Name: Elastomer-PGS Scaffolds in Arterial Tissue Engineering (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-08T11:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 35 s
Description: Lernen Sie die Herstellung poröser tubulärer Scaffolds aus biologisch abbaubaren Elastomeren für die arterielle Gewebeengineering. Diese Methode ermöglicht die Kultivierung von glatten Muskelzellen in einem pulsierenden Bioreaktor zur Produktion nativer extrazellulärer Matrix.

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Der Autor dankt Dr. Jin Gao für PGS-Synthese, Dr. Peter Crapo für aufschlussreiche Diskussion für Bioreaktor-Setup, Drs. Mohamed Ezzelarab und Wei Wu für Explantation Pavian Halsschlagadern. Diese Studie wurde durch ein Stipendium der National Institutes of Health (R01 HL089658) unterstützt.

1. Tubular Scaffold Fabrication <ol><li> Bereiten Glasrohr (Länge = 70 mm, Außendurchmesser = 9,0 mm, Wandstärke = 1,0 mm; Kleinteile, Miramar, FL) als Form für Gerüst. </li><li> Bereiten 1,0 Gew. / Vol-% Hyaluronsäure (HA) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) durch Lösen von 100 mg HA in 10 ml VE-Wasser. Mix mit einem Rotator über Nacht, bis keine Luftblasen in der Lösung sind. </li><li> Gießen Sie 1,0% HA-Lösung in der Spitze der Glasröhren. Lassen Sie es langsam entlang der Innenwand der Form. Flip über den Schlauch, wenn die Lösung erreicht den Boden der Form mit dem Rotator und wiederholen Sie diesen Schritt, bis die Innenwand der Form wird gleichmäßig von der Lösung beschichtet. </li><li> Nach der Beschichtung trocken alle Glas-Schläuche in den Vakuum-Trockenschrank bei 37 ° C für 24 h </li><li> Grind und Sieb Salzpartikel (size = 25-32 um) als Porenbildner eingesetzt. </li><li> Bauen Sie ein Glasrohr (beschichtet mit 1,0% HA-Lösung innen), Dorn (Edelstahl umhüllt von PTFE-Schlauch), Schrumpf (HS) Hülse und PTFE-Ring, wie vorher beschrieben 8. </li><li> Mit Salz Teilchen der gewünschten Größe auf die Glasform mit einem Spatel durch die Silikon-Gummi Trichter. Tippen Sie auf die Form vorsichtig, um eine gleichmäßige Verteilung von Salz Partikel zu gewährleisten. Abkratzen das überschüssige Salz Partikel am oberen Rand der Form mit der Seite der Spachtel. </li><li> Schalten Sie die Hybridisierung Inkubator für 30 min vor der Übertragung das Salz verpackt Schimmel. Schalten Sie die Hybridisierung Inkubator-und Put-Salz-packed Form, in der Hybridisierung Inkubator für Salz Fusion. </li><li> Entfernen Sie die Formen aus der Hybridisierung Inkubator und trocknen Sie sie in den Vakuum-Trockenschrank bei 37 ° C für 24 h </li><li> Entfernen Sie das Salz verpackt Formen aus den Vakuum-Trockenschrank und es ihnen ermöglichen, auf Raumtemperatur abkühlen. Entfernen Sie die Edelstahl-Dorn, indem es sich mit dem Halten der PTFE-Ring. Wenn der Dorn ist zu eng, um die Form, die Nadel Zange, ihn herauszuziehen. Entfernen Sie die PTFE-Ring aus dem Boden der Form. </li><li> Legen Sie die Formen in den Ofen bei 120 ° C für 5 min auf HS Ärmel schrumpfen. Prüfen Sie, ob die HS Hülse geschrumpft. Entfernen Sie den HS Hülse aus dem Salz-packed Formen und es ihnen ermöglichen, auf Raumtemperatur abkühlen. Halten Sie die Formen in den Exsikkator, bis sie verwendet werden. </li><li> Bereiten Sie die PGS-Lösung durch Lösen von 3 g PGS in 15 ml Tetrahydrofuran (THF) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) zu einer 20 wt / vol% ig. </li><li> Fügen Sie die PGS Lösung für das Lumen des Salz-packed Formen, indem Sie es mit einem spoid in der Hume Kapuze. Lean die Glasform ca. 45 °-and-Drop die PGS-Lösung in Innenlumen mit rotierendem Werkzeug langsam. Prüfen Sie, ob die PGS-Lösung fließt entlang der Wand von Schimmel. Wenn trockene Stelle beobachtet wird, fügen Sie mehr Lösung. </li><li> Nach dem Hinzufügen der PGS-Lösung, legen Sie die Formen in der Hume Haube für mindestens 30 min für die Verdampfung THF. </li><li> Legen Sie die Formen in den Vakuum-Trockenschrank für vorgegebene Aushärtezeit (ex. 24/36 / 48 h) bei 100 mTorr und 150 ° C für die Aushärtung PGS. </li><li> Nach dem Aushärten nehmen Sie die Formen und platzieren sie bei Raumtemperatur abkühlen lassen. Dip jeder Form, in der VE-Wasser mit vertikaler Position langsam. Nicht tauchen sie in das Wasser schnell, weil Luftblasen kann dazu führen, reißen das Schafott. </li><li> Übertragen Sie die Formen in das Wasserbad vorsichtig und legen Sie sie in einem Winkel für 1 h mit Silikonschlauch zum HA leicht auflösen. Prüfen Sie, ob HA aus der Form gelöst ist. Wenn keine HA aus der Form gelöst wird, drücken Sie das eine Ende des Gerüsts langsam mit Spachtel, um es von der Form lösen. Wiederholen Sie diesen Schritt am anderen Ende des Gerüsts und schütteln Sie die Form hin und her langsam im Wasserbad. Prüfen Sie, ob das Gerüst im Inneren der Form bewegt wird. </li><li> Übertragen Sie die Gerüst zu einem anderen Wasserbad mit Rührer sorgfältig. Versuchen Sie nicht das Gerüst fest, die das Gerüst knacken könnte. Legen Sie das Gerüst in das Wasserbad für mindestens 3 Tage mit wechselnden Wasser auslaugen Salzpartikel. </li><li> Nach Auslaugen Salzpartikel, Transfer jedem Gerüst um die 15 ml Zentrifugenröhrchen mit dem VE-Wasser gefüllt und legen Sie sie in der Trockeneis-Box für 1 h zu frieren. Put Zentrifugenröhrchen