Projektierung eines zweischichtigen Hydrogel ASC Differenzierungskontrolle

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, eine Kompositmatrix aus natürlichen Biomaterialien zu schaffen, die zur Abgabe und Differenzierung von Stammzellen verwendet werden kann, um die Wundheilung zu unterstützen. Dies wird erreicht, indem zunächst aus Fett gewonnene Stammzellen oder ein SC aus einem Versuchstier isoliert werden. Als nächstes werden die A SC auf vorgefertigte Chitosan-Mikrokügelchen geladen.

Dann wird FIBRILLIERTES Kollagengel gegossen und die A-S-C-C-S-M-Kügelchen werden über das Kollagengel geschichtet. Zum Schluss wird PEG-Fibringel über das A-S-C-C-S-M-Kollagengel gegossen und Medium zugegeben. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die die bidirektionale gleichzeitige Migration von A SC aus dem CSM-Kügelchen sowohl in Kollagen- als auch in PEG-Fibrinmatrizen zeigen.

Durch dieses Verfahren kann eine einzige Stammzellquelle unterschiedliche Hinweise aus der Kollagen- und PEG-Fibrin-Mikroumgebung aufnehmen und differentiell stimuliert werden, um pleiotrope Faktoren zu produzieren und ein Netzwerk prävaskulärer Strukturen zu bilden. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Verfahren wie Einzelmaterial-Kompositen oder dezellularisierten Hautersatzstoffen besteht darin, dass diese anderen Produkte die Revaskularisierung des Produkts durch den Wirt nicht aktiv angehen. Wir hatten die Idee zu dieser Methode, als wir feststellten, dass isoliertes RAD A SE die Neigung hat, sich in Richtung eines vaskulären Phänotyps zu differenzieren, wenn es in einer Schweinefibrinmatrix kultiviert wird.

Diese Beobachtung führte zu der Idee, dass eine einzige Stammzellquelle gleichzeitig in einem System verwendet werden könnte, das aus verschiedenen Biomaterialien besteht. Nach der Isolierung und Kultivierung von aus Fett gewonnenen Stammzellen oder ASCs, der Vorbereitung von Chitosan-Mikrosphären oder CSMs und dem Laden der ASCs in die CSMs bereiten Sie Polyethylenglykol und Fibrinhydrogel vor, indem Sie Succinylglut Derate modifiziertes peg in vier Millilitern Tris-gepufferter Kochsalzlösung auflösen. Verwenden Sie kurz vor dem Experiment einen 0,22-Mikron-Filter, um die Lösung zu sterilisieren.

In einer Kulturvertiefung mit einer Sechs-Well-Plattenmischung inkubieren 500 Mikroliter Fibrinogenstamm und 250 Mikroliter PEG-Stamm 20 Minuten lang in einem mit 5 % Kohlendioxid befeuchteten Inkubator bei 37 Grad Celsius. Als nächstes mischen Sie 250 Mikroliter zuvor hergestelltes A-S-C-C-S-M mit der pegylierten Fibrinogenlösung, fügen Sie sofort einen Milliliter Thrombin-Stammlösung hinzu und geben Sie mit einer Pipette die Zellgelmischung ein- oder zweimal schnell in eine 12-Well-Platte und inkubieren Sie sie in einer mit 5 % Kohlendioxid befeuchteten Kammer bei 37 Grad Celsius für 10 Minuten. Waschen Sie anschließend das resultierende Peg-Fibrin zweimal mit HBSS und inkubieren Sie es mit Alpha Minimum Essential Medium, das mit 10 % FBS in einem 5 %ige Kohlendioxid-Befeuchtungsinkubator bei 37 Grad Celsius unter Verwendung von Standard-Lichtmikroskopietechniken über einen Zeitraum von 11 Tagen ergänzt wurde.

