Elastomer-PGS Scaffolds in Arterial Tissue Engineering

Dieses Video zeigt, wie poröse Rohrgerüste hergestellt und für das arterielle Tissue Engineering einer dynamischen mechanischen Konditionierung unterzogen werden. Dies wird erreicht, indem die Gerüste zunächst mit einem biologisch abbaubaren Elastomer und einem Assault-Fusion-Verfahren hergestellt werden. Anschließend werden die Gerüste für die Zellaussaat vorbereitet und zu einem Bioreaktorsystem zusammengebaut.

Im Bioreaktor werden vaskuläre glatte Muskelzellen die Gerüste aussäen und kultiviert. Wochen später wird Gewebe entnommen und mittels Rasterelektronenmikroskopie, h- und e-Färbung und Elastin-Autofluoreszenz analysiert. Die resultierende glatte Muskulatur ist sowohl mehrschichtig als auch senkrecht orientiert.

Der Hauptvorteil dieser Technik, die es wie das Partikelbleichen gibt, besteht darin, dass die Glasform zur Herstellung von porösem röhrenförmigem Gerüst und Hyaluronsäure verwendet wird. Wenn sich eine Form löscht, wird die Gerüstform aus einem Stück Glasröhre hergestellt. Legen Sie den Schlauch in eine Halterung und gießen Sie die am Vortag vorbereitete Hyaluronsäurelösung in die Tube.

Die Hyaluronsäure fließt langsam entlang der Innenwand nach unten. Wenn es den Boden der Form erreicht, drehen Sie die Form um. Wiederhole diesen Schritt, bis die Innenwand der Form gleichmäßig von der Lösung bedeckt ist.

Nach dem Beschichten trocknen Sie alle vorbereiteten Glasformen in einem Vakuumschrank bei 37 Grad Celsius für 24 Stunden. In der Regel werden vier Formen gleichzeitig hergestellt, während die Glasformen trocknen. Bereiten Sie die Salzpartikelgüsse vor, mahlen Sie sie und SVE-Salzpartikel auf 25 bis 32 Mikrometer.

Am nächsten Tag montieren Sie den vorbereiteten Glasformdorn, den PTFE-Schlauch, den Schrumpfschlauch und den PTFE-Ring. Laden Sie zunächst den Dorn in 65 Millimeter lange PTFE-Schläuche und backen Sie diese fünf Minuten lang bei 120 Grad Celsius. Um das PTFE während des Wartens vor dem Krieg einen Hybridisierungs-Inkubator bei 37 Grad Celsius für mindestens 30 Minuten zu schrumpfen.

Sobald der Schlauch die Dorne umhüllt hat, schieben Sie die Schrumpfhülse auf den Dorn, damit sie sich frei bewegen kann. Legen Sie dann den Dorn in die Glasform und befestigen Sie den A-P-T-F-E-Ring an der Unterseite des Dorns. Überprüfen Sie, ob der PTFE-Ring fest am Boden der Glasform anliegt.

Geben Sie dann mit einem Spachtel und einem Silikonkautschuktrichter Salzpartikelbrei in die Glasform. Klopfen Sie dann mit dem Spachtel vorsichtig auf die Form, um eine gleichmäßige Partikelverteilung zu erzielen, und kratzen Sie das überschüssige Salz ab. Schalten Sie nun den erwärmten Inkubator aus und beladen Sie ihn schnell. Mit den mit Salz gefüllten Formen schmilzt das Salz in den nächsten 30 Minuten, danach trocknen Sie die Formen in einem Vakuumofen bei 37 Grad Celsius für 24 Stunden.

Entfernen Sie am nächsten Tag nach dem Abkühlen den Edelstahldorn aus den Formen, indem Sie ihn herausdrücken, während Sie den PTFE-Ring sichern. Verwenden Sie bei Bedarf eine Spitzzange. Entfernen Sie dann den PTFE-Ring vom Boden der Form.

Als nächstes backen Sie die Formen, um die Hülle zu schrumpfen, und entfernen Sie die geschrumpften Hülsen aus den Formen. Lassen Sie die Formen abkühlen, bis sie verwendet werden, und bewahren Sie sie in einem Trockenmittel in einer Haube auf. Mit einer Apo-Pipette werden die Glasformen um 45 Grad abgewinkelt und die PGS-Lösung in ihr inneres Lumen fallen gelassen, während die Form langsam gedreht wird.

Prüfen Sie, ob die PGS-Lösung an der Wand der Form entlang fließt. Wenn es eine trockene Stelle gibt, fügen Sie mehr PGS hinzu Lassen Sie nun das THF mindestens 30 Minuten in der Haube verdunsten. Sobald das THF verschwunden ist, härten Sie die Formen in einem Vakuumofen aus.

Nachdem Sie einen Tag lang ausgehärtet haben, kühlen Sie die Formen auf Raumtemperatur ab und tauchen Sie sie langsam und vertikal in deionisiertes Wasser bei 24 Grad Celsius. Durch zu schnelles Kippen entstehen Luftblasen, die das Gerüst zerreißen. Übertragen Sie die Formen vorsichtig in das Wasserbad.

Positionieren Sie sie mit einem Silikonschlauch schräg und lassen Sie die Hyaluronsäure über eine Stunde einwirken. Wenn sich die Hyaluronsäure nach einer Stunde nicht aus der Form gelöst hat, drücken Sie die Hyaluronsäure mit einem Spatel langsam von beiden Enden ab und schütteln Sie dann langsam die Form. Überprüfen Sie nun, ob sich die Gerüste nicht in der Glasform bewegt haben, und wenn ja, ziehen Sie das Gerüst langsam mit einer Pinzette, um es aus der Form zu lösen.

