 3. In dieser Tabelle sind die Verbindungen aufgeführt, die in den Gesamtionenchromatogrammen in Abbildung 1A-C nachgewiesen wurden. Die zweite Spalte enthält den für MRM/MS verwendeten Übergang, die dritte Spalte die Kollisionsenergie (CE, eV) und die letzte Spalte die Verweilzeit (RT, min). Die Parameter wurden mit einem Waters 2695 Trennmodul optimiert, das mit einem Thermo Fisher TSQ Quantum Ultra gekoppelt war.

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<li>Capdevila, J. H., Falck, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+and+molecular+properties+of+the+cytochrome+P450+arachidonic+acid+monooxygenases%5BTitle%5D)+AND+%22Prostaglandins+Other+Lipid+Mediat%22%5BJournal%5D)">Biochemical and molecular properties of the cytochrome P450 arachidonic acid monooxygenases.</a> Prostaglandins Other Lipid Mediat. , 68-69 (2002).</li>
<li>Ciccimaro, E., Blair, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable-isotope+dilution+LC-MS+for+quantitative+biomarker+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Bioanalysis%22%5BJournal%5D)">Stable-isotope dilution LC-MS for quantitative biomarker analysis.</a> Bioanalysis. 2, 311-341 (2010).</li>
<li>Blair, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron-capture+negative-ion+chemical+ionization+mass-spectrometry+of+lipid+mediators%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Electron-capture negative-ion chemical ionization mass-spectrometry of lipid mediators.</a> Methods in Enzymology. 187, 13-23 (1990).</li>
<li>Singh, G., Gutierrez, A., Xu, K., Blair, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liquid+chromatography%2Felectron+capture+atmospheric+pressure+chemical+ionization%2Fmass+spectrometry%3A+analysis+of+pentafluorobenzyl+derivatives+of+biomolecules+and+drugs+in+the+attomole+range%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Liquid chromatography/electron capture atmospheric pressure chemical ionization/mass spectrometry: analysis of pentafluorobenzyl derivatives of biomolecules and drugs in the attomole range.</a> Analytical Chemistry. 72, 3007-3013 (2000).</li>
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<li>Lee, S. H., Blair, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+chiral+lipidomics+analysis+by+liquid+chromatography+electron+capture+atmospheric+pressure+chemical+ionization+mass+spectrometry+%28LC-ECAPCI%2FMS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Targeted chiral lipidomics analysis by liquid chromatography electron capture atmospheric pressure chemical ionization mass spectrometry (LC-ECAPCI/MS).</a> Methods in Enzymology. 433, 159-174 (2007).</li>
</ol>

Es wurden keine Interessenkonflikte angegeben.

Die in diesem Protokoll verwendeten Standards und internen Standards stellen eine Darstellung einer zielgerichteten Lipidomik-Methode dar. Für die LC-MS-Analyse wurden ein Waters 2695 Trennmodul und ein Thermo Fisher TSQ Quantum Ultra verwendet, die optimalen Parametereinstellungen sind in den Tabellen 1 und 2 zu finden. Darüber hinaus wurde dieses Extraktionsprotokoll für adhärente Zellen entwickelt, kann aber auch für andere Zelltypen sowie andere biologische Matrizen wie Urin, Blut un...

