Name: Mikrofluidik-Geräte mit Measure Lebensdauer und Cellular Phänotypen in Einzel Budding Hefezellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 18 s
Description: Lernen Sie die Herstellung mikrofluidischer Geräte zur Messung der Lebensdauer und zellulärer Phänotypen einzelner Hefemutterzellen. Diese Methode ermöglicht die gleichzeitige Verfolgung von Lebensdauer und molekularen Markern.

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Diese Forschung wurde unterstützt von NIH Grant AG043080 und der National Natural Science Foundation of China (NSFC), Nr. 11434001. Wir danken Lucas Waldburger für das Korrekturlesen des Manuskripts.

1. Silizium-Wafer-Form Fabrication HINWEIS: Die Photomaske mit AutoCAD-Software und hergestellt von einem kommerziellen Unternehmen entwickelt wird. Dieser Entwurf enthält drei Schichten von verschiedenen Mustern ( <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55412/single_cell_trap.dwg" target="_blank">Zusatzdatei 1</a> ). Die Höhen der ersten, zweiten und dritten Schichten sind etwa 4 um, 10 um und 50 um betragen. Die Siliziumwafer Form wurde von der Photomaske unter Verwendung von Softlithographie 9, 10 geschaffen. <ol><li> Bake einen Siliziumwafer bei 200 ° C für 10 min des Wasserdampf zu verdampfen. Schleuderbeschichtungs negativer Photoresist SU-8 auf den Siliziumwafer. HINWEIS: Schleuderbeschichtung SU-8 3005 bei 5000 rpm für 30 s, die erste Schicht zu erzeugen, SU-8 2010, um 3.000 Umdrehungen pro Minute für 30 s, die zweite Schicht und SU-8 3025 bei 2000 Umdrehungen pro Minute zu erzeugen, für 30 s die erzeugen dritte Schicht. </li><li> Soft-Backen des beschichteten Wafers vor ter Musterübertragung. Richten und den Wafer in „direkten Kontakt“ -Modus mit einer Mask Aligner aus. HINWEIS: Soft-bake des Wafer für 2 min bei 95 ° C für die erste Schicht, 3 min bei 95 ° C für die zweite Schicht, und 15 min bei 95 ° C für die dritte Schicht. Verwenden , um die Belichtungsdosis bei 100 mJ / cm 2 für die erste Schicht, 130 mJ / cm 2 für die zweite Schicht, und 200 mJ / cm 2 für die dritte Schicht. </li><li> Nach der Belichtung Nacherwärmung des Wafers und entwickelt es SU-8-Entwickler verwendet. Trocknen der Wafer ein N 2 -Pistole und hart bake der Wafer bei 200 ° C für 30 min verwendet wird . HINWEIS: Der Siliziumwafer Form ist an einem 15 cm-Durchmesser-Petrischale aus Kunststoff Scotch Klebeband, mit dem Muster Seite nach oben weist. Normalerweise stellen wir mehrere identische Chipstrukturen auf der gleichen Form, die mehrere Mikrofluidik-Chips ermöglicht, zur gleichen Zeit hergestellt werden. Jede Form kann wiederverwendet werden viele Male Mikrofluidik-Chips herzustellen. </li></ol> 2. MikrofluidikChip-Herstellung <ol><li> Ein sauberes Wiegeschiffchen auf einer Waage und tariert. Gießen Sie 50 g PDMS Base in das Boot wiegen. </li><li> 5 g des PDMS Härtungsmittels zu dem Wiege Boot (w / w-Verhältnis von 1:10 bis das PDMS Base). Hinweis: Dieses Volumen wird basierend auf einem 15 cm-Durchmesser-Petrischale mit der Form. Justieren der Menge an Reagenz, wenn eine Petrischale mit einer anderen Größe verwendet wird. </li><li> Rühre das PDMS Base und des Härtungsmittels mit einer Einwegpipette. Beginnen vom Rand des Wägeschiffchen und langsam nach innen bewegen. Rühren Sie gründlich