in die Lyophilisator (alle Rohr Kabinen geöffnet werden muss) und lyophilisieren sie für 2 Tage. </li><li> Legen Sie alle Gerüste in den Exsikkator vor, bis sie verwendet werden. </li></ol> 2. Scaffold Vorbereitung für Cell Seeding <ol><li> Nehmen Sie Gerüsten aus dem Exsikkator und schneiden Sie sie als 25-30mm Länge. </li><li> Bereiten Sie zwei Silikon-Gummistopfen (Durchmesser = 20 mm, Wandstärke = 6,35 mm, mittlerer Durchmesser = 3 mm) und verbinden zwei PTFE-Schläuche (Außendurchmesser = 3,97 mm, Innendurchmesser = 2,38 mm, Wandstärke = 0,79 mm, Länge = 60 mm und 40 mm) durch die Mitte Löcher von jedem Anschlag. </li><li> Schneiden Sie ein HS-Ring als 1,5 mm Länge und setzen Sie es auf ein Ende des Gerüsts. Schieben Sie eine PTFE-Schlauch (Silikon verbunden Gummistopfen) in das eine Ende des Gerüsts als kleine Schnittmenge wie möglich. </li><li> Legen Sie die Gerüst-und PTFE-Schlauch in den Ofen bei 120 ° C für 10 min bis HS Ring schrumpfen. Prüfen Sie, ob HS Ring ist geschrumpft und Gerüste sind PTFE-Schlauch verbunden fest. </li><li> Nehmen Sie die Gerüst-und PTFE-Schläuche und legen Sie sie bei Raumtemperatur abkühlen lassen. Legen Sie die Gerüst-PTFE-Schlauch-Baugruppe in der Polycarbonat-Rohr (Außendurchmesser = 15,5 mm, Innendurchmesser = 9 mm, Länge = 50 mm) als Bioreaktor Kammer. </li><li> Schließen Sie das andere Ende des PTFE-Schlauch zum Schafott als Schritte 2,3) und 2,4). </li><li> Passen zwei Silikon Gummistopfen an ihren inneren Oberflächen an beiden Enden der Polycarbonat-Rohr befestigen. Befestigen Sie die beiden äußeren Oberflächen aus Silikon Gummistopfen mit zwei Aluminium-Legierung Platten (oben und unten, Breite = 20 mm, Länge = 70 mm, Dicke = 6,35 mm). Legen Sie zwei Gewindestangen in die seitliche Öffnung der Platte und befestigen Sie die Röhrchen aus Polycarbonat (im Lieferumfang enthalten das Gerüst innen) zu den Platten durch Anziehen Flügelmutter Schraube auf der Platte. </li><li> Messen Sie die Länge der einzelnen seedable Gerüst (mit einer Länge zwischen zwei HS Ringe) und berechnen innere Oberfläche (π x Innendurchmesser x seedable Länge) jedes Gerüst für die Zell-Aussaat. </li><li> Wickeln Sie ein Bioreaktor-Kammer-Anlage mit Alufolie und sterilisieren sie durch Autoklavieren bei 120 ° C für 30 min. Sterilisieren jedes Teil (mittel-Reservoir, Pumpe-Schlauch-, Gas-Wärmetauscher, Verteiler und Nadelventil) des Bioreaktors durch Autoklavieren bei 120 ° C für 30 min und montieren sie in der Zellkultur Kapuze. </li><li> Pre-treat und spülen Gerüste mit einer Reihe von Infusionen (70, 50 und 25% Ethanol für 1 h-, Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS; Mediatech, Herndon, VA) für 2 h und SMC Kulturmedium für 24 h mit einer Schlauchpumpe bei 1,0 ml / min in den Fluss-Schaltung. </li></ol> 3. Zellaussaat und Kultur <ol><li> Isolieren primären arteriellen glatten Muskelzellen (SMC) von der Halsschlagadern von jugendlichen männlichen Pavianen (Papio Anubis) und kennzeichnen sie in zweidimensionale (2D) Kultur vor Passagierung und Aussaat, wie vorher beschrieben 9. </li><li> Expand SMCs mit dem MCDB 131 Medium (Mediatech, Herndon, VA) mit 10% fötalem Rinderserum (Lonza, Walkersville, MD), 1% L-Glutamin (Mediatech), 50 pg / ml Ascorbinsäure (Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ), und eine Antibiotika-Antimykotika-Lösung (10.000 IE / ml Penicillin, 10.000 pg / ml Streptomycin und 25 ug / ml Amphotericin B; Mediatech). </li><li> Lösen Sie jeden Bioreaktor Kammer von der Strömung Schaltung in den Bioreaktor. Seed SMCs (Passage 4-6), um das Gerüst mit einer Dichte von 2x10 6 Zellen / cm 2 durch die Injektion Suspension mit 5 ml-Spritze in das Lumen von Gerüsten nach dem Abschneiden beider abluminalen (Einlass) und luminalen (Ausgang) fließt. </li><li> Legen Sie alle Bioreaktor Kammern in die Hybridisierung bei 37 ° C und drehen Sie sie um 2 min für 4 h, damit die Zellen gleichmäßig in das Gerüst verteilt. </li><li> Nehmen Sie Bioreaktor Schränke aus der Hybridisierung Inkubator bringen Sie sie Schaltung des Bioreaktors in der Haube fließen. Übertragen Sie alle Bioreaktor-System in Zellkulturbrutschrank. </li><li> Schließen Sie die Pumpe-Schlauch (Innendurchmesser = 1,6 mm), um den Knorpel der Schlauchpumpe und Last frischem Kulturmedium in das Reservoir. Starten Sie den durch-Wand-Perfusion (luminalen zu abluminalen) bei 1,0 ml / min für 15 min durch luminale Strömung nur gefolgt. </li><li> Erhöhung der Strömungsgeschwindigkeit und Druck allmählich von 1,0 ml / min (luminalen Scherspannung: 1,1 Dyn / cm 2) und 20 mmHg am Tag 1 bis 14,2 ml / min (15,3 Dyn / cm 2) und 120 mmHg am Tag 21, bzw.. Ändern Sie den Pumpenschlauch (Innendurchmesser = 3,2 mm) an Tag 4 und das Medium einmal pro Woche. </li></ol> 4. Tissue Ernte und Probenvorbereitung für die Analyse <ol><li> Nach 21-Tage-Kultur, stoppen Sie die Pumpe und Schläuche Klemme (Einlass und Auslass) des Mediums Reservoir. Lösen Sie den Pumpenschlauch aus dem Knorpel der Schlauchpumpe und Transfer-Bioreaktor-System in der Motorhaube. </li><li> Clamp Ein-und Auslass-Schläuche jeder Bioreaktor Kammer und nehmen Sie ihn aus dem Fluss-Schleife. Öffnen Sie den Zulaufschlauch und bereiten eine Petrischale am Ausgang Schlauch an Kulturmedium in der Polycarbonat-Röhrchens zu sammeln. Öffnen