<table><tbody><tr><td>5-Oxo-6E,,8Z,11Z,14Z-eicosatetraenoic-6,8,9,11,12,14,15-d7</td><td>säure Cayman Chemical</td><td>334250</td><td>[2H7]-5-ox&#8211;TE Interner Standard</td></tr><tr><td>5S-hydroxy-6E,8Z,11Z,14Z-eicosatetraenoic-5,6,8,9,11,12,14,15-d8 säure</td><td>Cayman Chemical</td><td>334230</td><td>[2H8]-5(S)-HETE Interner Standard</td></tr><tr><td>12S-Hydroxy-5Z,8Z,10E,14Z-eicosatetraenoic-5,6,8,9,11,12,14,15-d8 Säure</td><td>Cayman Chemical</td><td>334570</td><td>[2H8]-12(S)-HETE Interner Standard</td></tr><tr><td>15S-hydroxy-5Z,8Z,11Z,13E-eicosatetraenoic-5,6,8,9,11,12,14,15-d8 säure</td><td>Cayman Chemical</td><td>334720</td><td>[2H8]-15(S)-HETE Interner Standard</td></tr><tr><td>20-hydroxy-5Z,8Z,11Z,14Z-eicosatetraenoic-16,16,17,17,18,18-d6 säure</td><td>Cayman Chemical</td><td>390030</td><td>[2H6]-20-HETE Interner Standard</td></tr><tr><td>9S-hydroxy-10E,12Z-octadecadienoic-9,10,12,13-d4 säure</td><td>Cayman Chemical</td><td>338410</td><td>[2H4]-9(S)-HODE Interner Standard</td></tr><tr><td>13S-hydroxy-9Z,11E-octadecadieno-9,10,12,13-d4 säure</td><td>Cayman Chemical</td><td>338610</td><td>[2H4]-13(S)-HODE Internal Standard</td></tr><tr><td>9&alpha;,11&alpha;,15S-trihydroxy-prosta-5Z,13E-dien-1-oic-17,18,18,19,19,20,20,20-d4 säure</td><td>Cayman Chemical</td><td>316010</td><td>[2H4]-PGF2&alpha; Interner Standard</td></tr><tr><td>9&alpha;,11&alpha;,15S-trihydroxy-(8&#946;)-prosta-5Z,13E-dien-1-oic-3,3,4,4-d4 acid</td><td>Cayman Chemical</td><td>316350</td><td>[2H4]-8-iso-PGF2a Internal Standard</td></tr><tr><td>9&alpha;,11&#946;.,15S-trihydroxy-prosta-5Z,13E-dien-1-oic-3,3,4,4-d4 acid</td><td>Cayman Chemical</td><td>10008989</td><td>[2H4]-11&#946;-PGF2 Interne Norm</td></tr><tr><td>9&alpha;,15S-dihydroxy-11-oxo-prosta-5Z,13E-dien-1-oic-17,17,18,18,19,19,20,20,20-d4 Säure</td><td>Cayman Chemical</td><td>312010</td><td>[2H4]-PGD2 Interner Standard</td></tr><tr><td>9-oxo-11&alpha;,15S-dien-prosta-5Z,13E-dien-1-oic-17,17,18,18,19,19,20,20,20-d4 säure</td><td>Cayman Chemical</td><td>314010</td><td>[2H4]-PGE2 Interner Standard</td></tr><tr><td>5S,12R-dihydroxy-6Z,8E,10E,14Z-eicosatetraenoic-6,7,14,15-d4 säure</td><td>Cayman Chemical</td><td>320110</td><td>[2H4]-LTB4 Interner Standard</td></tr><tr><td>9&alpha;,11,15S-trihydroxy-thromba-5Z,13E-dien-1-oic-3,3,4,4-d4 säure</td><td>Cayman Chemical</td><td>319030</td><td>[2H4]-TxB2 Interner Standard</td></tr><tr><td>5-oxo-6E,8Z,11Z,14Z-eicosatetraensäure</td><td>Cayman Chemical</td><td>34250</td><td>5-ox&#8211;TE Standard</td></tr><tr><td>12-oxo-5Z,8Z,10E,14Z-eicosatetraensäure</td><td>Cayman