mehrere Minuten, bis kleine Blasen in der Mischung zu bilden; Durchmischung ist für PDMS Polymerisation von wesentlicher Bedeutung. </li><li> Die Mischung langsam in die Petrischale; Die Mischung muss die Siliziumwafer Form vollständig bedecken. </li><li> Platzieren Sie die Petrischale in einem Vakuum für 10 min alle Luftblasen aus der PDMS-Gemisch zu entfernen. Wenn Blasen auf der Oberfläche des Gemisches bleiben, verwenden Sie eine Pipette sie auszublasen. </li><li> Inkubieren des SiliziumsWafer-Form mit PDMS in einem Ofen bei 75 ° C für ca. 2 h. </li><li> abschälen sanft die Schicht aus polymerisiertem PDMS aus der Siliziumwafer Form, eine Beschädigung der Konstruktion der Waferform zu vermeiden. Alternativ dazu schneiden die PDMS direkt aus dem Siliziumwafer Form mit einer mindestens 5 mm-Rand um das Muster einer einzigen Kante industriellen Rasierklinge; leicht schälen die PDMS-Schicht von der Waferform. </li><li> Platzieren Sie die PDMS-Schicht auf der Bank mit der Musterseite nach oben weist. Sorgfältig schnitt den einzelnen Chip mit einer einzigen Kante industrieller Rasierklinge aus, eine ausreichende Marge von der Kante eines jeden einzelnen Chips Haltekonstruktion Schäden zu vermeiden. </li><li> Mit dem Muster Seite nach oben, mit einem Stanzstift (0,75 mm ID) Löcher stanzen gerade nach unten durch die Einlass- und Auslass-Kreise auf jeder Seite der Kanäle. HINWEIS: Diese Löcher den Weg für den Fluss des Mediums erstellen. Daher ist es entscheidend, durch die Kreise zu gehen und den ganzen Weg durch die PDMS-Schicht stanzen. Stellen Sie sicher, dassdie PDMS Spalten aus dem Loch entfernen. </li><li> Prüfen jedes gestanzte Loch durch den Stempel Pen-Nadel wieder Einsetzen in das Loch. Achten Sie darauf, die Nadel von der anderen Seite herauskommen kann, was darauf hinweist, dass es keine Blockade. Klebeband am Musteroberfläche, dann vorsichtig abzuschälen das Band Staubpartikel zu reinigen. Wiederholen Sie diesen Schritt mindestens dreimal. Lassen Sie ein sauberes Stück Klebeband auf dem PDMS Sterilisation zu pflegen. </li><li> Wiederholen Sie diesen Vorgang auf der gegenüberliegenden Seite des PDMS und lassen auf als auch das letzte Stück Klebeband. </li><li> Vorbereiten einer 24 mm x 30 mm Deckglas mit einer Dicke von 0,13-0,17 mm. Spray 70% igem Ethanol auf dem Glas und trocken mit Staubentferner die Oberfläche zu sterilisieren; Zusätzlich kann das Glas mit autoklaviertem Wasser gewaschen und mit Staubentferner gewaschen werden. </li><li> Überträgt das Abdeckglas und PDMS auf eine Kunststoffplatte. Entfernen Sie das Klebeband von dem PDMS und legen Sie das Muster nach oben. Vermeiden Sie jeden Kontakt mit der Musteroberfläche während der Übertragung. </li><li&gt; Platzieren Sie die Kunststoffplatte in der Plasmamaschine. Anwenden Sauerstoffplasmabehandlung zu dem PDMS, und das Deckglases, die Oberflächen hydrophil mit den folgenden Betriebsparametern zu machen: Belichtung, 75 s; Gasstabilisierung, 20 cc / min; Druck, 200; und Leistung, 100 W. </li><li> Legen Sie das PDMS auf das Deckglas, sowohl hydrophile Oberflächen (die Oberflächen, die während der Plasmabehandlung konfrontiert up) verbindet. Stellen Sie sicher, dass es keine Luftblasen zwischen dem PDMS und dem Deckglas. </li><li> Inkubieren des PDMS-Chip in einem