Sie den Ablaufschlauch langsam und entfernen Sie das Medium aus der Kammer. </li><li> Lösen Sie abluminalen Gauge-Nadel und luminalen Silikonschlauch aus der Kammer und lösen Aluminiumplatten durch Loslassen Rändelschrauben. Entfernen Sie die Polycarbonat-Rohr und lösen Sie ein Ende des Gewebes Konstrukt aus dem PTFE-Schlauch. </li><li> Bereiten Sie eine Petrischale mit 10 ml PBS gefüllt und lösen andere Ende des Konstrukts aus dem PTFE-Schlauch. Legen Sie bauen in die PBS und spülen dreimal. </li><li> Schneiden Sie das Konstrukt mit einer Rasierklinge als 5-mm Länge. Frieren sie bei -80 ° C Gefrierschrank für biochemische Assays oder ihn an 15 ml Zentrifugenröhrchen mit 5 ml frisches Medium für mechanische Prüfungen oder Snap freeze in den Tissue-Tek optimale Schnittqualität Temperatur Verbindung (Sakura Finetek Inc., Torrance, CA gefüllt ) für die Histologie / immunofluorescence Färbung. </li></ol> 5. Repräsentative Ergebnisse: Der röhrenförmige PGS Gerüste wurden unter Verwendung biologisch abbaubarer Elastomer, das durch Salz Fusion-Methode (Abb. 1A). Jeder Bioreaktor Kammer vorgesehen Gerüste mit beiden luminalen und abluminalen fließt und könnte als eine separate Einheit aus einem Hauptstrom-Schleife (Abb. 1B) gelöst werden. Bioreaktor-System wurde für die Kultivierung vier Gerüsten zu einer Zeit, durch die Steuerung und Überwachung von Durchflussmengen sowie Druck (Abb. 1C &amp; D) entwickelt. Schematische Darstellung des Bioreaktors Kultur wurde in Abb.. 2. Nach dem Impfen SMCs wurde jeder Bioreaktor Kammer gedreht bei 37 ° C für 4 h auf Zellen gleichmäßig zu verteilen in das Lumen des Gerüsts. Und dann war pulsatilen Fluss auf Gerüsten bis Tag 14 mit allmählich zunehmender Strömungsgeschwindigkeit (Abb. 2A) und Druck (Abb. 2B) angewendet. Nach Tag 14, gehalten Durchfluss und Druck bis zum Ende der Kultur (Tag 21) konstant. Oberflächenmorphologie der PGS Gerüst wurde durch Rasterelektronenmikroskopie (SEM) untersucht. Rasterelektronenmikroskopische Aufnahmen zeigten, dass Gerüst hatte konsequente Wandstärken (539 ± 18 um) (Abb. 3A) und zufällig verteilten Makro-und Mikro-Poren auf der luminalen Oberfläche (Abb. 3B). Morphometrische Parameter des Gerüsts wurde aus welche unser Tomographie (Mikro-CT) und Imaging-Analyse gemessen. Die durchschnittliche Porengröße beträgt 23,3 ± 3,9 um und Poren Interkonnektivität beträgt 99,4 ± 0,62%, was bedeutet, dass alle Poren vollständig in Gerüst verbunden ist. Porosität von Ethanol Verschiebung gemessen beträgt 75,6 ± 2,7%. Cellular Morphologie der PGS-Konstrukt wurde durch SEM (Abb. 4) untersucht. Mehrschichtige SMCs völlig der luminalen Oberfläche bedeckt und sie waren senkrecht orientierten zur Strömungsrichtung. Diese Ergebnisse zeigen, dass mechanische Konditionierung von pulsatilen Fluss Bioreaktor SMC Orientierung unterstützt in dem Schafott. Die Anwesenheit der extrazellulären Matrix (ECM) und elastischen Fasern wurden von H &amp; E-Färbung und Elastin Autofluoreszenz (Abb. 5) untersucht. H &amp; E Färbung zeigte, dass Zellen und ECM Proteine ​​vollständig das Lumen des PGS abgedeckt konstruieren. Elastin Autofluoreszenz zeigten auch, den Umfang organisiert elastischen Fasern an der luminalen Oberfläche des Konstrukts. Produktion von ECM-Proteinen in PGS-Konstrukte wurden von biochemischen Assays gemessen. Die unlöslichen Elastin und Kollagen Inhalte waren 20,2 ± 9,1 pg / mg Gewebe und 6,3 ± 1,9 pg / mg Gewebe bzw.. <img src="/files/ftp_upload/2691/2691fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Scaffold Herstellung und Bioreaktor-System. (A) Schematische Darstellung des röhrenförmigen Gerüst Fertigung. (B) Bioreaktor Kammer. Gerüste wurden PTFE-Schlauch verbunden, platziert in der Polycarbonat-Rohr eingesetzt und durch Silikon-Gummistopfen und Aluminium-Legierung Platten. Jede Kammer hat zwei Fließwege: luminalen (durch Silikonschlauch) und abluminalen (durch Nadel) fließt. (C) Bioreaktor-System in den Brutschrank gestellt. Es umfasst mittlere Reservoir, Schlauchpumpe Modul-, Gas-Wärmetauscher, Drucksensoren, zwei Verteiler (oben und unten), und Nadelventil. (D) Bioreaktor-System platziert außerhalb des Inkubators. Es umfasst Druck-Monitor, Flow Control Unit, Datenerfassung und-Computer. <img src="/files/ftp_upload/2691/2691fig2.jpg" alt="Abbildung 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2. Schematische Darstellung des Bioreaktors Kultur. (A) Kultur-Protokoll. (B) Applied Druckprofile zu jedem Zeitpunkt (Tag 1, 4, 7 und 14). <img src="/files/ftp_upload/2691/2691fig3.jpg" alt="Abbildung 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 3"> Abbildung 3. Oberflächenmorphologie der PGS Gerüst. (A) Querschnitt. (B) Lumen. <img src="/files/ftp_upload/2691/2691fig4.jpg" alt="Abbildung 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 4"> Abbildung 4. Cellular Morphologie der PGS zu konstruieren. (A) Lumen. (B) Querschnitt von 45 ° schneiden. Arrows in beiden Figuren stellen die Fließrichtung. <img src="/files/ftp_upload/2691/2691fig5.jpg" alt="Abbildung 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 5"> Abbildung 5. Histologie und Elastin Autofluoreszenz der PGS zu konstruieren. (A) H &amp; E Färbung. (B) Entsprechende Elastin Autofluoreszenz. L: Lumen. Vergrößerung: 40x. Maßstab: 50 pm.