Chemical</td><td>34580</td><td>12-ox&#8211;TE Standard</td></tr><tr><td>15-oxo-5Z, 8Z,11Z,13E-Eicosatetraensäure</td><td>Cayman Chemical</td><td>34730</td><td>15-ox&#8211;TE Standard</td></tr><tr><td>5R-hydroxy-6E,8Z,11Z,14Z-eicosatetraensäure</td><td>Cayman Chemical</td><td>34225</td><td>5(R)-HETE Standard</td></tr><tr><td>5S-hydroxy-6E,8Z,11Z,14Z-eicosatetraensäure</td><td>Cayman Chemical</td><td>34230</td><td>5(S)-HETE Standard</td></tr><tr><td>8R-hydroxy-5Z,9E,11Z, 14Z-Eicosatetraensäure</td><td>Cayman Chemical</td><td>34350</td><td>8(R)-HETE Standard</td></tr><tr><td>8S-hydroxy-5Z,9E,11Z,14Z-eicosatetraensäure</td><td>Cayman Chemical</td><td>34360</td><td>8(S)-HETE Standard</td></tr><tr><td>11R-hydroxy-5Z,8Z,12E,14Z-eicosatetraensäure</td><td>Cayman Chemical</td><td>34505</td><td>11(R)-HETE Standard</td></tr><tr><td>11S-hydroxy-5Z,8Z,12E, 14Z-Eicosatetraensäure</td><td>Cayman Chemical</td><td>34510</td><td>11(S)-HETE Standard</td></tr><tr><td>12R-hydroxy-5Z,8Z,10E,14Z-eicosatetraensäure</td><td>Cayman Chemical</td><td>34560</td><td>12(R)-HETE Standard</td></tr><tr><td>12S-hydroxy-5Z,8Z,10E,14Z-eicosatetraenoic acid</td><td>Cayman Chemical</td><td>34570</td><td>12(S)-HETE Standard</td></tr><tr><td>15R-hydroxy-5Z,8Z,11Z, 13E-Eicosatetraensäure</td><td>Cayman Chemical</td><td>34710</td><td>15(R)-HETE Standard</td></tr><tr><td>15S-hydroxy-5Z,8Z,11Z,13E-eicosatetraensäure</td><td>Cayman Chemical</td><td>34720</td><td>15(S)-HETE Standard</td></tr><tr><td>20-hydroxy-5Z,8Z,11Z,14Z-eicosatetraensäure</td><td>Cayman Chemical</td><td>90030</td><td>20-HETE Standard</td></tr><tr><td>9R-hydroxy-10E,12Z-octadecadiensäure</td><td>Cayman Chemical</td><td>38405</td><td>9(R)-HODE Standard</td></tr><tr><td>9S-hydroxy-10E,12Z-octadecadenensäure</td><td>Cayman Chemical</td><td>38410</td><td>9(S)-HODE Standard</td></tr><tr><td>13R-hydroxy-9Z,11E-octadecadiensäure</td><td>Cayman Chemical</td><td>38605</td><td>13(R)-HODE Standard</td></tr><tr><td>13S-hydroxy-9Z,11E-octadecadiensäure</td><td>Cayman Chemical</td><td>38610</td><td>13(S)-HODE Standard</td></tr><tr><td>9&alpha;,11&alpha;,15S-trihydroxy-prosta-5Z,13E-dien-1-oic</td><td>acid Cayman Chemical</td><td>16010</td><td>PGF2&alpha; Standard</td></tr><tr><td>9&alpha;,11&alpha;,15S-trihydroxy-(8&#946;)-prosta-5Z,13E-dien-1-oic</td><td>acid Cayman Chemical</td><td>16350</td><td>8-iso-PGF2&alpha; Standard</td></tr><tr><td>9&alpha;,11&#946;,15S-trihydroxy-prosta-5Z,13E-dien-1-oic</td><td>acid Cayman Chemical</td><td>16520</td><td>11&#946;-PGF2 