Ofen bei 75 ° C für mindestens 2 h. HINWEIS: Mangelhafte Mikrofluidik während des Experiments Flüssigkeitsleckage auf das Mikroskop führen kann. Daher ist es wichtig, durch leichte die Bindung zwischen dem PDMS und dem Deckglas zu überprüfen, die PDMS von den Kanten mit einer Pinzette angehoben wird. Anheben sanft die PDMS sollte es aus dem Deckglas nicht trennen, eine erfolgreiche Bindung anzeigt. </li></ol> 3. Vorbereitung für das Experiment <ol><li&gt; Rohrvorbereitung. <ol><li> Unterzutauchen die Eingangs- und Ausgangsrohre in 70% Ethanollösung separat 1 Tag vor dem PDMS-Chip Zubereitung. </li><li> Füllen Sie eine 5-ml-Spritze mit autoklaviertem Wasser, um die Rohre zu waschen. Wäscht jedes Rohr durch an der Spritze das Rohr verstopfen und das Rohr mit Wasser zu spülen. </li><li> Wiederholen des Waschschritt mindestens 3 mal Ethanol Rückstand zu reinigen. </li></ol></li><li> Untersuchen Sie die PDMS-Kanäle unter einem optischen Mikroskop mit einem 10X-Objektiv, um sicherzustellen, ist die Struktur konsistent und intakt. Stabilisierung des PDMS-Chips auf dem Mikroskopplattform unter Verwendung eines Scotch-Band. HINWEIS: Stellen Sie mehrere Chips auf einmal in Schritt 2, um sicherzustellen, dass es Backup-Chips, vor allem, wenn das Gerät zum ersten Mal machen. </li><li> Füllen Sie eine 5-ml-Spritze mit autoklaviertem Wasser. Sichern der Spritze an eine Spritzenpumpe und legen die entsprechenden Eingangs- und Ausgangsröhren. Stellen Sie die Waschgeschwindigkeit auf 750 &amp; mgr; l / h, den Chip für etwa 10 Minuten zu spülen. Die Luftblasen in den Zweigkanälensollte in dieser Zeit weggespült werden; wenn verbleibenden Blasen sind, stellen Sie manuell die Geschwindigkeit der Blasen zu beseitigen. </li><li> Hefe-Probenvorbereitung. <ol><li> 1 ml der vorbereiteten Hefeprobe (OD 600 0,6-0,8) in zwei 1,5 ml - Mikrozentrifugenröhrchen und zentrifugiert für 5 min bei 3.000 x g. </li><li> Entfernen Sie die Mehrheit des Überstandes aus jedem Röhrchen und den Rest kombinieren, um eine 0,5 ml Probe zu bilden. </li></ol></li><li> Pause, um die Spritzenpumpe und entfernen die Eingangsrohre von dem PDMS-Chip. </li><li> Manuell Umkehren der Spritzenpumpe eine kleine Luftblase (1 bis 2 cm in der Länge) in jedes Eingangsrohr zu saugen. Bewegen auf in der Hefe Probe zu saugen; die Luftblase wird die Probe Grenze zeigen, und zeigt, wie viel Probe gezogen wurde. HINWEIS: Vermeiden Sie die Probe in die Spritze zu saugen. </li><li> Setzen Sie das Eingangsrohr zurück in den PDMS-Chip und starten die Pumpe die Zellen mit einer Geschwindigkeit von 750 &amp; mgr; l / h zu laden. </li><li> Lassen Sie die Spritzenpumpe über 10 min dern und untersucht die Zellenbelastung Progression unter dem Mikroskop; ein erfolgreicher Laden wird Trap-Zellen, die unter mehr als 60% der Säule suspendieren. </li><li> Wechseln Sie zu Ernährung Lösung und stellen Sie die Geschwindigkeit auf 400 &amp; mgr; l / h für die Zellkultur. </li><li> Wählen Beobachtungspositionen für das Mikroskop. HINWEIS: Für Lebensdauer Messungen wurden Bilder einmal mit einem 40x-Objektiv alle 15 min durch ein optisches Mikroskop aufgenommen. Für die fluoreszierende Reporter Analyse wurden Bilder, die einmal mit einem 60X Öl Ziel alle 15 min durch ein Fluoreszenzmikroskop entnommen. </li></ol>

