Name: Mikrofluidik-Geräte mit Measure Lebensdauer und Cellular Phänotypen in Einzel Budding Hefezellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 18 s
Description: Lernen Sie die Herstellung mikrofluidischer Geräte zur Messung der Lebensdauer und zellulärer Phänotypen einzelner Hefemutterzellen. Diese Methode ermöglicht die gleichzeitige Verfolgung von Lebensdauer und molekularen Markern.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Diese Forschung wurde unterstützt von NIH Grant AG043080 und der National Natural Science Foundation of China (NSFC), Nr. 11434001. Wir danken Lucas Waldburger für das Korrekturlesen des Manuskripts.

1. Silizium-Wafer-Form Fabrication HINWEIS: Die Photomaske mit AutoCAD-Software und hergestellt von einem kommerziellen Unternehmen entwickelt wird. Dieser Entwurf enthält drei Schichten von verschiedenen Mustern ( <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55412/single_cell_trap.dwg" target="_blank">Zusatzdatei 1</a> ). Die Höhen der ersten, zweiten und dritten Schichten sind etwa 4 um, 10 um und 50 um betragen. Die Siliziumwafer Form wurde von der Photomaske unter Verwendung von Softlithographie 9, 10 geschaffen. <ol><li> Bake einen Siliziumwafer bei 200 ° C für 10 min des Wasserdampf zu verdampfen. Schleuderbeschichtungs negativer Photoresist SU-8 auf den Siliziumwafer. HINWEIS: Schleuderbeschichtung SU-8 3005 bei 5000 rpm für 30 s, die erste Schicht zu erzeugen, SU-8 2010, um 3.000 Umdrehungen pro Minute für 30 s, die zweite Schicht und SU-8 3025 bei 2000 Umdrehungen pro Minute zu erzeugen, für 30 s die erzeugen dritte Schicht. </li><li> Soft-Backen des beschichteten Wafers vor ter Musterübertragung. Richten und den Wafer in „direkten Kontakt“ -Modus mit einer Mask Aligner aus. HINWEIS: Soft-bake des Wafer für 2 min bei 95 ° C für die erste Schicht, 3 min bei 95 ° C für die zweite Schicht, und 15 min bei 95 ° C für die dritte Schicht. Verwenden , um die Belichtungsdosis bei 100 mJ / cm 2 für die erste Schicht, 130 mJ / cm 2 für die zweite Schicht, und 200 mJ / cm 2 für die dritte Schicht. </li><li> Nach der Belichtung Nacherwärmung des Wafers und entwickelt es SU-8-Entwickler verwendet. Trocknen der Wafer ein N 2 -Pistole und hart bake der Wafer bei 200 ° C für 30 min verwendet wird . HINWEIS: Der Siliziumwafer Form ist an einem 15 cm-Durchmesser-Petrischale aus Kunststoff Scotch Klebeband, mit dem Muster Seite nach oben weist. Normalerweise stellen wir mehrere identische Chipstrukturen auf der gleichen Form, die mehrere Mikrofluidik-Chips ermöglicht, zur gleichen Zeit hergestellt werden. Jede Form kann wiederverwendet werden viele Male Mikrofluidik-Chips herzustellen. </li></ol> 2. MikrofluidikChip-Herstellung <ol><li> Ein sauberes Wiegeschiffchen auf einer Waage und tariert. Gießen Sie 50 g PDMS Base in das Boot wiegen. </li><li> 5 g des PDMS Härtungsmittels zu dem Wiege Boot (w / w-Verhältnis von 1:10 bis das PDMS Base). Hinweis: Dieses Volumen wird basierend auf einem 15 cm-Durchmesser-Petrischale mit der Form. Justieren der Menge an Reagenz, wenn eine Petrischale mit einer anderen Größe verwendet wird. </li><li> Rühre das PDMS Base und des Härtungsmittels mit einer Einwegpipette. Beginnen vom Rand des Wägeschiffchen und langsam nach innen bewegen. Rühren Sie gründlich mehrere Minuten, bis kleine Blasen in der Mischung zu bilden; Durchmischung ist für PDMS Polymerisation von wesentlicher Bedeutung. </li><li> Die Mischung langsam in die Petrischale; Die Mischung muss die Siliziumwafer Form vollständig bedecken. </li><li> Platzieren Sie die Petrischale in einem Vakuum für 10 min alle Luftblasen aus der PDMS-Gemisch zu entfernen. Wenn Blasen auf der Oberfläche des Gemisches bleiben, verwenden Sie eine Pipette sie auszublasen. </li><li> Inkubieren des SiliziumsWafer-Form mit PDMS in einem Ofen bei 75 ° C für ca. 2 h. </li><li> abschälen sanft die Schicht aus polymerisiertem PDMS aus der Siliziumwafer Form, eine Beschädigung der Konstruktion der Waferform zu vermeiden. Alternativ dazu schneiden die PDMS direkt aus dem Siliziumwafer Form mit einer mindestens 5 mm-Rand um das Muster einer einzigen Kante industriellen Rasierklinge; leicht schälen die PDMS-Schicht von der Waferform. </li><li> Platzieren Sie die PDMS-Schicht auf der Bank mit der Musterseite nach oben weist. Sorgfältig schnitt den einzelnen Chip mit einer einzigen Kante industrieller Rasierklinge aus, eine ausreichende Marge von der Kante eines jeden einzelnen Chips Haltekonstruktion Schäden zu vermeiden. </li><li> Mit dem Muster Seite nach oben, mit einem Stanzstift (0,75 mm ID) Löcher stanzen gerade nach unten durch die Einlass- und Auslass-Kreise auf jeder Seite der Kanäle. HINWEIS: Diese Löcher den Weg für den Fluss des Mediums erstellen. Daher ist es entscheidend, durch die Kreise zu gehen und den ganzen Weg durch die PDMS-Schicht stanzen. Stellen Sie sicher, dassdie PDMS Spalten aus dem Loch entfernen. </li><li> Prüfen