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</ol>

Die Herstellungstechnik mit einem biologisch abbaubaren Elastomer hier beschriebenen hat mehrere Funktionen. (1) Wir verwendeten Hyaluronsäure (HA) als Trennmittel. Da HA ist wasserlöslich, war Gerüst leicht von der Glasform nach Einweichen in Wasser gelöst. In diesem Bericht verwendeten wir 1,0 Gew. / Vol% der HA-Lösung, weil niedrige Konzentration (&lt;0,5 wt / vol%) der Lösung ist nicht zähflüssig und fließt so schnell, als wir es in Strömen auf der Glasröhren. Zur Beschichtung HA-Lösung gleichmäßig, klappte die wir in den Glasröhren, wenn die Lösung flog der Unterseite der Schläuche und wiederholt diesen Schritt. Diese HA-Beschichtung ist eine kritische, um unsere Fertigung Verfahren zur Freigabe letzten Gerüste. (2) Wir verwendeten Schrumpfschlauch (HS) Hülse für die Beibehaltung Salze in den Glasröhren. Da Salze wurden dicht in den Raum zwischen der Innenwand der Glasröhren und die HS Ärmel gepackt, behielt HS Ärmel Salze nach dem Entfernen Dorn und PTFE-Ring in den Boden des Schlauchs. Wir konnten HS Ärmel leicht entfernen, indem man die Form in einem Ofen bei 120 ° C für 5 min, und dann bekommen röhrenförmigen Salz-Vorlagen. (3) Wir benutzten das Salz Fusion-Methode. Es ist bekannt, dass Salz Fusion-Methode kann Pore Interkonnektivität und die mechanischen Eigenschaften durch Variation fusion Zeit 10 zu verbessern. Darüber hinaus, da wir PGS verwendet wurden Makro-Poren, die durch das Salz Partikel während der Laugung Verfahren hergestellt, während die Mikroporen wurden wahrscheinlich durch Glycerin erzeugte Dampf gebildet während PGS Aushärtung wie wir vorher 11 beschrieben. So hat diese Methode das Potenzial, porösen röhrenförmigen Gerüsten mit verschiedenen Makro-und Mikro-Strukturen herzustellen durch Variation Salzpartikel sowie PGS Aushärtung Zustand. Die mechanische Konditionierung aus dem Bioreaktor hat pulsatilen Fluss Perfusion zur Verfügung gestellt (maximale mittlere Durchfluss = 14 ml / min, maximale Schubspannung = 15,3 dyn / cm 2, Frequenz = 0,5 bis 1,7 Hz) und physiologisch relevanten Druck mit dem PGS Gerüst, das dazu geführt, SMC Wachstum und Orientierung (Abb. 4). Diese Ergebnisse stimmen mit früheren Studien berichten, dass zyklische Dehnung bei dieser Frequenz und Schubspannung erhöht SMC-Proliferation 12 und ECM Proteinproduktion 13,14. Zusätzlich zu SMC Wachstum und Orientierung, PGS ECM Protein-Produktion unterstützt zu konstruieren, insbesondere den Umfang elastischen Fasern (Abb. 5) innerhalb von 3-Wochen-Kultur im Bioreaktor organisiert. Einige Studien unter Verwendung eines elastomeren Gerüst als kleinem Durchmesser arteriellen konstruieren, mechanische Festigkeit und Berstdruck vergleichbar mit nativen Arterien 15, und eine schnelle Integration in SMC-konform Gerüste mit Spinnerflasche 16,17 gezeigt, während keine elastischen Fasern in diesen Konstrukten gefunden wurden. Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass zyklische radiale Ausdehnung aus dem Bioreaktor verbesserte mechanische Signalübertragung effizienter zu SMCs in PGS Gerüst, was wahrscheinlich dazu beigetragen, Synthese und Organisation Elastin. Da vaskuläre SMCs waren die einzigen Zellen, die ECM-Proteine ​​in unserem Ansatz, Ruhestrom Endothel produziert und Verbesserung der mechanischen Festigkeit sind notwendig, um eine klinisch erfolgreiche kleinem Durchmesser arteriellen Konstrukte zu entwickeln. Wir haben berichtet, dass Endothelzellen mit SMCs erwirtschaftete einen Monolayer und unterstützt Phänotyp-Protein-Expression unter unseren Kulturbedingungen und mechanischen Konditionierung 9 Co-kultiviert. Deshalb, basierend auf unserem Ansatz hier beschriebenen Modifikation der Co-Kultur Versuchsbedingungen wäre ein nächster Schritt, um die Funktionen der daraus resultierenden Konstrukte zu verbessern und zu generieren nonthrombogenic, robust sein und konform arteriellen Konstrukt ähnlich nativen Arterien.