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<li>Polymenis, M., Kennedy, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+biology%3A+High-tech+yeast+ageing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cell biology: High-tech yeast ageing.</a> Nature. 486 (7401), 37-38 (2012).</li>
<li>Xie, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+phenotyping+of+aging+in+single+yeast+cells+using+a+novel+microfluidic+device%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Molecular phenotyping of aging in single yeast cells using a novel microfluidic device.</a> Aging Cell. 11 (4), 599-606 (2012).</li>
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<li>Yang, X., Lau, K. Y., Sevim, V., Tang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+principles+of+the+yeast+G1%2FS+switch%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Design principles of the yeast G1/S switch.</a> PLoS Biol. 11 (10), e1001673(2013).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Das PDMS-Gerät muss frisch hergestellt werden. Andernfalls werden die Luftblasen, die durch Rohre in die Vorrichtung eingefügt schwer zu entfernen. Schritt 3.4 ist wichtig, um die Zellbeladungseffizienz zu verbessern, indem die Zellen konzentriert. Um den Durchsatz des Experimentes zu erhöhen, 4 bis 6-Module auf dem gleichen Chip verbunden PDMS unabhängig arbeitende Pumpen typischerweise verwendet werden, durchzuführen 4 bis 6 verschiedene Experimente (verschiedene Stämme oder Medienzusammensetzungen) gleichzeitig. ...