jedes gestanzte Loch durch den Stempel Pen-Nadel wieder Einsetzen in das Loch. Achten Sie darauf, die Nadel von der anderen Seite herauskommen kann, was darauf hinweist, dass es keine Blockade. Klebeband am Musteroberfläche, dann vorsichtig abzuschälen das Band Staubpartikel zu reinigen. Wiederholen Sie diesen Schritt mindestens dreimal. Lassen Sie ein sauberes Stück Klebeband auf dem PDMS Sterilisation zu pflegen. </li><li> Wiederholen Sie diesen Vorgang auf der gegenüberliegenden Seite des PDMS und lassen auf als auch das letzte Stück Klebeband. </li><li> Vorbereiten einer 24 mm x 30 mm Deckglas mit einer Dicke von 0,13-0,17 mm. Spray 70% igem Ethanol auf dem Glas und trocken mit Staubentferner die Oberfläche zu sterilisieren; Zusätzlich kann das Glas mit autoklaviertem Wasser gewaschen und mit Staubentferner gewaschen werden. </li><li> Überträgt das Abdeckglas und PDMS auf eine Kunststoffplatte. Entfernen Sie das Klebeband von dem PDMS und legen Sie das Muster nach oben. Vermeiden Sie jeden Kontakt mit der Musteroberfläche während der Übertragung. </li><li&gt; Platzieren Sie die Kunststoffplatte in der Plasmamaschine. Anwenden Sauerstoffplasmabehandlung zu dem PDMS, und das Deckglases, die Oberflächen hydrophil mit den folgenden Betriebsparametern zu machen: Belichtung, 75 s; Gasstabilisierung, 20 cc / min; Druck, 200; und Leistung, 100 W. </li><li> Legen Sie das PDMS auf das Deckglas, sowohl hydrophile Oberflächen (die Oberflächen, die während der Plasmabehandlung konfrontiert up) verbindet. Stellen Sie sicher, dass es keine Luftblasen zwischen dem PDMS und dem Deckglas. </li><li> Inkubieren des PDMS-Chip in einem Ofen bei 75 ° C für mindestens 2 h. HINWEIS: Mangelhafte Mikrofluidik während des Experiments Flüssigkeitsleckage auf das Mikroskop führen kann. Daher ist es wichtig, durch leichte die Bindung zwischen dem PDMS und dem Deckglas zu überprüfen, die PDMS von den Kanten mit einer Pinzette angehoben wird. Anheben sanft die PDMS sollte es aus dem Deckglas nicht trennen, eine erfolgreiche Bindung anzeigt. </li></ol> 3. Vorbereitung für das Experiment <ol><li&gt; Rohrvorbereitung. <ol><li> Unterzutauchen die Eingangs- und Ausgangsrohre in 70% Ethanollösung separat 1 Tag vor dem PDMS-Chip Zubereitung. </li><li> Füllen Sie eine 5-ml-Spritze mit autoklaviertem Wasser, um die Rohre zu waschen. Wäscht jedes Rohr durch an der Spritze das Rohr verstopfen und das Rohr mit Wasser zu spülen. </li><li> Wiederholen des Waschschritt mindestens 3 mal Ethanol Rückstand zu reinigen. </li></ol></li><li> Untersuchen Sie die PDMS-Kanäle unter einem optischen Mikroskop mit einem 10X-Objektiv, um sicherzustellen, ist die Struktur konsistent und intakt. Stabilisierung des PDMS-Chips auf dem Mikroskopplattform unter Verwendung eines Scotch-Band. HINWEIS: Stellen Sie mehrere Chips auf einmal in Schritt 2, um sicherzustellen, dass es Backup-Chips, vor allem, wenn das Gerät zum ersten Mal machen. </li><li> Füllen Sie eine 5-ml-Spritze mit autoklaviertem Wasser. Sichern der Spritze an eine Spritzenpumpe und legen die entsprechenden Eingangs- und Ausgangsröhren. Stellen Sie die Waschgeschwindigkeit auf 750 &amp; mgr; l / h, den Chip für etwa 10 Minuten zu spülen. Die Luftblasen in den Zweigkanälensollte in dieser Zeit weggespült werden; wenn verbleibenden Blasen sind, stellen Sie manuell die Geschwindigkeit der Blasen zu beseitigen. </li><li> Hefe-Probenvorbereitung. <ol><li> 1 ml der vorbereiteten Hefeprobe (OD 600 0,6-0,8) in zwei 1,5 ml - Mikrozentrifugenröhrchen und zentrifugiert für 5 min bei 3.000 x g. </li><li> Entfernen Sie die Mehrheit des Überstandes aus jedem Röhrchen und den Rest kombinieren, um eine 0,5 ml Probe zu bilden. </li></ol></li><li> Pause, um die Spritzenpumpe und entfernen die Eingangsrohre von dem PDMS-Chip. </li><li> Manuell Umkehren der Spritzenpumpe eine kleine Luftblase (1 bis 2 cm in der Länge) in jedes Eingangsrohr zu saugen. Bewegen auf in der Hefe Probe zu saugen; die Luftblase wird die Probe Grenze zeigen, und zeigt, wie viel Probe gezogen wurde. HINWEIS: Vermeiden Sie die Probe in die Spritze zu saugen. </li><li> Setzen Sie das Eingangsrohr zurück in den PDMS-Chip und starten die Pumpe die Zellen mit einer Geschwindigkeit von 750 &amp; mgr; l / h zu laden. </li><li> Lassen Sie die Spritzenpumpe über 10 min dern und untersucht die Zellenbelastung Progression unter dem Mikroskop; ein erfolgreicher Laden wird Trap-Zellen, die unter mehr als 60% der Säule suspendieren. </li><li> Wechseln Sie zu Ernährung Lösung und stellen Sie die Geschwindigkeit auf 400 &amp; mgr; l / h für die Zellkultur. </li><li> Wählen Beobachtungspositionen für das Mikroskop. HINWEIS: Für Lebensdauer Messungen wurden Bilder einmal mit einem 40x-Objektiv alle 15 min durch ein optisches Mikroskop aufgenommen. Für die fluoreszierende Reporter Analyse wurden Bilder, die einmal mit einem 60X Öl Ziel alle 15 min durch ein Fluoreszenzmikroskop entnommen. </li></ol>

