Cellular Lipidextraktion für Targeted Stable Isotope Dilution Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie-Analyse

Die Methode zielt darauf ab, zelluläre bioaktive Lipidmetaboliten durch die Kombination von stabiler Isotopenverdünnung, cnor-Phase, Flüssigkeitschromatographie, Elektroneneinfang, Atmosphärendruck, chemischer Ionisation und Massenspektrometrie genau zu quantifizieren. Beginnen Sie mit der Ernte von Medien- und Zellproben und fügen Sie eine mit schweren Isotopen markierte interne Standardmischung hinzu. Extrahieren Sie die bioaktiven Lipide mit organischem Lösungsmittel, derivatisieren Sie die bioaktiven Lipide mit einem Elektroneneinfangreagenz und fahren Sie fort, um die bioaktiven Lipide durch Flüssigkeitschromatographie genau zu quantifizieren.

Die Massenspektrometrie durch LCMS-Analyse sowohl des Zelllysats als auch der Medienergebnisse bestimmt präzise die Konzentration der gezielten bioaktiven Lipide und die Spiegel der einzelnen Anant ERs. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der Umkehrphasenflüssigkeitschromatographie, der Massenspektrometrie und anderen LCMS-Methoden besteht darin, dass Individuen und Geweihe durch den Einsatz von Car-Normalphasenchromatographie und stabilisierter Isotopenverdünnung genau quantifiziert werden. Die daraus resultierenden Daten können wertvolle Einblicke in die enzymatischen Signalwege in der Zelle liefern.

Für jede 10-Zentimeter-Platte eines Adhärentens sammeln die Zellen drei Milliliter Medium in einem 10-Milliliter-Glaszentrifugenröhrchen. Waschen Sie anschließend die Zellen zweimal mit PBS. Fügen Sie dann einen Milliliter PBS hinzu, kratzen Sie die Zellen von der Platte ab und geben Sie die Probe in ein zweites bis 10-Milliliter-Glaszentrifugenröhrchen.

Bereiten Sie acht weitere Röhrchen mit drei Millilitern PBS für eine Kalibrierkurve vor. Geben Sie dann 10 Mikroliter des entsprechenden Kalibrierstandards in jedes Röhrchen. Richten Sie jede Testprobe der drei Milliliter gesammelten Zellkulturmedien für die Extraktion freier bioaktiver Lipide aus.

Jedem Kalibrierstandard werden 10 Mikroliter der internen Standardmischung zugesetzt und die Probe 10 Minuten lang bei Raumtemperatur äquilibriert, um die Proben bei fünf Millilitern Dathylether zu verarbeiten, und 30 Minuten lang auf einen Schüttler gelegt. Zentrifugieren Sie die Proben und überführen Sie die obere organische Phase in 10-Milliliter-Glaszentrifugenröhrchen. Trocknen Sie die Proben weiter unter Stickstoff Sammeln Sie zunächst die geernteten Zellproben durch Zentrifugation und resuspendieren Sie jede Palette in zwei Millilitern PBS durch Vortex Reservieren Sie 25 Mikroliter jeder Probe für die Zelllysatnormalisierung.

Teilen Sie nun jedes Lysat gleichmäßig in 10-Milliliter-Glaszentrifugenröhrchen auf. Fügen Sie jeder Probe weitere zwei Milliliter PBS und 10 Mikroliter ISM hinzu, um freie zelluläre Lipide zu messen und einen alkalischen Abbau von Lipiden wie den Prostaglandinen zu vermeiden. Verwenden Sie eines von jedem Probenduplikat, um Dathylether-Extraktionen durchzuführen, wie zuvor gezeigt. Um veresterte Lipide zu extrahieren, fügen Sie jeder der verbleibenden Proben fünf Milliliter Chloroform-Methanol-Gemisch hinzu.

30 Minuten bei niedriger Geschwindigkeit auf einen Shaker geben und dann 10 Minuten zentrifugieren. Sammeln Sie nun die untere organische Schicht und trocknen Sie die Proben unter Stickstoff, um die veresterten Lipide zu veredeln. Geben Sie 0,5 Milliliter 0,4 normales Kaliumhydroxid in 80% Methanol in jedes Röhrchen.