Bäckerhefe ist ein leistungsfähiger Modellorganismus in der Altersforschung. Jedoch beruht eine herkömmliche Assay Lebensdauer in Hefe auf Mikrodissektion, was nicht nur arbeitsintensiv , sondern auch geringen Durchsatz gleich 1, 2. Darüber hinaus ist die traditionelle microdissection Ansatz bieten nicht eine detaillierte Ansicht der verschiedenen zellulären und molekularen Merkmalen in den einzelnen Mutterzellen, während sie altern. Die Entwicklung von Mikrofluidik - Vorrichtungen ist ein automatisiertes Verfahren zur Messung der Lebensdauer Hefe sowie zu folgen molekularen Marker und verschiedene zelluläre Phänotypen in der gesamten Lebensdauer der Mutterzellen 3, 4, 5, 6, 7, 8 freigegeben. Nach Hefezellen in eine Mikrofluidik-Vorrichtung geladen werden, können sie unter einem Mikroskop automatische zeit Runden unter Verwendung nachgeführte Bildgebung. Mit Hilfe von Bildverarbeitungswerkzeugen können verschiedene zelluläre und molekulare Phänotypen 3 extrahiert werden, 6, 8, einschließlich der Lebensdauer, Größe, Fluoreszenz - Reporter, Zellmorphologie, Zellzyklus - Dynamik usw., von denen viele schwer oder unmöglich zu erhalten ist unter Verwendung von die traditionellen Mikrodissektionsverfahren. Mikrofluidik - Vorrichtungen haben Prominenz in Hefe - Aging Forschung seit ihrer erfolgreichen Entwicklung gewonnen vor einigen Jahren 3, 4, 6, 7. Mehrere Gruppen haben auf Variationen der früheren Entwürfen 5 und viele Hefe - Labors haben mikrofluidischen Vorrichtungen anschließend veröffentlicht für ihre Studie beschäftigt. In einer Zellkultur exponentielles Wachstum erfährt, die Zahl der im Alter von Mutterzellen, die für die Beobachtung verfügbar sind, ist miniscule. Daher ist das allgemeine Konstruktionsprinzip der Mikrofluidik-Vorrichtung für Lebensdauer-Messungen Mutterzellen zu binden und Tochterzellen zu entfernen. Eine solche Konstruktionen machen Gebrauch von der Tatsache, dass Hefe Teilung asymmetrische Zelle unterzogen wird. Die Strukturen in dem Gerät Fall größere Mutterzellen und ermöglichen kleinere Tochterzellen weggespült werden. Der Mikrofluidik - Chip in diesem Artikel beschrieben ist, verwendet ein weiches Polydimethylsiloxan (PDMS) pad (vertikale pensile Spalten) abzufangen Mutterzellen (Abbildung 1). Geräte ähnlicher Bauart wurden bereits 3, 4, berichtet 6, 7. Dieses Protokoll verwendet ein einfacheres Verfahren mikrofluidischen Vorrichtungen herzustellen und eine einfache zellLadeVerfahren, die für die Zeitraffer-Imaging Experimente optimiert ist. Einer der wichtigsten Parameter in der Mikrofluidik-Vorrichtung ist die Breite der zu stoppen Mutterzellen verwendet PDMS-Pads. unsere device verwendet breitere Pads, die mehr Mutterzellen unter jedem Pad halten können, darunter ein großer Anteil der frischen Mutterzellen, die während ihrer gesamten Lebensdauer verfolgt werden können. Neben Lebensdauer Messungen ist dieses Protokoll für einzelne Zelle Zeitraffer-Imaging Experimente nützlich, wenn die Zellen während der gesamten Lebensdauer für viele Generationen oder wenn eine Beobachtung verfolgt werden müssen, ist notwendig.