<ol><li>Mortimer, R. K., Johnston, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Life+span+of+individual+yeast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Life span of individual yeast cells.</a> Nature. 183 (4677), 1751-1752 (1959).</li>
<li>Polymenis, M., Kennedy, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+biology%3A+High-tech+yeast+ageing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cell biology: High-tech yeast ageing.</a> Nature. 486 (7401), 37-38 (2012).</li>
<li>Xie, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+phenotyping+of+aging+in+single+yeast+cells+using+a+novel+microfluidic+device%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Molecular phenotyping of aging in single yeast cells using a novel microfluidic device.</a> Aging Cell. 11 (4), 599-606 (2012).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+analysis+of+yeast+replicative+aging+using+a+new+generation+of+microfluidic+device%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Single cell analysis of yeast replicative aging using a new generation of microfluidic device.</a> PLoS One. 7 (11), e48275(2012).</li>
<li>Chen, K. L., Crane, M. M., Kaeberlein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+technologies+for+yeast+replicative+lifespan+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Ageing+Dev%22%5BJournal%5D)">Microfluidic technologies for yeast replicative lifespan studies.</a> Mech Ageing Dev. , (2016).</li>
<li>Lee, S. S., Avalos Vizcarra,, Huberts, I., H, D., Lee, L. P., Heinemann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+lifespan+microscopic+observation+of+budding+yeast+aging+through+a+microfluidic+dissection+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Whole lifespan microscopic observation of budding yeast aging through a microfluidic dissection platform.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (13), 4916-4920 (2012).</li>
<li>Huberts, D. H., Janssens, G. E., Lee, S. S., Vizcarra, I. A., Heinemann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous+high-resolution+microscopic+observation+of+replicative+aging+in+budding+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Continuous high-resolution microscopic observation of replicative aging in budding yeast.</a> J Vis Exp. (78), e50143(2013).</li>
<li>Jo, M. C., Liu, W., Gu, L., Dang, W., Qin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+analysis+of+yeast+replicative+aging+using+a+microfluidic+system%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">High-throughput analysis of yeast replicative aging using a microfluidic system.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (30), 9364-9369 (2015).</li>
<li>Mata, A., Fleischman, A. J., Roy, S. <a target="_blank" href="http://iopscience.iop.org/article/10.1088/0960-1317/16/2/012/meta">Fabrication of multi-layer SU-8 microstructures.</a> Journal of Micromechanics and Microengineering. 16 (2), 276-284 (2006).</li>
<li>Xia, Y. N., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.annualreviews.org/doi/abs/10.1146/annurev.matsci.28.1.153">Soft lithography.</a> Angewandte Chemie-International Edition. 37 (5), 550-575 (1998).</li>
<li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIH+Image+to+ImageJ%3A+25+years+of+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li>
<li>Xie, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+telomerase+inactivation+accelerates+aging+independently+of+telomere+length%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Early telomerase inactivation accelerates aging independently of telomere length.</a> Cell. 160 (5), 928-939 (2015).</li>
<li>Boy-Marcotte, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+heat+shock+response+in+yeast%3A+differential+regulations+and+contributions+of+the+Msn2p%2FMsn4p+and+Hsf1p+regulons%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The heat shock response in yeast: differential regulations and contributions of the Msn2p/Msn4p and Hsf1p regulons.</a> Mol Microbiol. 33 (2), 274-283 (1999).</li>
<li>Yang, X., Lau, K. Y., Sevim, V., Tang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+principles+of+the+yeast+G1%2FS+switch%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Design principles of the yeast G1/S switch.</a> PLoS Biol. 11 (10), e1001673(2013).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Das PDMS-Gerät muss frisch hergestellt werden. Andernfalls werden die Luftblasen, die durch Rohre in die Vorrichtung eingefügt schwer zu entfernen. Schritt 3.4 ist wichtig, um die Zellbeladungseffizienz zu verbessern, indem die Zellen konzentriert. Um den Durchsatz des Experimentes zu erhöhen, 4 bis 6-Module auf dem gleichen Chip verbunden PDMS unabhängig arbeitende Pumpen typischerweise verwendet werden, durchzuführen 4 bis 6 verschiedene Experimente (verschiedene Stämme oder Medienzusammensetzungen) gleichzeitig. ...