<table border="1"><tbody><tr><th> Name des Reagenzes </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nummer </th></tr><tr><td> Hyaluronsäure-Natriumsalz </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H7630 </td></tr><tr><td> Tetrahydrofuran </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 401757 </td></tr><tr><td> MCDB 131 </td><td> Mediatech </td><td> 15 bis 100-CV </td></tr><tr><td> Rinderfötenserum </td><td> Lonza </td><td> BW14-502F </td></tr><tr><td> L-Glutamin </td><td> Mediatech </td><td> 25 bis 005-CV </td></tr><tr><td> Askorbinsäure </td><td> Fisher Scientific </td><td> A62-500 </td></tr><tr><td> Antibiotika-Antimykotikum-Lösung </td><td> Mediatech </td><td> 30 bis 004-CI </td></tr><tr><td> Phosphate Buffered Saline (PBS) </td><td> Mediatech </td><td> 21 bis 031-CV </td></tr><tr><td> Tissue-Tek optimale Schnittqualität Temperatur Verbindung, 4583 </td><td> Sakura Finetek </td><td> 25608-930 </td></tr></tbody></table>

elastomer-pgs scaffolds in arterial tissue engineering

Elastomeric PGS Scaffolds in Arterial Tissue Engineering

Kardiovaskuläre Erkrankungen sind eine der führenden Todesursachen in den USA und vor allem, erhöht koronarer Herzkrankheit mit einer alternden Bevölkerung und der steigenden Fettleibigkeit 1. Derzeit Bypass-Operation unter Verwendung von autologen Gefäßen, Allografts und synthetische Transplantate werden als gemeinhin für arterielle Ersatzstoffe verwendet 2 bekannt. Allerdings haben diese Transplantate begrenzte Anwendungen bei einem inneren Durchmesser von Arterien weniger als 6 mm aufgrund der geringen Verfügbarkeit, thrombotischen Komplikationen, Compliance mismatch, und am späten Intimahyperplasie 3,4 ist. Um diese Einschränkungen zu überwinden, hat das Tissue Engineering erfolgreich als eine vielversprechende Alternative zu kleinem Durchmesser arteriellen Konstrukte, die nonthrombogenic, robust und konform sind zu entwickeln angewendet. Mehrere frühere Studien haben kleinem Durchmesser arteriellen Konstrukte mit Tri-Lamellenstruktur, ausgezeichnete mechanische Eigenschaften und Berstdruck vergleichbar mit nativen Arterien 5,6 entwickelt. Während eine hohe Zugfestigkeit und Berstdruck durch die Erhöhung die Produktion von Kollagen aus einem starren Material oder Zellrasen Gerüst, diese Konstrukte immer noch niedrigen Elastin Produktions-und Compliance, die ein großes Problem für Transplantatversagen nach der Implantation zu verursachen. Angesichts dieser Probleme stellten wir die Hypothese, dass eine elastomere Biomaterial mit mechanischer Klimaanlage kombiniert würden Elastizität bieten und führen mechanische Signale effizienter zu vaskulären Zellen, die extrazelluläre Matrix Produktion zu erhöhen und die Unterstützung zelluläre Orientierung. Das Ziel dieses Berichts ist es, eine Herstellungstechnik von porösen röhrenförmigen Gerüsten und einer dynamisch-mechanischen Konditionierung ihrer Anwendung auf arterielle Tissue Engineering vorstellen. Wir haben ein biologisch abbaubares Elastomer, Poly (Glycerin sebacat) (PGS) 7 zur Herstellung von porösen röhrenförmigen Gerüsten aus dem Salz Fusion-Methode. Adult primäre Pavian glatten Muskelzellen (SMC) wurden auf das Lumen von Gerüsten, die in unserem konzipiert pulsatilen Fluss Bioreaktor für 3 Wochen kultiviert ausgesät. PGS Gerüste hatte konstante Dicke und zufällig verteilten Makro-und Mikro-Poren. Mechanische Konditionierung von pulsatilen Fluss Bioreaktor unterstützt SMC Orientierung und verbesserte ECM-Produktion in Gerüsten. Diese Ergebnisse legen nahe, dass elastomere Gerüste und mechanische Aufbereitung der Bioreaktor Kultur kann eine Erfolg versprechende Methode für die arterielle Tissue Engineering werden.

Elastomer-PGS Gerüste mit vaskulären glatten Muskelzellen in einem pulsatilen Fluss Bioreaktor kultiviert kann, um vielversprechende kleinem Durchmesser arteriellen Konstrukte mit nativen ECM-Produktion in einem relativ kurzen Zeitraum Kultur führen.