Standard</td></tr><tr><td>9&alpha;,15S-dihydroxy-11-oxo-prosta-5Z,13E-dien-1-oic</td><td>acid Cayman Chemical</td><td>12010</td><td>PGD2 Standard</td></tr><tr><td>9-oxo-11&alpha;,15S-dihydroxy-(8&#946;)-prosta-5Z,13E-dien-1-oic</td><td>acid Cayman Chemical</td><td>14350</td><td>8-iso-PGE2 Standard</td></tr><tr><td>9-oxo-11&alpha;,15S-dihydroxy-prosta-5Z,13E-dien-1-oic acid</td><td>Cayman Chemical</td><td>14010</td><td>PGE2 Standard</td></tr><tr><td>5S,12R-dihydroxy-6Z,8E,10E,14Z-eicosatetraensäure</td><td>Cayman Chemical</td><td>20110</td><td>LTB4 Standard</td></tr><tr><td>9&alpha;,11,15S-trihydroxythromba-5Z,13E-dien-1-oic</td><td>acid Cayman Chemical</td><td>19030</td><td>TxB2 Standard</td></tr><tr><td>Phosphat gepufferte Kochsalzlösung</td><td>GIBCO, von Life Technologies</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>Diethylether</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>346136</td><td></td></tr><tr><td>Dichlormethan</td><td>Acros Organics</td><td>61030-1000</td><td>wasserfrei</td></tr> <tr><td>N,N-Diisopropylethylamin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>387649</td><td></td></tr><tr><td>Pentafluorylbenzylbromid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>101052</td><td></td></tr><tr><td>Salzsäure</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320331</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumhydroxid</td><td>Fluka</td><td>00650</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitril</td><td>Fisher Scientific</td><td>A996-4</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A454-4</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Fisher Scientific</td><td>366927</td><td></td></tr><tr><td>Hexan</td><td>Fisher Scientific</td><td>H303-4</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Fisher</td><td>Scientific A464-4</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Decon Laboratories</td><td>2716</td><td></td></tr><tr><td>Wasser</td><td>Fisher Scientific</td><td>W7-4</td><td></td></tr><tr><td>Pasteurpipetten</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-200</td><td></td></tr><tr><td>10 mL Glaszentrifugenröhrchen</td><td>Kimble Chase</td><td>73785-10</td><td>Schraubverschluss</td></tr><tr><td>Phenol Schraubverschlüsse</td><td>Kimble Chase</td><td>73802-13415</td><td></td></tr><tr><td>Chiralcel ADH Säule</td><td>Chiral Technologies</td><td>19325</td><td></td></tr><tr><td>HPLC-Fläschchen</td><td>Wasser</td><td>60000751CV</td><td></td></tr><tr><td>HPLC-Einsätze</td><td>Wasser</td><td>WAT094171</td><td></td></tr></tbody></table>