Bäckerhefe ist ein leistungsfähiger Modellorganismus in der Altersforschung. Jedoch beruht eine herkömmliche Assay Lebensdauer in Hefe auf Mikrodissektion, was nicht nur arbeitsintensiv , sondern auch geringen Durchsatz gleich 1, 2. Darüber hinaus ist die traditionelle microdissection Ansatz bieten nicht eine detaillierte Ansicht der verschiedenen zellulären und molekularen Merkmalen in den einzelnen Mutterzellen, während sie altern. Die Entwicklung von Mikrofluidik - Vorrichtungen ist ein automatisiertes Verfahren zur Messung der Lebensdauer Hefe sowie zu folgen molekularen Marker und verschiedene zelluläre Phänotypen in der gesamten Lebensdauer der Mutterzellen 3, 4, 5, 6, 7, 8 freigegeben. Nach Hefezellen in eine Mikrofluidik-Vorrichtung geladen werden, können sie unter einem Mikroskop automatische zeit Runden unter Verwendung nachgeführte Bildgebung. Mit Hilfe von Bildverarbeitungswerkzeugen können verschiedene zelluläre und molekulare Phänotypen 3 extrahiert werden, 6, 8, einschließlich der Lebensdauer, Größe, Fluoreszenz - Reporter, Zellmorphologie, Zellzyklus - Dynamik usw., von denen viele schwer oder unmöglich zu erhalten ist unter Verwendung von die traditionellen Mikrodissektionsverfahren. Mikrofluidik - Vorrichtungen haben Prominenz in Hefe - Aging Forschung seit ihrer erfolgreichen Entwicklung gewonnen vor einigen Jahren 3, 4, 6, 7. Mehrere Gruppen haben auf Variationen der früheren Entwürfen 5 und viele Hefe - Labors haben mikrofluidischen Vorrichtungen anschließend veröffentlicht für ihre Studie beschäftigt. In einer Zellkultur exponentielles Wachstum erfährt, die Zahl der im Alter von Mutterzellen, die für die Beobachtung verfügbar sind, ist miniscule. Daher ist das allgemeine Konstruktionsprinzip der Mikrofluidik-Vorrichtung für Lebensdauer-Messungen Mutterzellen zu binden und Tochterzellen zu entfernen. Eine solche Konstruktionen machen Gebrauch von der Tatsache, dass Hefe Teilung asymmetrische Zelle unterzogen wird. Die Strukturen in dem Gerät Fall größere Mutterzellen und ermöglichen kleinere Tochterzellen weggespült werden. Der Mikrofluidik - Chip in diesem Artikel beschrieben ist, verwendet ein weiches Polydimethylsiloxan (PDMS) pad (vertikale pensile Spalten) abzufangen Mutterzellen (Abbildung 1). Geräte ähnlicher Bauart wurden bereits 3, 4, berichtet 6, 7. Dieses Protokoll verwendet ein einfacheres Verfahren mikrofluidischen Vorrichtungen herzustellen und eine einfache zellLadeVerfahren, die für die Zeitraffer-Imaging Experimente optimiert ist. Einer der wichtigsten Parameter in der Mikrofluidik-Vorrichtung ist die Breite der zu stoppen Mutterzellen verwendet PDMS-Pads. unsere device verwendet breitere Pads, die mehr Mutterzellen unter jedem Pad halten können, darunter ein großer Anteil der frischen Mutterzellen, die während ihrer gesamten Lebensdauer verfolgt werden können. Neben Lebensdauer Messungen ist dieses Protokoll für einzelne Zelle Zeitraffer-Imaging Experimente nützlich, wenn die Zellen während der gesamten Lebensdauer für viele Generationen oder wenn eine Beobachtung verfolgt werden müssen, ist notwendig.