Elastomer-PGS Scaffolds in Arterial Tissue Engineering

Herz-Kreislauf-Erkrankungen gehören zu den führenden Todesursachen in den USA; insbesondere die koronare Herzkrankheit nimmt mit einer alternden Bevölkerung zu und ...

Dieses Video zeigt, wie poröse röhrenförmige Gerüste hergestellt und einer dynamischen mechanischen Belastung für die arterielle Gewebeengineering angewendet werden. Dies wird erreicht, indem zunächst die Gerüste unter Verwendung eines biologisch abbaubaren Elastomers und der Schmelzverschmelzungsmethode hergestellt werden. Anschließend werden die Gerüste für die Zellbesiedlung vorbereitet und in ein Bioreaktorsystem montiert.In dem Bioreaktor besiedeln vaskuläre glatte Muskelzellen die Scaffolds und werden kultiviert. Wochen später wird das Gewebe gewonnen und mittels Rasterelektronenmikroskopie, H-und-E-Färbung sowie Elastinautofluoreszenz analysiert. Das resultierende glatte Muskelgewebe ist sowohl mehrschichtig als auch senkrecht ausgerichtet.Der Hauptvorteil dieser Technik im Vergleich zu pulverförmigem Bleichen besteht darin, die Glasform zur Herstellung eines porösen röhrenförmigen Gerüsts aus Hyaluronsäure zu verwenden. Nachdem die Form entfernt wird, wird die Gerüstform aus einem Stück Glasrohr hergestellt. Setzen Sie das Rohr in einen Halter ein und gießen Sie die am Vortag vorbereitete Hyaluronsäure-Lösung in das Rohr. Die Hyaluronsäure fließt langsam entlang der inneren Wand ab. Wenn sie den Boden der Form erreicht, drehen Sie die Form um. Wiederholen Sie diesen Schritt, bis die innere Wand der Form gleichmäßig mit der Lösung beschichtet ist.Nach der Beschichtung alle vorbereiteten Glasformen 24 Stunden lang im Vakuumofen bei 37 Grad Celsius trocknen. Üblicherweise werden vier Formen gleichzeitig vorbereitet, während die Glasformen trocknen. Bereiten Sie die Salzpartikelpulver vor, indem Sie SVE-Salzpartikel auf eine Größe von 25 bis 32 Mikrometern mahlen und sie sieben.Am nächsten Tag montieren Sie den vorbereiteten Glasformkern, das PTFE-Schlauchstück, die schrumpfbare Hülse und den PTFE-Ring. Zuerst wird der Kern in 65 Millimeter lange PTFE-Schläuche eingeführt und für fünf Minuten bei 120 Grad Celsius gebacken. Währenddessen erwärmen Sie zur Schrumpfung des PTFE einen Hybridisierungsinkubator mindestens 30 Minuten lang auf 37 Grad Celsius. Nachdem der Schlauch die Dorne umhüllt hat, schieben Sie die Schrumpfschlaufe auf den Dorn, sodass sie sich frei bewegen kann. Dann platzieren Sie den Dorn in der Glasform und befestigen den A-P-T-F-E-Ring an der Unterseite des Dorns. Prüfen Sie, ob der PTFE-Ring fest an der Unterseite der Glasform anliegt.Danach Salzpartikelporridge mithilfe eines Spatels und eines Silikonkautschuktrichters in die Glasform geben. Anschließend die Form vorsichtig mit dem Spatel antippen, um eine gleichmäßige Partikelverteilung zu erzielen, und überschüssiges Salz abschaben. Nun schalten Sie den beheizten Inkubator aus und laden ihn schnell mit den mit Salz gefüllten Formen. Das Salz verschmilzt in den nächsten 30 Minuten; danach trocknen Sie die Formen 24 Stunden lang im Vakuumofen bei 37 Grad Celsius.Am nächsten Tag nach dem Abkühlen den Edelstahlmandrel aus den Formen entfernen, indem er herausgeschoben wird, während der PTFE-Ring gesichert wird. Bei Bedarf eine spitzzange verwenden. Anschließend den PTFE-Ring von der Unterseite der Form entfernen.Als Nächstes die Formen backen, um die Hülle zu schrumpfen, und die geschrumpften Hüllen von den Formen entfernen. Die Formen abkühlen lassen, bis sie verwendet werden, und sie in einem Trockenschrank unter einer Haube aufbewahren. Mit einem Tropfenzähler die Glasformen in einem Winkel von 45 Grad neigen und PGS-Lösung in ihr inneres Lumen tropfen, während die Form langsam rotiert wird.Überprüfen Sie, ob die PGS-Lösung an der Wand der Form entlangläuft. Falls eine trockene Stelle vorhanden ist, geben Sie mehr PGS hinzu. Lassen Sie nun das THF mindestens 30 Minuten lang im Abzug verdunsten. Sobald das THF vollständig verdunstet ist, härten Sie die Formen in einem Vakuumofen aus.Nach einer Aushärtungszeit von einem Tag die Formen auf Raumtemperatur abkühlen lassen und sie langsam senkrecht in entionisiertes Wasser bei 24 Grad Celsius eintauchen. Zu schnelles Kippen erzeugt Luftblasen, die das Gerüst beschädigen. Die Formen vorsichtig in das Wasserbad überführen.Platzieren Sie sie unter einem Winkel mithilfe eines Silikonschlauchs und lassen Sie die Hyaluronsäure über eine Stunde lang auflösen. Wenn nach einer Stunde die Hyaluronsäure nicht aus der Form gelöst ist, verwenden Sie – während die Form noch untergetaucht ist – einen Spatel, um die Hyaluronsäure langsam von beiden