<table><tbody><tr><td>3'' < 111> Siliziumwafer</td><td>Addison Engineering</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SU-8 2000 und 3000 Serie</td><td>MicroChem</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sylgard&reg; 184 Silikonelastomer Kit</td><td>ellsworth</td><td>2065622</td><td>Enthält Sylgard&reg; Silikonelastomerbasis und Härter</td></tr><tr><td>Petrischalen</td><td>VWR</td><td>391-1502</td><td></td></tr><tr><td>Harris Uni-core&trade; Stanze (I.D. 0,75 mm)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td>29002513</tr><tr><td>24 mm x 40 mm SLIP-RITE&reg; Deckglas</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>102440</td><td></td></tr><tr><td>3M Scotch Tape</td><td>ULINE</td><td>S-10223</td><td></td></tr><tr><td>VWR&reg; Rasierklingen</td><td>VWR</td><td>55411-050</td><td></td></tr><tr><td>Reines Ethanol, Koptec</td><td>VWR</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>Whoosh-Duster & Handel;</td><td>VWR</td><td>16650-027</td><td></td></tr><tr><td>5 mL BD Spritze (Luer-Lock&trade; Tip)</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>309646</td><td></td></tr><tr><td>PTFE Standard Wall Tubing (100 ft, AWG Größe: 22, Nenn-ID: 0,028)</td><td>Komponentenlieferfirma</td><td>SWTT-22</td><td></td></tr><tr><td>Nadelsortiment</td><td>Komponentenzulieferfirma</td><td>NEKIT-1</td><td></td></tr><tr><td>Exsikkator</td><td>HACH</td><td>2238300</td><td></td></tr><tr><td>Laborofen</td><td>Fisher Scientific</td><td>13246516GAQ</td><td></td></tr><tr><td>Nikon TE2000 Mikroskop mit 40X und 60X Objektiv</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Axio Observer Z1 mit 40X und 60X Objektiv</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spritzenpumpe</td><td>Longerpump</td><td>TS-1B</td><td></td></tr></tbody></table>

mikrofluidik-geräte mit measure lebensdauer und cellular phänotypen in einzel budding hefezellen

Using Microfluidic Devices to Measure Lifespan and Cellular Phenotypes in Single Budding Yeast Cells

Die knospende Hefe Saccharomyces cerevisiae ist ein wichtiger Modellorganismus in der Alternsforschung. Genetische Studien haben viele Gene mit konservierten Auswirkungen auf die Lebensdauer aller Arten aufgedeckt. Die molekularen Ursachen des Alterns und des Todes sind jedoch nach wie vor schwer fassbar. Um ein systematisches Verständnis der molekularen Mechanismen zu erlangen, die der Hefealterung zugrunde liegen, benötigen wir Hochdurchsatzmethoden, um die Lebensdauer zu messen und verschiedene zelluläre und molekulare Phänotypen in einzelnen Zellen zu quantifizieren. Zuvor haben wir mikrofluidische Geräte entwickelt, um knospende Hefe-Mutterzellen während ihrer gesamten Lebensdauer zu verfolgen, während neugeborene Tochterzellen weggespült werden. In diesem Artikel wird eine Methode zur Herstellung von mikrofluidischen Chips und zum Aufbau von mikrofluidischen Experimenten vorgestellt. Mehrere Kanäle können verwendet werden, um Zellen gleichzeitig unter verschiedenen Bedingungen oder von verschiedenen Hefestämmen zu verfolgen. Ein typischer Aufbau kann Hunderte von Zellen pro Kanal verfolgen und ermöglicht eine hochauflösende Mikroskopbildgebung über die gesamte Lebensdauer der Zellen. Unsere Methode ermöglicht auch eine detaillierte Charakterisierung der Lebensdauer, der molekularen Marker, der Zellmorphologie und der Zellzyklusdynamik einzelner Zellen. Darüber hinaus ist unser mikrofluidisches Gerät in der Lage, eine beträchtliche Menge frischer Mutterzellen einzufangen, die durch nachgeschaltete Bildanalyse identifiziert werden können, wodurch es möglich ist, die Lebensdauer mit höherer Genauigkeit zu messen.