<table><tbody><tr><td>3'' < 111> Siliziumwafer</td><td>Addison Engineering</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SU-8 2000 und 3000 Serie</td><td>MicroChem</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sylgard&reg; 184 Silikonelastomer Kit</td><td>ellsworth</td><td>2065622</td><td>Enthält Sylgard&reg; Silikonelastomerbasis und Härter</td></tr><tr><td>Petrischalen</td><td>VWR</td><td>391-1502</td><td></td></tr><tr><td>Harris Uni-core&trade; Stanze (I.D. 0,75 mm)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td>29002513</tr><tr><td>24 mm x 40 mm SLIP-RITE&reg; Deckglas</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>102440</td><td></td></tr><tr><td>3M Scotch Tape</td><td>ULINE</td><td>S-10223</td><td></td></tr><tr><td>VWR&reg; Rasierklingen</td><td>VWR</td><td>55411-050</td><td></td></tr><tr><td>Reines Ethanol, Koptec</td><td>VWR</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>Whoosh-Duster & Handel;</td><td>VWR</td><td>16650-027</td><td></td></tr><tr><td>5 mL BD Spritze (Luer-Lock&trade; Tip)</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>309646</td><td></td></tr><tr><td>PTFE Standard Wall Tubing (100 ft, AWG Größe: 22, Nenn-ID: 0,028)</td><td>Komponentenlieferfirma</td><td>SWTT-22</td><td></td></tr><tr><td>Nadelsortiment</td><td>Komponentenzulieferfirma</td><td>NEKIT-1</td><td></td></tr><tr><td>Exsikkator</td><td>HACH</td><td>2238300</td><td></td></tr><tr><td>Laborofen</td><td>Fisher Scientific</td><td>13246516GAQ</td><td></td></tr><tr><td>Nikon TE2000 Mikroskop mit 40X und 60X Objektiv</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Axio Observer Z1 mit 40X und 60X Objektiv</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spritzenpumpe</td><td>Longerpump</td><td>TS-1B</td><td></td></tr></tbody></table>