Enden her aus der Form zu schieben, und schütteln Sie die Form anschließend vorsichtig. Überprüfen Sie nun, ob sich die Gerüste innerhalb der Glasform bewegt haben, und falls ja, ziehen Sie das Gerüst langsam mit einer Pinzette, um es aus der Form zu lösen.Als Nächstes werden die Salzpartikel ausgelaugt, indem die empfindlichen Gerüste vorsichtig in ein Bad mit entionisiertem Wasser überführt und sanft gerührt werden. Dieser Vorgang dauert mindestens drei Tage und erfordert, dass das Wasser täglich gewechselt wird. Nachdem das gesamte Salz ausgelaugt ist, wird jedes Gerüst in ein 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen gefüllt mit entionisiertem Wasser überführt und eine Stunde lang in einer Trockeneisbox eingefroren. Anschließend werden die gefrorenen Zentrifugenröhrchen mit geöffneten Deckeln drei Tage lang in einen Gefriertrockner gestellt.Nach dem Gefriertrocknen die Gerüste bis zur Verwendung in einem Trockenbehälter aufbewahren. Zunächst die Gerüste in Stücke von 25 bis 30 Millimeter Länge schneiden. Danach zwei Silikonkautschukstopfen vorbereiten, indem PTFE-Schläuche durch die mittleren Löcher jedes Stopfens geführt werden.Danach schneiden Sie 1,5 mm lange Stücke des HS-Rings ab und schieben ein Stück auf ein Ende des Scaffolds. Stecken Sie einen mit dem Stopfen verbundenen PTFE-Schlauch in dasselbe Ende des Scaffolds, so dass gerade genug Überlappung unter dem HS-Ring vorhanden ist, um den Scaffold fest mit dem Schlauch zu verbinden. Schrumpfen Sie den HS-Ring in einem Ofen ein und lassen Sie die Baugruppe auf Raumtemperatur abkühlen. Nun wird ein 50 mm langer Polycarbonatrohr, der als Bioreaktorkammer fungiert, über den Scaffold geschoben und an der inneren Oberfläche des Silikonkautschukstoppers befestigt.Ebenso wie zuvor werden an dem anderen Ende des Gerüsts ein weiteres PTFE-Röhrchen und ein Stopfen mit einem hs-Ring befestigt, um die Kammer zu vervollständigen. Der zweite Stopfen wird an dem anderen Ende des Polycarbonat-Röhrchens befestigt. Anschließend werden die äußeren Oberflächen der Stopfen mit zwei Aluminiumlegierungsplatten verbunden.Führen Sie zwei Gewindestangen in das Seitenloch jeder Platte ein und befestigen Sie die Platten mit Daumenschrauben. Befestigen Sie das Gerüst am Bioreaktor. Messen Sie nun die sichtbare Länge jedes Gerüsts, also den Abstand zwischen zwei hs-Ringen, und berechnen Sie deren innere Oberflächen. Für die Zellseeding. Sterilisieren Sie die Kammern im Autoklaven, wobei jede Kammer einzeln in Folie gewickelt wird, zusammen mit jedem Teil der Bioreaktoreinheit. Nach der Sterilisation montieren Sie den Bioreaktor im Zellkulturlaminarflow.Behandeln und spülen Sie das Scaffold durch eine Serie von Perfusionen mit einer peristaltischen Pumpe bei einem Fluss von einem Millimeter pro Minute im Flusssystem vor. Beginnen Sie mit der Spülung mit 70 % Ethanol, 50 % Ethanol und anschließend 25 % Ethanol jeweils eine Stunde lang. Schließen Sie an die drei Ethanol-Spülungen eine zweistündige PBS-Spülung an.Perfusieren Sie den Bioreaktor abschließend 24 Stunden lang mit SMC-Kulturmedium, woraufhin er bereit für die Zellseeding und Experimente ist. Säen Sie nun gemäß den Anweisungen im begleitenden Manuskript 2 Millionen Zellen pro Quadratzentimeter in den Bioreaktor aus und wechseln Sie in den folgenden 21 Tagen das Medienrohr sowie passen Sie die Pumpgeschwindigkeit an. Allmählich steigt der Druck im Konstrukt von etwa vier Millimeter Quecksilber am ersten Kulturtag auf über 100 Millimeter Quecksilber nach zwei Wochen in der Kultur an; nach drei Wochen in der Kultur ernten Sie die Zellen und bereiten sie zur Analyse gemäß den Angaben im begleitenden Manuskript vor.Diese röhrenförmigen PGS-Gerüste wurden mittels der Salzfusionmethode hergestellt. Rasterelektronenmikroskopische Aufnahmen zeigten, dass alle Gerüste eine homogene Wanddicke aufwiesen und keine partiellen Defekte in ihren Querschnitten vorhanden waren. Auf der luminalen Oberfläche aller Gerüste waren zufällig verteilte Makro- und Mikroporen zu beobachten.Nach der Zellkultur wuchsen mehrschichtige glatte Muskelzellen (SMCs) mit einer senkrechten Ausrichtung zur Strömungsrichtung. Darüber hinaus bedeckten die Zellen und DCM-Proteine vollständig das Lumen aller PGS-Konstrukte. Die Elastin-Autofluoreszenz zeigte ebenfalls umlaufend angeordnete elastische Fasern an der luminalen Oberfläche des Konstrukts.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie verstehen, wie man einen porösen röhrenförmigen Scaffold herstellt, die Zellen beobachtet und den Scaffold mithilfe eines vorgefertigten Bioreaktors kultiviert.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