Nach den Experimenten können die Lebensdauer der Zellen und viele zelluläre und molekulare Phänotypen aus den aufgezeichneten Zeitraffer-Bilder extrahiert werden. Da es eine Reihe von verschiedenen Funktionen, die von jeder Zelle entnommen werden kann, ist der erste Schritt der Analyse der Zellen und Ereignisse mit Anmerkungen zu versehen, einschließlich der Positionen und Grenzen der Zellen und dem Timing der verschiedenen Ereignisse, die verfolgt werden, wie beispiels wie die angehende...

Dieser Artikel stellt ein Protokoll für die Herstellung von Mikrofluidik-Chips und der Aufbau von mikrofluidischen Experimenten optimiert, um die Lebensdauer und zellulären Phänotypen einzelner Hefezellen zu messen.

Mikrofluidik-Geräte mit Measure Lebensdauer und Cellular Phänotypen in Einzel Budding Hefezellen

Budding yeast Saccharomyces cerevisiae is an important model organism in aging research. Genetic studies have revealed many genes with conserved effects ...

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments besteht darin, ein spezialisiertes mikrofluidisches Gerät herzustellen und es zur Messung der Lebensdauer sowie der zellulären Phänotypen einer einzelnen Hefezelle zu verwenden. Diese Methode kann helfen, einige zentrale Fragen im Bereich der Hefealterung zu beantworten, beispielsweise warum Mutterzellen altern und sterben und welche frühen molekularen Ereignisse zum Verlust der zellulären Homöostase und letztlich zur Zellalterung und zum Zelltod führen. Der entscheidende Vorteil dieser Technik liegt darin, dass wir Mutterzellen verfolgen, ihre Lebensdauer dokumentieren und gleichzeitig verschiedene molekulare Marker analysieren können, sodass wir nach molekularen Ereignissen suchen können, die mit der Lebensdauer korrelieren.Obwohl diese Methode Einblicke in die Hefealterung ermöglichen kann, ist sie auch auf andere Bereiche anwendbar, beispielsweise die Überwachung sekundärer Reaktionen auf Interventionen, die die Zellkontrolle über viele Generationen erfordern. Im Allgemeinen haben Personen, die mit dieser Methode neu sind, Schwierigkeiten, da die Herstellung mikrofluidischer Geräte, das Beladen der Zellen und die Mikroskop-Einstellung viel Übung erfordern, um erfolgreich durchgeführt zu werden. Eine vorherige Demonstration dieser Methode ist entscheidend, da es schwierig ist, das mikrofluidische Gerät korrekt mit Hefe zu beladen.Beginnen Sie damit, eine Siliziumwaferform für das Gerät mithilfe gängiger Verfahren herzustellen, wie im begleitenden Textprotokoll beschrieben. Legen Sie sie mit der strukturierten Seite nach oben in eine 15 cm große Petrischale. Sichern Sie die Form mit Klebeband auf der Petrischale.Als Nächstes ein sauberes Wiegeschälchen auf eine Waage stellen und die Waage tarieren. 50 Gramm PDMS-Basis in das Wiegeschälchen geben und anschließend fünf Gramm PDMS-Härter hinzufügen. Die PDMS-Basis und den Härter mit einer Einwegpipette vermischen.Beginnen Sie am Rand des Wiegebootes und bewegen Sie sich langsam nach innen. Rühren Sie die Mischung mehrere Minuten lang gründlich um, bis sich kleine Blasen in der gesamten Mischung bilden. Gießen Sie die Mischung langsam in die Petrischale, sodass sie die Siliziumwafer-Form vollständig bedeckt.Stellen Sie danach die Petrischale für 10 Minuten unter Vakuum, um alle Luftblasen aus der PDMS-Mischung zu entfernen. Falls nach dem Entfernen aus dem Vakuum noch Blasen auf der Oberfläche der Mischung vorhanden sind, blasen Sie diese mit einer Pipette weg. Anschließend das Gerät bei 75 Grad Celsius für zwei Stunden aushärten.Wenn die Probe wieder auf Raumtemperatur abgekühlt ist, vorsichtig mit einem Skalpell durch das PDMS um die Form schneiden und anschließend die Schicht des polymerisierten PDMS behutsam von der Siliziumwafer-Form ablösen, wobei darauf zu achten ist, dass die Struktur der Wafer-Form nicht beschädigt wird. Die PDMS-Schicht mit der strukturierten Seite nach oben auf die Arbeitsfläche legen. Jeden einzelnen Chip vorsichtig mit einer industriellen Rasierklinge mit einer scharfen Schneide ausschneiden, wobei ein ausreichender Rand zum jeweiligen Chiprand verbleiben sollte, um Beschädigungen der Struktur zu vermeiden.Wenden Sie die strukturierte Seite nach oben und stanzen Sie mit einem Lochstift senkrecht durch die Einlass- und Auslasskreise auf jeder Seite der Kanäle. Überprüfen Sie jedes Loch, indem Sie die Nadel des Lochstifts erneut in das Loch einführen. Stellen Sie sicher, dass die Nadel auf der anderen Seite austritt, was anzeigt, dass keine Verstopfungen vorliegen.Verwenden Sie anschließend das Klebeband, um Staubpartikel und Schmutz von der Oberseite zu entfernen. Wiederholen Sie diesen Schritt mindestens dreimal und lassen Sie ein sauberes Stück Tesafilm auf dem PDMS, um eine staubfreie Oberfläche zu gewährleisten. Drehen Sie dann das Gerät um und wiederholen Sie den Vorgang auf der gegenüberliegenden Seite des PDMS.Lassen Sie auch das letzte Stück Klebeband auf dieser Seite. Bereiten Sie nun eine Glasoberfläche für die Basis des Geräts vor. Wählen Sie das 24 Millimeter mal 30 Millimeter große Deckglas mit einer Dicke zwischen 13 und 17 Millimetern aus.Sprühen Sie 70 % Ethanol auf das Glas und trocknen Sie es mit einem Staubentferner, um die Oberfläche zu sterilisieren. Überführen Sie dann das Deckglas und das PDMS auf eine Kunststoffplatte. Entfernen Sie das Klebeband vom PDMS und platzieren Sie es mit der strukturierten Seite nach oben in der Platte, ohne die obere Oberfläche zu berühren.