mikrofluidik-geräte mit measure lebensdauer und cellular phänotypen in einzel budding hefezellen

Using Microfluidic Devices to Measure Lifespan and Cellular Phenotypes in Single Budding Yeast Cells

Die knospende Hefe Saccharomyces cerevisiae ist ein wichtiger Modellorganismus in der Alternsforschung. Genetische Studien haben viele Gene mit konservierten Auswirkungen auf die Lebensdauer aller Arten aufgedeckt. Die molekularen Ursachen des Alterns und des Todes sind jedoch nach wie vor schwer fassbar. Um ein systematisches Verständnis der molekularen Mechanismen zu erlangen, die der Hefealterung zugrunde liegen, benötigen wir Hochdurchsatzmethoden, um die Lebensdauer zu messen und verschiedene zelluläre und molekulare Phänotypen in einzelnen Zellen zu quantifizieren. Zuvor haben wir mikrofluidische Geräte entwickelt, um knospende Hefe-Mutterzellen während ihrer gesamten Lebensdauer zu verfolgen, während neugeborene Tochterzellen weggespült werden. In diesem Artikel wird eine Methode zur Herstellung von mikrofluidischen Chips und zum Aufbau von mikrofluidischen Experimenten vorgestellt. Mehrere Kanäle können verwendet werden, um Zellen gleichzeitig unter verschiedenen Bedingungen oder von verschiedenen Hefestämmen zu verfolgen. Ein typischer Aufbau kann Hunderte von Zellen pro Kanal verfolgen und ermöglicht eine hochauflösende Mikroskopbildgebung über die gesamte Lebensdauer der Zellen. Unsere Methode ermöglicht auch eine detaillierte Charakterisierung der Lebensdauer, der molekularen Marker, der Zellmorphologie und der Zellzyklusdynamik einzelner Zellen. Darüber hinaus ist unser mikrofluidisches Gerät in der Lage, eine beträchtliche Menge frischer Mutterzellen einzufangen, die durch nachgeschaltete Bildanalyse identifiziert werden können, wodurch es möglich ist, die Lebensdauer mit höherer Genauigkeit zu messen.