Unsere Gruppe hat einen Bioreaktor Kultur-System, das die physiologische pulsatile Belastungen des Herz-Kreislauf-System, um implantierbare kleinem Durchmesser Gefäßprothesen regenerieren imitiert entwickelt.

Engineering Biological-Based Gefäßprothesen Mit einem Pulsatile Bioreaktor

Dieses Protokoll konzentriert sich auf die Nutzung der inhärenten Fähigkeit von Stammzellen zu Stichwort von der sie umgebenden extrazellulären Matrix induziert nehmen und in mehrere Phänotypen zu unterscheiden. Dieses Verfahren erweitert unser Manuskript Beschreibung und Charakterisierung eines Modells unter Verwendung einer zweischichtigen Hydrogel, von PEG-Fibrin und Kollagen zusammen, um gleichzeitig Co-differenzieren Fettgewebe gewonnene...

Projektierung eines zweischichtigen Hydrogel ASC Differenzierungskontrolle

Synthese und Herstellung von elektro langen Fasern sich über eine größere Ablagefläche über einen neu gestalteten Sammler aus einem neuartigen biologisch abbaubaren Polymer namens Poly (Glycerin-Dodecanoat) (PGD) wurde berichtet. Die Fasern waren in der Lage, das Wachstum von pluripotenten Zellen aus Maus-Stammzellen zu unterstützen.

Elektro Faser-Gerüste von Poly (Glycerin-dodecandioat) für Ingenieurnervengewebe aus embryonalen Stammzellen der Maus

Hier zur Gewebezüchtung Gefäßimplantate, die zum Pfropfen in Mäusen durch Impfen Doppel partiell pluripotenten Stammzellen funktional erzeugen präsentieren wir ein Protokoll (PiPSC) - abgeleiteten glatten Muskelzellen und PiPSC - abgeleitete Endothelzellen auf einer dezellularisierten Gefäßgerüst Bioreaktor.

Generierung und Pfropfen von Tissue Engineering Gefäße in einem Maus-Modell

Gerüste für das Tissue Engineering müssen die komplexe biochemische und biophysikalische Mikroumgebung der zellulären Nische rekapitulieren. Hier zeigen wir die Verwendung von Grenzflächen-Polyelektrolyt-Komplexierungsfasern als Plattform zur Herstellung von zusammengesetzten, mehrkomponentigen Polymergerüsten mit anhaltender biochemischer Freisetzung.

Verbund Scaffolds für Grenzflächen Polyelectrolyte Fasern für zeitlich kontrollierte Freisetzung von Biomolekülen

Injizierbare tissue engineering Gerüst aus Poly (N-isopropylacrylamid) -Pfropf-Chondroitinsulfat Mikroteilchen (PNIPAAm-g-CS) -haltigen Alginat besteht, wurde hergestellt. Die Haftfestigkeit, Quelleigenschaften und Biokompatibilität in vitro sind in dieser Studie untersucht. Die Charakterisierungstechniken hier entwickelt, können auf andere thermogelierende Systeme anwendbar sein.

Synthese von thermogelierenden Poly (N-isopropylacrylamid) -Pfropf-Chondroitinsulfat Composites mit Alginate Mikroteilchen für Tissue Engineering

In dieser Arbeit wurden Gerüste aus Poly(milchsäure)/Polyethylenglykol (PLA/PEG) mit einer Kombination aus Schmelzemischen und selektiver Laugung hergestellt. Das hierin diskutierte Verfahren ermöglichte die Entwicklung von dreischichtigen Gerüsten durch hochgradige Kontrolle sowohl der Porosität als auch der Porengröße. Die mechanischen Eigenschaften wurden auch in einer physiologischen Umgebung bewertet.

Ein Facile und umweltfreundliche Weg zu fabrizieren Poly (Milchsäure) Scaffolds mit Graded Porengröße

Ein Schritt-für-Schritt-Protokoll für die zerstörungsfreie und langperiodischer Überwachung des Prozesses der vaskulären Umbau und Abbau Gerüst in Echtzeit-Kultur von biologisch abbaubaren Polymeren Gerüst-basierten Tissue-engineering Blutgefäße mit pulsatile stimulation mit der optischen Kohärenztomographie wird hier beschrieben.

Zerstörungsfreie Überwachung der abbaubaren Gerüst-basierten Tissue-Engineering Blutgefäß Entwicklung mit optischen Kohärenztomographie

Präsentiert wird hier ein einfach zu bedienender, Kern-/Schalen-, dreidimensionaler Bioprinting-Aufbau für die einstufige Fertigung von Hohlgerüsten, geeignet für die Gewebetechnik von Gefäß- und anderen Röhrenstrukturen.

Core/Shell DruckGerüste für Tissue Engineering von Röhrenstrukturen

Die Ösophagusrekonstruktion ist ein anspruchsvolles Verfahren, und die Entwicklung einer gewebekonstruierten Speiseröhre, die die Regeneration von Speiseröhrenschleimhaut und Muskel ermöglicht und die als künstliches Transplantat implantiert werden kann, ist notwendig. Hier stellen wir unser Protokoll zur Erzeugung einer künstlichen Speiseröhre vor, einschließlich Gerüstherstellung, Bioreaktoranbau und verschiedenen chirurgischen Techniken.

Tissue-Engineered Graft for Circumferential Esophageal Reconstruction in Rats

Das Ziel dieses Protokolls ist es, eine dynamische Kokultur von menschlichen Makrophagen und Myofibroblasten in röhrenförmigen elektrogesponnenen Gerüsten durchzuführen, um die materialgetriebene Geweberegeneration mit einem Bioreaktor zu untersuchen, der die Entkopplung von Scherspannung und zyklischer Dehnung ermöglicht.

Ein Multi-Cue-Bioreaktor zur Bewertung der entzündlichen und regenerativen Kapazität von Biomaterialien unter Strömung und Dehnung

Lernen Sie die Herstellung poröser tubulärer Scaffolds aus biologisch abbaubaren Elastomeren für die arterielle Gewebeengineering. Diese Methode ermöglicht die Kultivierung von glatten Muskelzellen in einem pulsierenden Bioreaktor zur Produktion nativer extrazellulärer Matrix.

Elastomer-PGS Scaffolds in Arterial Tissue Engineering

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