Mikrofluidik-Geräte mit Measure Lebensdauer und Cellular Phänotypen in Einzel Budding Hefezellen

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments ist es, ein spezielles mikrofluidisches Gerät herzustellen und damit die Lebensdauer und die zellulären Phänotypen einer einzelnen Hefezelle zu messen. Diese Methode kann dazu beitragen, einige der Schlüsselfragen auf dem Gebiet der Hefealterung zu beantworten, z. B. warum Mutterzellen altern und sterben und was sind die früheren molekularen Ereignisse, die den Verlust der zellulären Homöostase und schließlich die Zellalterung und den Zelltod vorantreiben? Der große Vorteil dieser Technik besteht darin, dass wir Mutterzellen, ihre Lebensdauer und die verschiedenen molekularen Marker gleichzeitig verfolgen können, so dass wir nach molekularen Ereignissen suchen können, die mit der Lebensdauer korrelieren.

Obwohl diese Methode Einblicke in die Hefealterung geben kann, kann sie auch auf andere Bereiche angewendet werden, z. B. auf die Überwachung sekundärer Reaktionen auf die Teilnahme, die eine Zellüberprüfung über viele Generationen hinweg erfordert. Im Allgemeinen werden Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten haben, da die Herstellung von mikrofluidischen Geräten, die Zellbeladung und die Einrichtung des Mikroskops viel Übung erfordern, um erfolgreich durchzuführen. Eine vorherige Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da es schwierig ist, das mikrofluidische Gerät richtig mit Hefe zu beladen.

Beginnen Sie mit der Herstellung einer Siliziumwaferform für das Gerät unter Verwendung von Standardtechniken, wie im begleitenden Textprotokoll beschrieben. Legen Sie es mit der Vorderseite nach oben in eine 15 Zentimeter große Petrischale. Befestigen Sie die Form mit Klebebändern auf der Petrischale.

Stellen Sie dann ein sauberes Wiegeschiffchen auf eine Waage und zerreißen Sie die Waage. Gießen Sie 50 Gramm PDMS-Base in die Waage und fügen Sie dann fünf Gramm PDMS-Härter hinzu. Rühren Sie die PDMS-Basis und das Härtungsmittel mit einer Einwegpipette auf.

Beginne am Rand des Waagschiffchens und bewege dich langsam nach innen. Rühre die Mischung einige Minuten lang gründlich um, bis sich kleine Bläschen in der Mischung bilden. Gießen Sie die Mischung langsam in die Petrischale, so dass sie die Silikonwaferform vollständig bedeckt.

Stellen Sie dann die Petrischale 10 Minuten lang in ein Vakuum, um alle Luftblasen aus der PDMS-Mischung zu entfernen. Wenn nach dem Entfernen aus dem Vakuum Blasen auf der Oberfläche des Gemisches verbleiben, blasen Sie sie mit einer Pipette aus. Als nächstes backen Sie das Gerät bei 75 Grad Celsius für zwei Stunden.

Wenn Sie wieder auf Raumtemperatur abgekühlt sind, schneiden Sie vorsichtig durch das PDMS um die Form herum und ziehen Sie dann die Schicht aus polymerisiertem PDMS vorsichtig von der Silikonwaferform ab, um Schäden an der Konstruktion der Waferform zu vermeiden. Platzieren Sie die PDMS-Schicht mit der Musterseite nach oben auf der Bank. Schneiden Sie den einzelnen Chip vorsichtig mit einer einschneidigen Industrierasierklinge aus und behalten Sie dabei einen ausreichenden Abstand zur Kante jedes einzelnen Chips bei, um Bauschäden zu vermeiden.

Stanze mit der Musterseite nach oben mit einem Locher Löcher direkt nach unten durch die Einlass- und Auslasskreise auf jeder Seite der Kanäle. Überprüfen Sie jedes Loch, indem Sie die Lochnadel wieder in das Loch einführen. Stellen Sie sicher, dass die Nadel von der anderen Seite herauskommen kann, um anzuzeigen, dass keine Verstopfungen vorhanden sind.

Verwenden Sie anschließend das Klebeband, um Staubpartikel und Schmutz von der Oberseite zu entfernen. Wiederholen Sie diesen Schritt mindestens dreimal und lassen Sie ein sauberes Stück Klebeband auf dem PDMS, um eine staubfreie Oberfläche zu erhalten. Drehen Sie dann das Gerät um und wiederholen Sie diesen Vorgang auf der gegenüberliegenden Seite des PDMS.

Lassen Sie das letzte Stück Klebeband auch auf dieser Seite. Bereiten Sie nun eine Glasfläche für den Boden des Gerätes vor. Wählen Sie das 24 Millimeter mal 30 Millimeter große Deckglas mit einer Dicke zwischen 13 und 17 Millimetern.

Sprühen Sie 70% Ethanol auf das Glas und trocknen Sie es mit Staubentferner, um die Oberfläche zu sterilisieren. Übertragen Sie dann das Deckglas und das PDMS auf eine Kunststoffplatte. Entfernen Sie das Klebeband vom PDMS und platzieren Sie die Musterseite nach oben in der Platte, ohne die Oberseite zu berühren.