Nach den Experimenten können die Lebensdauer der Zellen und viele zelluläre und molekulare Phänotypen aus den aufgezeichneten Zeitraffer-Bilder extrahiert werden. Da es eine Reihe von verschiedenen Funktionen, die von jeder Zelle entnommen werden kann, ist der erste Schritt der Analyse der Zellen und Ereignisse mit Anmerkungen zu versehen, einschließlich der Positionen und Grenzen der Zellen und dem Timing der verschiedenen Ereignisse, die verfolgt werden, wie beispiels wie die angehende...

Dieser Artikel stellt ein Protokoll für die Herstellung von Mikrofluidik-Chips und der Aufbau von mikrofluidischen Experimenten optimiert, um die Lebensdauer und zellulären Phänotypen einzelner Hefezellen zu messen.

Mikrofluidik-Geräte mit Measure Lebensdauer und Cellular Phänotypen in Einzel Budding Hefezellen

Budding yeast Saccharomyces cerevisiae is an important model organism in aging research. Genetic studies have revealed many genes with conserved effects ...

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments besteht darin, ein spezialisiertes mikrofluidisches Gerät herzustellen und es zur Messung der Lebensdauer sowie der zellulären Phänotypen einer einzelnen Hefezelle zu verwenden. Diese Methode kann helfen, einige zentrale Fragen im Bereich der Hefealterung zu beantworten, beispielsweise warum Mutterzellen altern und sterben und welche frühen molekularen Ereignisse zum Verlust der zellulären Homöostase und letztlich zur Zellalterung und zum Zelltod führen. Der entscheidende Vorteil dieser Technik liegt darin, dass wir Mutterzellen verfolgen, ihre Lebensdauer dokumentieren und gleichzeitig verschiedene molekulare Marker analysieren können, sodass wir nach molekularen Ereignissen suchen können, die mit der Lebensdauer korrelieren.Obwohl diese Methode Einblicke in die Hefealterung ermöglichen kann, ist sie auch auf andere Bereiche anwendbar, beispielsweise die Überwachung sekundärer Reaktionen auf Interventionen, die die Zellkontrolle über viele Generationen erfordern. Im Allgemeinen haben Personen, die mit dieser Methode neu sind, Schwierigkeiten, da die Herstellung mikrofluidischer Geräte, das Beladen der Zellen und die Mikroskop-Einstellung v

using-microfluidic-devices-to-measure-lifespan-cellular-phenotypes

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Chronologischer Alterung in Hefe bezieht sich auf den Verlust der Lebensfähigkeit der Zellen mit der Zeit in der stationären Phase assoziiert. Hier beschreiben wir eine High-Throughput-Verfahren zur quantitativen Bestimmung Hefe chronologische Lebensspanne.

Die Quantifizierung der Hefe Chronologisches Life Span durch Auswachsen von gealterten Zellen

In diesem Artikel präsentieren wir ein allgemeines Protokoll zur Messung der replikativen Lebensspanne von Hefe Mutter-Zellen.

Mess-replikative Lebensspanne in der Hefe

Hier beschreiben wir eine Reihe von DNA Mutationsassays, dass mit der Hefe chronologische Lebensspanne Modell, um die Gene / Wege, oder regeln dazu beitragen, genomische DNA Instabilität während des Alterns Studie kombiniert werden können.

Studieren Altersabhängige genomische Instabilität mit der S. cerevisiae Chronologisch Lebensdauer Modell

Wir stellen eine einfache Methode zur mikrofluidischen Vorrichtungen, die nach vergleichbaren dynamischen Bedingungen, um mehrere verschiedene Stämme zu produzieren, ohne die Notwendigkeit für einen Reinraum oder weiche Lithographie.

Einer mikrofluidischen Vorrichtung für ein Studium mehrere verschiedene Stämme

Wir beschreiben hier den Betrieb einer mikrofluidischen Vorrichtung, die eine kontinuierliche und hochauflösende mikroskopische Bildgebung einzelner knospenden Hefezellen ermöglicht während ihres kompletten replikativen und / oder chronologischer Lebensdauer.