cellular lipidextraktion für targeted stable isotope dilution flüssigchromatographie-massenspektrometrie-analyse

Cellular Lipid Extraction for Targeted Stable Isotope Dilution Liquid Chromatography-Mass Spectrometry Analysis

Der Stoffwechsel von Fettsäuren, wie Arachidonsäure (AA) und Linolsäure (LA), führt zur Bildung oxidierter bioaktiver Lipide, einschließlich zahlreicher Stereoisomere1,2. Diese Metaboliten können aus freien oder veresterten Fettsäuren gebildet werden. Viele dieser oxidierten Metaboliten haben eine biologische Aktivität und wurden mit verschiedenen Krankheiten wie Herz-Kreislauf- und neurodegenerativen Erkrankungen, Asthma und Krebs in Verbindung gebracht3-7. Oxidierte bioaktive Lipide können enzymatisch oder durch reaktive Sauerstoffspezies (ROS) gebildet werden. Zu den Enzymen, die Fettsäuren metabolisieren, gehören Cyclooxygenase (COX), Lipoxygenase (LO) und Cytochrome P450 (CYPs)1,8. Der enzymatische Metabolismus führt zur enantioselektiven Bildung, während die ROS-Oxidation zur racemischen Bildung von Produkten führt.
Obwohl sich dieses Protokoll hauptsächlich auf die Analyse von AA- und einigen LA-abgeleiteten bioaktiven Metaboliten konzentriert, könnte es leicht auf Metaboliten anderer Fettsäuren angewendet werden. Bioaktive Lipide werden aus Zelllysat oder -medien mittels Flüssig-Flüssig-Extraktion (l-l) extrahiert. Zu Beginn des l-l-Extraktionsprozesses werden interne Standards für stabile Isotope hinzugefügt, um Fehler bei der Probenvorbereitung zu berücksichtigen. Die Verdünnung stabiler Isotope (SID) berücksichtigt auch alle Unterschiede, wie z. B. die Ionensuppression, die Metaboliten während der Massenspektrometrie (MS)-Analyse erfahren können9. Nach der Extraktion wird eine Derivatisierung mit einem Elektroneneinfangreagenz (EC), Pentafluorylbenzylbromid (PFB), eingesetzt, um die Nachweisempfindlichkeitzu erhöhen 10,11. Das Multiple Reaction Monitoring (MRM) wird eingesetzt, um die Selektivität der MS-Analyse zu erhöhen. Vor der MS-Analyse werden die Lipide mittels chiraler Normalphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) getrennt. Die HPLC-Bedingungen sind so optimiert, dass die Enantiomere und verschiedene Stereoisomere der überwachten Lipide getrenntwerden 12. Diese spezifische LC-MS-Methode überwacht Prostaglandine (PGs), Isoprostane (isoPs), Hydroxyeicosatetraensäuren (HETEs), Hydroxyoctadecadiensäuren (HODEs), Oxoeicosatetraensäuren (oxoETEs) und Oxooctadecadiensäuren (oxoODEs); Die HPLC- und MS-Parameter können jedoch so optimiert werden, dass sie beliebige Fettsäuremetaboliten einbeziehen13.
Die meisten der derzeit verfügbaren bioanalytischen Methoden berücksichtigen nicht die getrennte Quantifizierung von Enantiomeren. Dies ist äußerst wichtig, wenn man ableiten kann, ob die Metaboliten enzymatisch oder durch ROS gebildet wurden oder nicht. Darüber hinaus können die Verhältnisse der Enantiomere Hinweise auf einen spezifischen enzymatischen Bildungsweg liefern. Die Verwendung von SID ermöglicht eine genaue Quantifizierung der Metaboliten und berücksichtigt eventuelle Probenverluste während der Präparation sowie die Unterschiede während der Ionisation. Die Verwendung des PFB-Elektroneneinfangreagenzes erhöht die Empfindlichkeit der Detektion um zwei Größenordnungen im Vergleich zu herkömmlichen APCI-Methoden. Insgesamt ist diese Methode, SID-LC-EC-atmospheric pressure chemical ionization APCI-MRM/MS, eine der empfindlichsten, selektivsten und genauesten Methoden zur Quantifizierung von bioaktiven Lipiden.