Anschließend laugen Sie die Salzpartikel aus, indem Sie die empfindlichen Gerüste vorsichtig unter leichtem Rühren in ein entionisiertes Wasserbad überführen. Dies dauert mindestens drei Tage und erfordert einen täglichen Wasserwechsel. Nachdem das Salz vollständig ausgelaugt wurde, werden alle Gerüste in ein mit entionisiertem Wasser gefülltes 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen umgefüllt und eine Stunde lang in einer Trockeneisbox eingefroren. Legen Sie die gefrorenen Zentrifugenröhrchen drei Tage lang bei geöffneten Verschlüssen in einen Lyophilisator.

Lagern Sie die Gerüste nach dem Gefriertrocknen in einem Trockenmittel, bis sie verwendet werden. Beginnen Sie damit, die Gerüste in Längen von 25 bis 30 Millimetern zu schneiden. Bereiten Sie als Nächstes zwei Silikonkautschukstopfen vor, indem Sie PTFE-Schläuche durch die mittleren Löcher jedes Stopfens führen.

Schneiden Sie dann eineinhalb Millimeter Längen des hs-Rings ab und schieben Sie ein Stück auf ein Ende des Gerüsts. Schieben Sie einen PTFE-Schlauch, der am Stopfen befestigt ist, mit einer gerade ausreichenden Überlappung in das gleiche Ende des Gerüsts, um sich unter dem HS-Ring zu befinden, um das Gerüst fest mit dem Schlauch zu verbinden, schrumpfen Sie den HS-Ring in einem Ofen und lassen Sie die Baugruppe auf Raumtemperatur abkühlen. Nun wird ein 50 Millimeter dickes Polycarbonatrohr, das als Bioreaktorkammer fungiert, über das Gerüst geschoben und an der Innenfläche des Silikonkautschukstopfens befestigt.

Wie zuvor werden ein weiterer PTFE-Schlauch und ein Stopfen am anderen Ende des Gerüsts mit einem HS-Ring befestigt, um die Kammer zu vervollständigen. Der zweite Stopfen wird am anderen Ende des Polycarbonatrohrs befestigt. Als nächstes werden die Außenflächen der Stopper an zwei Platten aus Aluminiumlegierung befestigt.

Führen Sie zwei Gewindestangen in das seitliche Loch an jeder Platte ein und sichern Sie die Platten mit Rändelschrauben. Befestigen Sie das Gerüst am Bioreaktor. Messen Sie nun die sichtbare Länge jedes Gerüsts, d. h. den Abstand zwischen zwei hs-Ringen, und berechnen Sie deren innere Oberflächen.

Für die Zellaussaat. Sterilisieren Sie in einem Autoklaven die Kammern, die jeweils einzeln in Folie eingewickelt sind, zusammen mit jedem Teil der Bioreaktoreinheit. Nach der Sterilisation bauen Sie den Bioreaktor in einer Zellkulturhaube zusammen.

Behandeln und spülen Sie das Gerüst mit einer Reihe von Perfusionen vor, indem Sie eine Schlauchpumpe mit einem Millimeter pro Minute im Durchflusskreislauf verwenden. Beginnen Sie damit, jeweils eine Stunde lang mit 70 % Ethanol, 50 % Ethanol und dann 25 % Ethanol zu spülen. Nach den drei Ethanol-Spülungen folgt eine zweistündige PBS-Spülung.

Zum Schluss perfundieren Sie den Bioreaktor 24 Stunden lang mit SMC-Kulturmedium, danach ist er bereit für die Zellaussaat und Experimente. Befolgen Sie nun die Anweisungen im begleitenden Manuskript, besäen Sie den Bioreaktor mit 2 Millionen Zellen pro Quadratzentimeter und wechseln Sie in den nächsten 21 Tagen das Schlauchmedium und passen Sie die Pumpendrehzahl an. Allmählich wird der Druck im Konstrukt von etwa vier Millimeter Quecksilber am ersten Tag der Kultur auf über 100 Millimeter Quecksilber nach zwei Wochen in Kultur ansteigen, nach drei Wochen in Kultur wird die Zellen geerntet und für die Analyse vorbereitet, wie im begleitenden Manuskript angegeben.

Diese röhrenförmigen PGS-Gerüste wurden durch das Salzschmelzverfahren hergestellt. Rasterelektronenmikroskopische Aufnahmen zeigten, dass alle Gerüste homogene Wandstärken aufwiesen und keine Teildefekte an ihren Querschnitten aufwiesen. Zufällig verteilte Makro- und Mikroporen wurden auf der luminalen Oberfläche aller Gerüste beobachtet.

Nach der Zellkultur wuchsen mehrschichtige SMCs mit einer senkrechten Ausrichtung zur Strömungsrichtung. Darüber hinaus bedeckten die Zellen und DCM-Proteine das Lumen aller PGS-Konstrukte vollständig. Die Elastin-Autofluoreszenz zeigte auch umlaufend organisierte elastische Fasern an der luminalen Oberfläche des Konstrukts.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie verstanden haben, wie man ein poröses röhrenförmiges Gerüst herstellt, sehen Sie sich die Zellen und das Kulturgerüst mit einem vorgefertigten Bioreaktor an.