Kontinuierliche Hochauflösende mikroskopische Beobachtung Replikative Aging in Bäckerhefe

Wir präsentieren ein einfaches Protokoll zur Fluoreszenzmikroskopie Filme von wachsenden Hefezellen und eine GUI-basierte Software-Paket, um Single-Cell-Zeitreihen extrahieren zu erhalten. Die Analyse umfasst automatisierte Linie und Teilung Zeitzuweisung mit Sichtprüfung und manuelle curation der verfolgten Daten integriert.

Acquiring Fluoreszenz Zeitraffer-Filme von Bäckerhefe und Analysieren von Einzel-Zell-Dynamics mit Transplantaten

In diesem Protokoll wird die Herstellung, der Aufbau und die grundlegende Bedienung eines mikrofluidischen Pikoliter-Bioreaktors (PLBR) für die Einzelzellanalyse von prokaryotischen Mikroorganismen vorgestellt. Industriell relevante Mikroorganismen wurden als Proof of Principle analysiert, was Einblicke in die Wachstumsrate, Morphologie und phänotypische Heterogenität über bestimmte Zeiträume ermöglicht, was mit herkömmlichen Methoden kaum möglich ist.

Mikrofluidischer Picoliter-Bioreaktor für die mikrobielle Einzelzellanalyse: Herstellung, Systemaufbau und Betrieb

Wir stellen eine Methode zur Quantifizierung von Wachstumsphänotypen einzelner Hefezellen dar, da sie in festen Medien unter Verwendung der Zeitraffer-Mikroskopie in Kolonien aufwachsen, die als eine zellige Verdopplungsbewertung von lebenden Arrays von Hefe (ODELAY) bezeichnet werden. Die Populations-Heterogenität von genetisch identischen Zellen, die zu Kolonien wachsen, kann direkt beobachtet und quantifiziert werden.

ODELAY: Eine groß angelegte Methode für die Mehrparameter-Quantifizierung des Hefewachstums

Wir präsentieren Ihnen eine Methode zur Analyse von einzelnen Bakterienzelle Linien mit Bacillus Subtilis als Beispiel mikrofluidischen. Die Methode überwindet Mängel der traditionellen analytischen Methoden in der Mikrobiologie durch Beobachtung von Hunderten von Generationen der Zelle unter eng kontrollierbar und einheitliche Wachstumsbedingungen ermöglicht.

Einzellige mikrofluidischen Analyse von Bacillus subtilis

Hier ist ein Protokoll, um genetische Wechselwirkungen durch eine erhöhte Kopierzahl Suppressor-Bildschirm in Saccharomyces cerevisiaezu identifizieren. Diese Methode ermöglicht es Forschern, Suppressoren in kurzlebigen Hefemutanten zu identifizieren, zu klonen und zu testen. Wir testen den Effekt der Erhöhung der Kopierzahl von SIR2 auf die Lebensdauer in einem autophagy null Mutant.

Ein Suppressor-Bildschirm zur Charakterisierung genetischer Links, die die chronologische Lebensdauer in Saccharomyces cerevisiae regulieren

Hefewachstumsphänotypen werden präzise durch hochparallele Zeitraffer-Bildgebung von immobilisierten Zellen gemessen, die zu Mikrokolonien heranwachsen. Gleichzeitig können Stresstoleranz, Proteinexpression und Proteinlokalisierung überwacht werden, wodurch integrierte Datensätze generiert werden, um zu untersuchen, wie ökologische und genetische Unterschiede sowie die Genexpressionsheterogenität unter isogenen Zellen das Wachstum modulieren.

High-Throughput Live Imaging von Mikrokolonien zur Messung der Heterogenität in Wachstum und Genexpression

Lernen Sie die Herstellung mikrofluidischer Geräte zur Messung der Lebensdauer und zellulärer Phänotypen einzelner Hefemutterzellen. Diese Methode ermöglicht die gleichzeitige Verfolgung von Lebensdauer und molekularen Markern.

Mikrofluidik-Geräte mit Measure Lebensdauer und Cellular Phänotypen in Einzel Budding Hefezellen

Weitere Videos entdecken