Übertragen Sie dann die Platte in eine Plasmakammer. Wenden Sie eine Sauerstoffplasmabehandlung auf das PDMS und das Deckglas an, um die Oberflächen hydrophil zu machen. Nehmen Sie dann die Platte aus der Plasmakammer und verbinden Sie die plasmabehandelten Oberflächen des PDMS vorsichtig mit dem Deckglas.

Stellen Sie sicher, dass sich keine Luftblasen zwischen dem PDMS und dem Deckglas befinden. Zum Schluss stellst du das Gerät in einen Ofen und backst es mindestens zwei Stunden lang bei 75 Grad Celsius. Tauchen Sie die Ein- und Ausgangsrohre einen Tag vor der PDMS-Chipvorbereitung in 70%ige Ethanollösung.

Füllen Sie am nächsten Tag eine Fünf-Milliliter-Spritze mit autoklaviertem Wasser und waschen Sie jedes Röhrchen, indem Sie das Röhrchen auf die Spritze legen und das Röhrchen mit Wasser spülen. Wiederholen Sie den Waschschritt mindestens dreimal, um Ethanolreste zu entfernen. Untersuchen Sie anschließend die PDMS-Kanäle unter einem optischen Mikroskop.

Stellen Sie mit einem 10-fachen Objektiv sicher, dass die Strukturen konsistent und intakt sind. Stabilisieren Sie den intakten PDMS-Chip auf der Mikroskopplattform mit Klebeband. Befestigen Sie eine mit sterilem Wasser beladene Fünf-Milliliter-Spritze an einer Spritzenpumpe und führen Sie die entsprechenden Ein- und Ausgangsschläuche in das Gerät ein.

Stellen Sie die Durchflussmenge auf 750 Mikroliter pro Stunde ein und spülen Sie den Chip etwa 10 Minuten lang. Achten Sie auf die Kanäle, um sicherzustellen, dass alle Luftblasen weggespült werden. Wenn nach der 10-minütigen Spülung Blasen übrig bleiben, passen Sie die Geschwindigkeit manuell an, um die Blasen zu entfernen.

Übertragen Sie einen Milliliter einer vorbereiteten Hefeprobe in zwei 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen und zentrifugieren Sie die Proben fünf Minuten lang bei 3.000 Mal G. Entfernen Sie den größten Teil des Überstands aus jedem Röhrchen und kombinieren Sie den Rest zu einer 5-Milliliter-Probe. Wenn die Hefeprobe nun fertig ist, entfernen Sie die Eingaberöhrchen vom PDMS-Chip. Drehen Sie die Spritzenpumpe manuell um, um eine kleine Luftblase von ein bis zwei Zentimetern Länge pro Eingangsschlauch einzusaugen, und saugen Sie dann Zellkulturen ein.

Stecken Sie dann das Eingangsrohr wieder in den PDMS-Chip und starten Sie die Pumpe neu, um die Zellen mit einer Geschwindigkeit von 750 Mikrolitern pro Stunde zu laden. Lassen Sie die Spritzenpumpe 10 Minuten lang eingeschaltet und untersuchen Sie dann den Verlauf der Zellbeladung unter dem Mikroskop. Eine erfolgreiche Beladung wird die Zellen unter mehr als 60 % der Hängesäule einschließen.

Um die Hefezellen zu erhalten, stellen Sie die Lösung in der Spritze auf eine Ernährungslösung um und stellen Sie die Geschwindigkeit auf 400 Mikroliter pro Stunde ein. Der Lebensdauer-Phänotyp der Hefe kann durch Zählen der Anzahl der Knospen, die von jeder gefangenen Mutterzelle produziert werden, und durch Schätzung des Kaplan-Meier-Schätzers ermittelt werden. Mit diesem Protokoll fängt das Gerät häufig frische Tochterzellen ein, die sich von den bereits gefangenen Zellen abgestoßen haben.

Diese Zellen verwandeln sich dann in frische Mutterzellen, die mit Hilfe einer nachgeschalteten Bildanalysesoftware identifiziert werden können. Diese frischen Mutterzellen ermöglichen eine genauere Messung der Lebensdauer. In diesem Experiment war die durchschnittliche Lebensdauer der frischen Mutterzellen um etwa zwei Generationen etwas länger.

Neben der Anzahl der Knospen kann aus den Bilddaten auch das Zeitintervall zwischen zwei aufeinanderfolgenden Knospenereignissen extrahiert werden. Die Knospung verlangsamt sich gegen Ende ihrer Lebensdauer dramatisch, was auf den ungesunden Zustand dieser gealterten Zellen hinweist. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, daran zu denken, sowohl einen frisch hergestellten Chip zu verwenden, um Blasen zu vermeiden, als auch die Zellkonzentration zu erhöhen, um die Effizienz der Zellbeladung bei Bedarf zu verbessern.

Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Hefealterung, um die frühen molekularen Veränderungen zu erforschen, die für den Alterungsphänotyp ursächlich sind. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man dieses mikrofluidische Gerät herstellt und wie man es verwendet, um die Lebensdauer und die zellulären Phänotypen in einzelnen Zellen zu messen.