Elastomer-PGS Scaffolds in Arterial Tissue Engineering

Dieses Video zeigt, wie poröse röhrenförmige Gerüste hergestellt und einer dynamischen mechanischen Belastung für die arterielle Gewebeengineering angewendet werden. Dies wird erreicht, indem zunächst die Gerüste unter Verwendung eines biologisch abbaubaren Elastomers und der Schmelzverschmelzungsmethode hergestellt werden. Anschließend werden die Gerüste für die Zellbesiedlung vorbereitet und in ein Bioreaktorsystem montiert.

In dem Bioreaktor besiedeln vaskuläre glatte Muskelzellen die Scaffolds und werden kultiviert. Wochen später wird das Gewebe gewonnen und mittels Rasterelektronenmikroskopie, H-und-E-Färbung sowie Elastinautofluoreszenz analysiert. Das resultierende glatte Muskelgewebe ist sowohl mehrschichtig als auch senkrecht ausgerichtet.

Der Hauptvorteil dieser Technik im Vergleich zu pulverförmigem Bleichen besteht darin, die Glasform zur Herstellung eines porösen röhrenförmigen Gerüsts aus Hyaluronsäure zu verwenden. Nachdem die Form entfernt wird, wird die Gerüstform aus einem Stück Glasrohr hergestellt. Setzen Sie das Rohr in einen Halter ein und gießen Sie die am Vortag vorbereitete Hyaluronsäure-Lösung in das Rohr.

Die Hyaluronsäure fließt langsam entlang der inneren Wand ab. Wenn sie den Boden der Form erreicht, drehen Sie die Form um. Wiederholen Sie diesen Schritt, bis die innere Wand der Form gleichmäßig mit der Lösung beschichtet ist.

Nach der Beschichtung alle vorbereiteten Glasformen 24 Stunden lang im Vakuumofen bei 37 Grad Celsius trocknen. Üblicherweise werden vier Formen gleichzeitig vorbereitet, während die Glasformen trocknen. Bereiten Sie die Salzpartikelpulver vor, indem Sie SVE-Salzpartikel auf eine Größe von 25 bis 32 Mikrometern mahlen und sie sieben.

Am nächsten Tag montieren Sie den vorbereiteten Glasformkern, das PTFE-Schlauchstück, die schrumpfbare Hülse und den PTFE-Ring. Zuerst wird der Kern in 65 Millimeter lange PTFE-Schläuche eingeführt und für fünf Minuten bei 120 Grad Celsius gebacken. Währenddessen erwärmen Sie zur Schrumpfung des PTFE einen Hybridisierungsinkubator mindestens 30 Minuten lang auf 37 Grad Celsius.

Nachdem der Schlauch die Dorne umhüllt hat, schieben Sie die Schrumpfschlaufe auf den Dorn, sodass sie sich frei bewegen kann. Dann platzieren Sie den Dorn in der Glasform und befestigen den A-P-T-F-E-Ring an der Unterseite des Dorns. Prüfen Sie, ob der PTFE-Ring fest an der Unterseite der Glasform anliegt.

Danach Salzpartikelporridge mithilfe eines Spatels und eines Silikonkautschuktrichters in die Glasform geben. Anschließend die Form vorsichtig mit dem Spatel antippen, um eine gleichmäßige Partikelverteilung zu erzielen, und überschüssiges Salz abschaben. Nun schalten Sie den beheizten Inkubator aus und laden ihn schnell mit den mit Salz gefüllten Formen. Das Salz verschmilzt in den nächsten 30 Minuten; danach trocknen Sie die Formen 24 Stunden lang im Vakuumofen bei 37 Grad Celsius.

Am nächsten Tag nach dem Abkühlen den Edelstahlmandrel aus den Formen entfernen, indem er herausgeschoben wird, während der PTFE-Ring gesichert wird. Bei Bedarf eine spitzzange verwenden. Anschließend den PTFE-Ring von der Unterseite der Form entfernen.

Als Nächstes die Formen backen, um die Hülle zu schrumpfen, und die geschrumpften Hüllen von den Formen entfernen. Die Formen abkühlen lassen, bis sie verwendet werden, und sie in einem Trockenschrank unter einer Haube aufbewahren. Mit einem Tropfenzähler die Glasformen in einem Winkel von 45 Grad neigen und PGS-Lösung in ihr inneres Lumen tropfen, während die Form langsam rotiert wird.

Überprüfen Sie, ob die PGS-Lösung an der Wand der Form entlangläuft. Falls eine trockene Stelle vorhanden ist, geben Sie mehr PGS hinzu. Lassen Sie nun das THF mindestens 30 Minuten lang im Abzug verdunsten. Sobald das THF vollständig verdunstet ist, härten Sie die Formen in einem Vakuumofen aus.

Nach einer Aushärtungszeit von einem Tag die Formen auf Raumtemperatur abkühlen lassen und sie langsam senkrecht in entionisiertes Wasser bei 24 Grad Celsius eintauchen. Zu schnelles Kippen erzeugt Luftblasen, die das Gerüst beschädigen. Die Formen vorsichtig in das Wasserbad überführen.

Platzieren Sie sie unter einem Winkel mithilfe eines Silikonschlauchs und lassen Sie die Hyaluronsäure über eine Stunde lang auflösen. Wenn nach einer Stunde die Hyaluronsäure nicht aus der Form gelöst ist, verwenden Sie – während die Form noch untergetaucht ist – einen Spatel, um die Hyaluronsäure langsam von beiden Enden her aus der Form zu schieben, und schütteln Sie die Form anschließend vorsichtig. Überprüfen Sie nun, ob sich die Gerüste innerhalb der Glasform bewegt haben, und falls ja, ziehen Sie das Gerüst langsam mit einer Pinzette, um es aus der Form zu lösen.