Dieses Protokoll demonstriert die Extraktion und Analyse von freien und veresterten bioaktiven Fettsäuren aus Zellen. Fettsäuren werden mittels stabiler Isotopenverdünnung, chiraler Flüssigkeitschromatographie und Elektroneneinfang der atmosphärischen chemischen Ionisation, Mehrfachreaktionsüberwachung, Massenspektrometrie (SID-LC-ECAPCI-MRM/MS) genau quantifiziert.

Cellular Lipidextraktion für Targeted Stable Isotope Dilution Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie-Analyse

The metabolism of fatty acids, such as arachidonic acid (AA) and linoleic acid (LA), results in the formation of oxidized bioactive lipids, including ...

Die Methode zielt darauf ab, zelluläre bioaktive Lipidmetaboliten durch die Kombination von stabiler Isotopenverdünnung, cnor-Phase, Flüssigkeitschromatographie, Elektroneneinfang, Atmosphärendruck, chemischer Ionisation und Massenspektrometrie genau zu quantifizieren. Beginnen Sie mit der Ernte von Medien- und Zellproben und fügen Sie eine mit schweren Isotopen markierte interne Standardmischung hinzu. Extrahieren Sie die bioaktiven Lipide mit organischem Lösungsmittel, derivatisieren Sie die bioaktiven Lipide mit einem Elektroneneinfangreagenz und fahren Sie fort, um die bioaktiven Lipide durch Flüssigkeitschromatographie genau zu quantifizieren.Die Massenspektrometrie durch LCMS-Analyse sowohl des Zelllysats als auch der Medienergebnisse bestimmt präzise die Konzentration der gezielten bioaktiven Lipide und die Spiegel der einzelnen Anant ERs. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der Umkehrphasenflüssigkeitschromatographie, der Massenspektrometrie und anderen LCMS-Methoden besteht darin, dass Individuen und Geweihe durch den Einsatz von Car-Normalphasenchromatographie und stabilisierter Isotopenverdünnung genau quantifiziert werden. Die daraus resultierenden Daten können wertvolle Einblicke in die enzymatischen Signalwege in der Zelle liefern.Für jede 10-Zentimeter-Platte eines Adhärentens sammeln die Zellen drei Milliliter Medium in einem 10-Milliliter-Glaszentrifugenröhrchen. Waschen Sie anschließend die Zellen zweimal mit PBS. Fügen Sie dann einen Milliliter PBS hinzu, kratzen Sie die Zellen von der Platte ab und geben Sie die Probe in ein zweites bis 10-Milliliter-Glaszentrifugenröhrchen.Bereiten Sie acht weitere Röhrchen mit drei Millilitern PBS für eine Kalibrierkurve vor. Geben Sie dann 10 Mikroliter des entsprechenden Kalibrierstandards in jedes Röhrchen. Richten Sie jede Testprobe der drei Milliliter gesammelten Zellkulturmedien für die Extraktion freier bioaktiver Lipide aus.Jedem Kalibrierstandard werden 10 Mikroliter der internen Standardmischung zugesetzt und die Probe 10 Minuten lang bei Raumtemperatur äquilibriert, um die Proben bei fünf Millilitern Dathylether zu verarbeiten, und 30 Minuten lang auf einen Schüttler gelegt. Zentrifugieren Sie die Proben und überführen Sie die obere organische Phase in 10-Milliliter-Glaszentrifugenröhrchen. Trocknen Sie die Proben weiter unter Stickstoff Sammeln Sie zunächst die geernteten Zellproben durch Zentrifugation und resuspendieren Sie jede Palette in zwei Millilitern PBS durch Vortex Reservieren Sie 25 Mikroliter jeder Probe für die Zelllysatnormalisierung.Teilen Sie nun jedes Lysat gleichmäßig in 10-Milliliter-Glaszentrifugenröhrchen auf. Fügen Sie jeder Probe weitere zwei Milliliter PBS und 10 Mikroliter ISM hinzu, um freie zelluläre Lipide zu messen und einen alkalischen Abbau von Lipiden wie den Prostaglandinen zu vermeiden. Verwenden Sie eines von jedem Probenduplikat, um Dathylether-Extraktionen durchzuführen, wie zuvor gezeigt. Um veresterte Lipide zu extrahieren, fügen Sie jeder der verbleibenden Proben fünf Milliliter Chloroform-Methanol-Gemisch hinzu.30 Minuten bei niedriger Geschwindigkeit auf einen Shaker geben und dann 10 Minuten zentrifugieren. Sammeln Sie nun die untere organische