Überführen Sie die Platte anschließend in eine Plasma-Kammer. Führen Sie eine Sauerstoff-Plasma-Behandlung des PDMS und des Deckglases durch, um die Oberflächen hydrophil zu machen. Entfernen Sie danach die Platte aus der Plasma-Kammer und verbinden Sie vorsichtig die plasmabehandelten Oberflächen des PDMS mit dem Deckglas.Stellen Sie sicher, dass keine Luftblasen zwischen dem PDMS und dem Deckglas vorhanden sind. Überführen Sie das Gerät schließlich in einen Ofen und trocknen Sie es bei 75 Grad Celsius für mindestens zwei Stunden. Tauchen Sie die Ein- und Ausgangsröhrchen einen Tag vor der PDMS-Chip-Herstellung in eine 70 %ige Ethanol-Lösung ein.Am nächsten Tag füllen Sie eine Fünf-Milliliter-Spritze mit autoklaviertem Wasser und spülen jedes Rohr, indem Sie das Rohr auf die Spritze setzen und mit Wasser durchspülen. Wiederholen Sie den Spülschritt mindestens dreimal, um restliches Ethanol zu entfernen. Untersuchen Sie anschließend die PDMS-Kanäle unter einem optischen Mikroskop.Überprüfen Sie mithilfe eines 10×-Objektivs, ob die Strukturen konsistent und intakt sind. Stabilisieren Sie den intakten PDMS-Chip auf der Mikroskopplattform mit Klebeband. Befestigen Sie eine mit steriler Wasser beladene 5-mL-Spritze an einer Spritzenpumpe und führen Sie die entsprechenden Zu- und Ableitungen an dem Gerät ein.Stellen Sie die Durchflussrate auf 750 Mikroliter pro Stunde ein und spülen Sie den Chip etwa 10 Minuten lang aus. Beobachten Sie die Kanäle, um sicherzustellen, dass alle Luftblasen weggespült werden. Falls nach dem 10-minütigen Spülvorgang noch Blasen vorhanden sind, stellen Sie die Geschwindigkeit manuell so ein, dass die Blasen entfernt werden.Überführen Sie ein Milliliter einer vorbereiteten Hefeprobe in zwei 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen und zentrifugieren Sie die Proben fünf Minuten lang bei 3.000 × g. Entfernen Sie den größten Teil des Überstandes aus jedem Röhrchen und vereinigen Sie den Rest, um eine 5-Milliliter-Probe zu bilden. Nachdem die Hefeprobe nun bereit ist, nehmen Sie die Eingangsrohre vom PDMS-Chip ab. Drehen Sie die Spritzenpumpe manuell um, um in jedem Eingangsrohr eine kleine Luftblase von ein bis zwei Zentimeter Länge einzusaugen, und saugen Sie anschließend die Zellkulturen auf.Danach das Eingangsrohr wieder in den PDMS-Chip einsetzen und die Pumpe erneut starten, um die Zellen mit einer Geschwindigkeit von 750 µL pro Stunde zu laden. Die Spritzenpumpe 10 Minuten lang eingeschaltet lassen und anschließend den Fortschritt der Zellbeladung unter dem Mikroskop überprüfen. Bei einer erfolgreichen Beladung werden die Zellen unter mehr als 60 % der Aufhängesäulen festgehalten.Um die Hefezellen zu erhalten, wechseln Sie die Lösung in der Spritze zu einer Nährlösung und stellen die Geschwindigkeit auf 400 Mikroliter pro Stunde ein. Das Lebensdauer-Phänotyp der Hefe kann durch Zählen der von jeder eingefangenen Mutterzelle gebildeten Knospen und Schätzen des Kaplan-Meier-Schätzers ermittelt werden. Mit diesem Protokoll fängt das Gerät häufig frische Tochterzellen ein, die sich von bereits eingefangenen Zellen abgeknospet haben.Diese Zellen entwickeln sich anschließend zu frischen Mutterzellen, die mithilfe nachgeschalteter Bildanalyse-Software identifiziert werden können. Diese frischen Mutterzellen ermöglichen eine genauere Lebensdauermessung. In diesem Experiment war die durchschnittliche Lebensdauer der frischen Mutterzellen geringfügig länger, und zwar um etwa zwei Generationen.Neben der Anzahl der Knospen kann aus den Bildgebungsdaten auch das Zeitintervall zwischen zwei aufeinanderfolgenden Knospungsereignissen ermittelt werden. Die Knospung verlangsamt sich gegen Ende der Lebensdauer deutlich, was auf den ungefundenen Zustand dieser alternden Zellen hinweist. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, sowohl einen frisch hergestellten Chip zu verwenden, um Blasenbildung zu vermeiden, als auch die Zellkonzentration zu erhöhen, um bei Bedarf die Effizienz der Zellbeladung zu verbessern.Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Forschern auf dem Gebiet der Hefealterung den Weg, um die frühen molekularen Veränderungen zu untersuchen, die ursächlich für das Alterungsphänotyp sind. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man diese mikrofluidische Vorrichtung herstellt und wie man sie zur Messung der Lebensdauer und zellulärer Phänotypen in Einzelzellen verwendet.

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Research

Forschung

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Biology

Biologie

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Mikrofluidik-Geräte mit Measure Lebensdauer und Cellular Phänotypen in Einzel Budding Hefezellen

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