Beobachten Sie die Migration von Zellen aus dem CSM in die Gelmischung A-S-C-C-S-M mit Kollagen Typ eins, das unter Verwendung von zwei normalen Natriumhydroxiden aus Rattenschwanzsehnen extrahiert wurde. Stellen Sie den pH-Wert auf 6,8 ein und fibrillieren Sie. Geben Sie das fibrillierte Kollagen, A-S-C-C-S-M-Gemisch in eine 12-Well-Platte und inkubieren Sie es in einem 5%igen Kohlendioxid-Befeuchtungsbrutator bei 37 Grad Celsius für 30 Minuten.

Nachdem Sie überprüft haben, ob das Flimmern abgeschlossen ist, inkubieren Sie die Kollagen-A-S-C-C-S-M-Gele bis zu 11 Tage lang in einem mit 5 % Kohlendioxid befeuchteten Inkubator bei 37 Grad Celsius. Beobachten Sie die Migration von Zellen aus CSM in das Gel über einen Zeitraum von 11 Tagen unter Verwendung von Standard-Mikroskopietechniken, um das Doppelschichtkonstrukt zu entwickeln, um die Migrations- und Co-Induktionseigenschaften einer einzigen Stammzellquelle zu untersuchen. Mit zwei Biogerüsten.

Bereiten Sie sowohl das Kollagen- als auch das PEG-Fibringel mit den folgenden leichten Modifikationen vor: Bereiten Sie einen Milliliter von 7,5 Milligramm pro Milliliter Kollagen vor. Dann geben Sie die Mischung in einen Sechs-Well-Gewebekultureinsatz und inkubieren Sie sie 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Nach vollständiger Fibrillation legen Sie 200 Mikroliter mit fünf Milligramm A-S-C-C-S-M in Kulturmedium auf die Kollagenoberfläche.

Nachdem sich die Mikrosphären auf dem Gel abgesetzt haben, bereiten Sie das PEG-Fibringel mit 250 Mikrolitern Zellkulturmedium vor. Schichten Sie dann die pegylierte Fibrinogen-Thrombin-Lösung über die A-S-C-C-S-M-Kollagenschichten. Nach Fertigstellung inkubieren Sie die Konstrukte 30 Minuten lang in einem mit 5 % Kohlendioxid befeuchteten Inkubator, um die Fertigstellung zu erreichen.

Zum Schluss geben Sie einen Milliliter Medium in die obere Kammer über das Konstrukt und drei Milliliter Medium in die untere Kammer. Die Charakterisierung eines SC, das in dieses Gerüst eingebettet ist, zeigte, dass ein SC-beladenes CSM gleichzeitig zwischen einer Schicht aus Kollagen und Peg-Fibrin eingebettet sein kann und unterschiedlich Signale aus beiden extrazellulären Umgebungen aufnimmt, um unter ihren neuen Bedingungen zu gedeihen. Wie hier gezeigt, unterstützte Kollagen die Fähigkeit von ASCs, Stammzellen zu bleiben, wie ihre Expression von stro one in grün sowie ihre fibroblastenähnliche Morphologie zeigten.

Im Gegensatz dazu induzierte PEG-Fibrin die ASCs zur Differenzierung in Richtung eines avaskulären Phänotyps, wie ihre hier gezeigte röhrenartige Morphologie mit Lumen und ihre endothelzellspezifische Expression des Von-Willow-Brandand-Faktors zeigt, der hier in rot dargestellt ist. Darüber hinaus schienen diese beobachteten Phänotypen, wie hier gezeigt, früh in der Kultur aufzutreten und wurden über 11 Tage aufrechterhalten. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man aus Fett gewonnene Stammzellen von Ratten isoliert, sie auf Chito und Mikrosphären lädt und sie unter Verwendung von FDA-zugelassenen Biomaterialien in ein zweischichtiges Hydrogel einbaut.

Vergessen Sie nicht, dass die Biomaterialien und Zellen, die in diesem Protokoll verwendet werden, von Tieren und Menschen stammen und äußerst gefährlich sein können, wenn sie mit Krankheitserregern von ihrem Wirt kontaminiert sind. Und Vorsichtsmaßnahmen wie persönliche Schutzausrüstung und aseptische Zellkulturtechniken sollten bei der Durchführung dieser Verfahren immer getroffen werden.