Schicht und trocknen Sie die Proben unter Stickstoff, um die veresterten Lipide zu veredeln. Geben Sie 0,5 Milliliter 0,4 normales Kaliumhydroxid in 80% Methanol in jedes Röhrchen.Inkubieren Sie die Proben eine Stunde lang bei 60 Grad Celsius. Fügen Sie dann zwei Milliliter PBS hinzu und stellen Sie den pH-Wert mit konzentrierter Salzsäure auf zwei sechs ein. Fügen Sie schließlich 10 Mikroliter ISM zu jeder Probe hinzu und fahren Sie mit der Dathyleterextraktion der getrockneten Proben und Kalibrierstandards fort.Fügen Sie Ableitungsreagenzien in der angegebenen Reihenfolge hinzu. Anschließend die Proben vortexen und eine Stunde lang bei 60 Grad Celsius inkubieren. Trocknen Sie nun die Proben vor der Lagerung und Analyse unter Stickstoff.Diese Methode verwendet eine Kombination aus stabiler Isotopenverdünnung, Chii, Flüssigkeitschromatographie, Elektroneneinfang, Atmosphärendruck, chemischer Ionisation und Massenspektrometrie. Rekonstituieren Sie die Proben und Kalibrierstandards in 100 Mikrolitern Hexan-Ethanol und überführen Sie die gesamten Proben in HPLC-Fläschchen mit Einsatz, geben Sie die Proben in den gekühlten Autos-Probenehmer. Erstellen Sie eine Beispielliste für die Analyse.Richten Sie als Nächstes die HPLC- und MS-Methoden mit den Parametern ein, die in Tabelle eins und zwei im begleitenden schriftlichen Protokoll für die normale Phasentrennung beschrieben sind. Ein chirales Pack, eine DH-Säule auf 30 Grad Celsius, injizieren Sie die Probe und beginnen Sie den Lauf. Versetzen Sie nun den MS mit der PCI-Quelle A in den negativen Ionenmodus.Beginnen Sie mit einem Hexan-Rohling, um die Spalte auszugleichen. Führen Sie anschließend die Kalibrierstandardproben in der Reihenfolge der Erhöhung der SM-Konzentration durch. Setzen Sie die Verarbeitung von Testproben von Nährmedien nach der HBLC-Trennung fort.Fügen Sie eine Methanol-Post-Säule hinzu, um Ablagerungen auf der Corona-Nadel zu vermeiden. Verwendung von Daten, die aus den Standards generiert werden. Erstellen Sie eine Kalibrierungskurve, in der der Abtastbereich auf der Y-Achse dargestellt wird, und leiten Sie mit der Standardkonzentration auf der X-Achse die Gleichung Y gleich MX plus B ab.Bestimmen Sie abschließend die Konzentrationen der bioaktiven Lipide der Testprobe für die Zelle. Lysate. Normalisieren Sie diese Werte, indem Sie die ermittelte Konzentration des bioaktiven Lipids durch die Anzahl der Zellen pro Platte oder das in den vorherigen Schritten normierte Gesamtprotein dividieren. Daten aus der Mehrfachreaktionsüberwachung deuten auf mehrere Linol- und Arachidonsäure hin.Die oxidierten Metaboliten 13 und neun halten zusammen mit den entsprechenden 13 und neun Oxo-Oden sind von Linolensäure abgeleitet. Darüber hinaus sind erwartungsgemäß auch Hitzemetaboliten der Arachidonsäure und deren oxidierte Produkte vorhanden.Es gibt eine kleine Verschiebung in der Retentionszeit des herabgesetzten internen Standards im Vergleich zum unbeschrifteten Standard. Wichtig ist, dass dieses Protokoll auch Hitze und Geweih trennt und einzigartige Übergänge für die Stereo-Isomere bestimmt, die aus der enzymatischen Oxidation einer Arachidonsäure oder aus der Reaktion mit reaktiven Sauerstoffspezies resultieren können. Dieses Chromatogramm zeigt zum Beispiel den Abstand zwischen den Stereo-Isomeren r und s von fünf.Die Wärmelipidomanalyse ist eine leistungsstarke Technik für die Analyse zahlreicher Lipidspezies. In diesem Experiment werden beispielsweise Prostaglandine, Isops Senes und Leukotrien B vier bewertet und quantifiziert. Zusätzlich zu den Hitzen, die Oxo frisst, und Omega-hydroxylierten Metaboliten kann diese Methode für die Extraktion von bioaktiven Lipiden aus anderen biologischen Matrices wie Plasma, Urin und Gewebe optimiert werden.In einigen Fällen wurden bioaktive Lipide als Reaktionsbiomarker für oxidativen Stress verwendet.