Als Nächstes werden die Salzpartikel ausgelaugt, indem die empfindlichen Gerüste vorsichtig in ein Bad mit entionisiertem Wasser überführt und sanft gerührt werden. Dieser Vorgang dauert mindestens drei Tage und erfordert, dass das Wasser täglich gewechselt wird. Nachdem das gesamte Salz ausgelaugt ist, wird jedes Gerüst in ein 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen gefüllt mit entionisiertem Wasser überführt und eine Stunde lang in einer Trockeneisbox eingefroren. Anschließend werden die gefrorenen Zentrifugenröhrchen mit geöffneten Deckeln drei Tage lang in einen Gefriertrockner gestellt.

Nach dem Gefriertrocknen die Gerüste bis zur Verwendung in einem Trockenbehälter aufbewahren. Zunächst die Gerüste in Stücke von 25 bis 30 Millimeter Länge schneiden. Danach zwei Silikonkautschukstopfen vorbereiten, indem PTFE-Schläuche durch die mittleren Löcher jedes Stopfens geführt werden.

Danach schneiden Sie 1,5 mm lange Stücke des HS-Rings ab und schieben ein Stück auf ein Ende des Scaffolds. Stecken Sie einen mit dem Stopfen verbundenen PTFE-Schlauch in dasselbe Ende des Scaffolds, so dass gerade genug Überlappung unter dem HS-Ring vorhanden ist, um den Scaffold fest mit dem Schlauch zu verbinden. Schrumpfen Sie den HS-Ring in einem Ofen ein und lassen Sie die Baugruppe auf Raumtemperatur abkühlen. Nun wird ein 50 mm langer Polycarbonatrohr, der als Bioreaktorkammer fungiert, über den Scaffold geschoben und an der inneren Oberfläche des Silikonkautschukstoppers befestigt.

Ebenso wie zuvor werden an dem anderen Ende des Gerüsts ein weiteres PTFE-Röhrchen und ein Stopfen mit einem hs-Ring befestigt, um die Kammer zu vervollständigen. Der zweite Stopfen wird an dem anderen Ende des Polycarbonat-Röhrchens befestigt. Anschließend werden die äußeren Oberflächen der Stopfen mit zwei Aluminiumlegierungsplatten verbunden.

Führen Sie zwei Gewindestangen in das Seitenloch jeder Platte ein und befestigen Sie die Platten mit Daumenschrauben. Befestigen Sie das Gerüst am Bioreaktor. Messen Sie nun die sichtbare Länge jedes Gerüsts, also den Abstand zwischen zwei hs-Ringen, und berechnen Sie deren innere Oberflächen.

Für die Zellseeding. Sterilisieren Sie die Kammern im Autoklaven, wobei jede Kammer einzeln in Folie gewickelt wird, zusammen mit jedem Teil der Bioreaktoreinheit. Nach der Sterilisation montieren Sie den Bioreaktor im Zellkulturlaminarflow.

Behandeln und spülen Sie das Scaffold durch eine Serie von Perfusionen mit einer peristaltischen Pumpe bei einem Fluss von einem Millimeter pro Minute im Flusssystem vor. Beginnen Sie mit der Spülung mit 70 % Ethanol, 50 % Ethanol und anschließend 25 % Ethanol jeweils eine Stunde lang. Schließen Sie an die drei Ethanol-Spülungen eine zweistündige PBS-Spülung an.

Perfusieren Sie den Bioreaktor abschließend 24 Stunden lang mit SMC-Kulturmedium, woraufhin er bereit für die Zellseeding und Experimente ist. Säen Sie nun gemäß den Anweisungen im begleitenden Manuskript 2 Millionen Zellen pro Quadratzentimeter in den Bioreaktor aus und wechseln Sie in den folgenden 21 Tagen das Medienrohr sowie passen Sie die Pumpgeschwindigkeit an. Allmählich steigt der Druck im Konstrukt von etwa vier Millimeter Quecksilber am ersten Kulturtag auf über 100 Millimeter Quecksilber nach zwei Wochen in der Kultur an; nach drei Wochen in der Kultur ernten Sie die Zellen und bereiten sie zur Analyse gemäß den Angaben im begleitenden Manuskript vor.

Diese röhrenförmigen PGS-Gerüste wurden mittels der Salzfusionmethode hergestellt. Rasterelektronenmikroskopische Aufnahmen zeigten, dass alle Gerüste eine homogene Wanddicke aufwiesen und keine partiellen Defekte in ihren Querschnitten vorhanden waren. Auf der luminalen Oberfläche aller Gerüste waren zufällig verteilte Makro- und Mikroporen zu beobachten.

Nach der Zellkultur wuchsen mehrschichtige glatte Muskelzellen (SMCs) mit einer senkrechten Ausrichtung zur Strömungsrichtung. Darüber hinaus bedeckten die Zellen und DCM-Proteine vollständig das Lumen aller PGS-Konstrukte. Die Elastin-Autofluoreszenz zeigte ebenfalls umlaufend angeordnete elastische Fasern an der luminalen Oberfläche des Konstrukts.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie verstehen, wie man einen porösen röhrenförmigen Scaffold herstellt, die Zellen beobachtet und den Scaffold mithilfe eines vorgefertigten Bioreaktors kultiviert.