Inkubieren Sie die Proben eine Stunde lang bei 60 Grad Celsius. Fügen Sie dann zwei Milliliter PBS hinzu und stellen Sie den pH-Wert mit konzentrierter Salzsäure auf zwei sechs ein. Fügen Sie schließlich 10 Mikroliter ISM zu jeder Probe hinzu und fahren Sie mit der Dathyleterextraktion der getrockneten Proben und Kalibrierstandards fort.

Fügen Sie Ableitungsreagenzien in der angegebenen Reihenfolge hinzu. Anschließend die Proben vortexen und eine Stunde lang bei 60 Grad Celsius inkubieren. Trocknen Sie nun die Proben vor der Lagerung und Analyse unter Stickstoff.

Diese Methode verwendet eine Kombination aus stabiler Isotopenverdünnung, Chii, Flüssigkeitschromatographie, Elektroneneinfang, Atmosphärendruck, chemischer Ionisation und Massenspektrometrie. Rekonstituieren Sie die Proben und Kalibrierstandards in 100 Mikrolitern Hexan-Ethanol und überführen Sie die gesamten Proben in HPLC-Fläschchen mit Einsatz, geben Sie die Proben in den gekühlten Autos-Probenehmer. Erstellen Sie eine Beispielliste für die Analyse.

Richten Sie als Nächstes die HPLC- und MS-Methoden mit den Parametern ein, die in Tabelle eins und zwei im begleitenden schriftlichen Protokoll für die normale Phasentrennung beschrieben sind. Ein chirales Pack, eine DH-Säule auf 30 Grad Celsius, injizieren Sie die Probe und beginnen Sie den Lauf. Versetzen Sie nun den MS mit der PCI-Quelle A in den negativen Ionenmodus.

Beginnen Sie mit einem Hexan-Rohling, um die Spalte auszugleichen. Führen Sie anschließend die Kalibrierstandardproben in der Reihenfolge der Erhöhung der SM-Konzentration durch. Setzen Sie die Verarbeitung von Testproben von Nährmedien nach der HBLC-Trennung fort.

Fügen Sie eine Methanol-Post-Säule hinzu, um Ablagerungen auf der Corona-Nadel zu vermeiden. Verwendung von Daten, die aus den Standards generiert werden. Erstellen Sie eine Kalibrierungskurve, in der der Abtastbereich auf der Y-Achse dargestellt wird, und leiten Sie mit der Standardkonzentration auf der X-Achse die Gleichung Y gleich MX plus B ab.

Bestimmen Sie abschließend die Konzentrationen der bioaktiven Lipide der Testprobe für die Zelle. Lysate. Normalisieren Sie diese Werte, indem Sie die ermittelte Konzentration des bioaktiven Lipids durch die Anzahl der Zellen pro Platte oder das in den vorherigen Schritten normierte Gesamtprotein dividieren. Daten aus der Mehrfachreaktionsüberwachung deuten auf mehrere Linol- und Arachidonsäure hin.

Die oxidierten Metaboliten 13 und neun halten zusammen mit den entsprechenden 13 und neun Oxo-Oden sind von Linolensäure abgeleitet. Darüber hinaus sind erwartungsgemäß auch Hitzemetaboliten der Arachidonsäure und deren oxidierte Produkte vorhanden.

Es gibt eine kleine Verschiebung in der Retentionszeit des herabgesetzten internen Standards im Vergleich zum unbeschrifteten Standard. Wichtig ist, dass dieses Protokoll auch Hitze und Geweih trennt und einzigartige Übergänge für die Stereo-Isomere bestimmt, die aus der enzymatischen Oxidation einer Arachidonsäure oder aus der Reaktion mit reaktiven Sauerstoffspezies resultieren können. Dieses Chromatogramm zeigt zum Beispiel den Abstand zwischen den Stereo-Isomeren r und s von fünf.

Die Wärmelipidomanalyse ist eine leistungsstarke Technik für die Analyse zahlreicher Lipidspezies. In diesem Experiment werden beispielsweise Prostaglandine, Isops Senes und Leukotrien B vier bewertet und quantifiziert. Zusätzlich zu den Hitzen, die Oxo frisst, und Omega-hydroxylierten Metaboliten kann diese Methode für die Extraktion von bioaktiven Lipiden aus anderen biologischen Matrices wie Plasma, Urin und Gewebe optimiert werden.

In einigen Fällen wurden bioaktive Lipide als Reaktionsbiomarker für oxidativen Stress verwendet.