cellular-lipid-extraction-for-targeted-stable-isotope-dilution-liquid

Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

Zwei Techniken zur Isolierung zellulärer Lipidtröpfchen von 1) Hefe-Zellen und 2) menschlichen Plazenten werden vorgestellt. Das Herzstück der beiden Verfahren ist die Dichte-Zentrifugation, wobei die resultierende Schwimmschicht, die die Tröpfchen leicht mit dem Auge sichtbar gemacht werden, extrahiert und mittels Western-Blot-Analyse für Reinheit quantifiziert.

Isolierung von Cellular Lipid Droplets: Zwei Reinigungstechniken Ausgehend von Hefezellen und menschlichen Plazenten

Phosphoinositiden signalisieren Lipide, deren relative Häufigkeit schnell ändert als Reaktion auf verschiedene Reize. Dieser Artikel beschreibt eine Methode, um die Fülle der Phosphoinositiden Messung durch metabolisch Markierung von Zellen mit 3 H-myo-Inositol, gefolgt von Extraktion und Deacylierung. Extrahiert glycero-inositides werden dann durch Hochleistungs-Flüssigkeits-Chromatographie getrennt und durch Strömungs Szintillations quantifiziert.

Radiomarkierung und Quantifizierung von Cellular Ebenen Phosphoinositide von High Performance Liquid Chromatography-gekoppelten Durchflussscintilla

Lipidtröpfchen sind wichtige Organellen für die Replikation von mehreren Erregern, einschließlich der Hepatitis C-Virus (HCV). Wir beschreiben ein Verfahren für die quantitative Lipidtröpfchen-Massenspektrometrie assoziierter Proteine ​​zu isolieren; es kann unter einer Vielzahl von Bedingungen, wie zum Beispiel Virusinfektion, Umweltstress, oder medikamentöse Behandlung verwendet werden.

Lipid Droplet Isolierung für die quantitative Massenspektrometrie-Analyse

Ein Protokoll zur umfassenden Extraktion von Lipiden, Metaboliten und Proteinen aus biologischen Geweben mit einer Probe wird vorgestellt.

Eine einfache Fraktionierte Extraktionsmethode für die umfassende Analyse von Metaboliten, Lipiden und Proteinen aus einer einzigen Probe

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zu quantifizieren und zu einzelnen Sphingomyelin Arten mit mehreren Reaktionskontrolle zu qualifizieren und MS/MS/MS-Modus, beziehungsweise.

Quantitative und Qualitative Methode für Sphingomyelin von LC-MS mit zwei stabilen isotopischer beschriftet Sphingomyelin Arten

Dieser Artikel stellt ein modulares Protokoll für Gewebelipidomik und Transkriptomik sowie Plasmalipidomik in Mausmodellen für neurologische Erkrankungen vor, die auf Lipide abzielen, die Entzündungen und neuronaler Aktivität zugrunde liegen, Membranlipide, nachgeschaltete Botenstoffe und mRNA-kodierende Enzyme / Rezeptoren, die der Lipidfunktion zugrunde liegen. Probenahme-, Probenverarbeitungs-, Extraktions- und Quantifizierungsverfahren werden beschrieben.

Lipidomik und Transkriptomik bei neurologischen Erkrankungen

Diese Methode bietet einen Rahmen für die Untersuchung der Einbeziehung von exogenen Fettsäuren aus komplexen Wirtsquellen in bakterielle Membranen, insbesondere Staphylococcus aureus. Um dies zu erreichen, werden Protokolle zur Anreicherung von Lipoproteinpartikeln aus Hühnereigelb und anschließende Fettsäureprofilierung von bakteriellen Phospholipiden unter Verwendung der Massenspektrometrie beschrieben.

Isolierung von Lipoproteinpartikeln aus Hühnereigelb zur Untersuchung des bakteriellen Pathogens Fettsäure-Inkorporation in Membranphospholipide

Wir präsentieren ein Protokoll mit Flüssigchromatographie gekoppelt mit Tandem-Massenspektrometrie, um wichtige zelluläre Lipide in Saccharomyces cerevisiaezu identifizieren und zu quantifizieren. Die beschriebene Methode zur quantitativen Bewertung wichtiger Lipidklassen innerhalb einer Hefezelle ist vielseitig, robust und empfindlich.

Quantitative Analyse des Zelllipidoms von Saccharomyces Cerevisiae mit Flüssigchromatographie gekoppelt mit Tandem-Massenspektrometrie

Hier wird ein Protokoll zur metabolischen Markierung von Hefe mit 14C-Essigsäure vorgestellt, das mit dünnschichtiger Chromatographie zur Abtrennung neutraler Lipide gekoppelt ist.

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Wir beschreiben ein Verfahren zur Verwendung von Cyclodextrin, um den Austausch zwischen Lipiden der Plasmamembran und exogenen Lipiden zu vermitteln. Diese Technik kann mit Experimenten kombiniert werden, in denen Transmembranproteine untersucht werden, die sich in Lipid-Raft-ähnlichen Umgebungen anders verhalten als in nicht-Raft-ähnlichen Umgebungen.

Lipidaustausch-Assay in lebenden Zellen

Erfahren Sie die zelluläre Lipidextraktion für präzise Quantifizierung bioaktiver Fettsäuren mittels Stable Isotope Dilution LC-MS. Diese Methode ermöglicht genaue Einblicke in zelluläre enzymatische Stoffwechselwege.

Cellular Lipidextraktion für Targeted Stable Isotope Dilution Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie-Analyse

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