Name: Eine einfache und effiziente Methode, um Makrophagen aus Mixed primären Kulturen von adulten Leber Zellen zu isolieren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 10 s
Description: Lernen Sie eine einfache Methode zur Isolierung von Makrophagen aus primären Leberzellkulturen von Ratten mittels selektiver Adhäsion. Diese Technik liefert reine Zellen ohne komplexe Geräte.

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Diese Arbeit wurde durch ein Forschungsstipendium und ein Grant-in-Aid aus dem Food Nanotechnologie Projekt des Ministeriums für Landwirtschaft, Forsten und Fischerei Japans. Finanzierte

1. Perfusion der Leber <ol><li> Anesthetize ein erwachsenes Männchen Sprague-Dawley Ratten (bei 10 bis 15 Wochen alten, Körpergewicht 150-200 g) durch eine intraperitoneale Injektion von Natrium-Pentobarbital-Lösung (50 mg Natrium-Pentobarbital / kg Körpergewicht). </li><li> Legen Sie das Tier in eine rostfreie Pfanne und Spray 70% Ethanol auf seinen Bauch und Brustkorb. </li><li> Machen Sie einen kleinen Schnitt und Abziehen der Haut. Öffnen Sie den Unterleib durch den Schnitt mit einer Schere. </li><li> Bestätigen Sie den Speicherort der Pfortader, übergeben Sie einen chirurgischen Faden unter der Pfortader und lose Klumpen. </li><li> Clump den distalen Teil der Vena cava inferior und Vena mesenterica Blut Rückfluss in die Leber zu verhindern. Öffnen Sie die Brusthöhle, indem die Membran mit einer Schere, und setzen das Herz. </li><li> Legen Sie eine Kunststoff-Katheter (2 mm Durchmesser) in die Pfortader und ziehen Sie den Faden fest um den Katheter. </li><li> Verbinden Sie den Katheter zu einer Perfusion System, das mit Waschlösung (Ca 2 +-Mg 2 + free HBSS mit 0,5 mM EGTA, 10 mM HEPES und 4,2 mM NaHCO 3, pH 7,2) geladen wird vorgewärmt auf 37 ° C. </li><li> Begin Perfusion in situ mit einer Geschwindigkeit von 10 ml / min. Zur gleichen Zeit, einen Schnitt im rechten Vorhof Wand. Weiter Perfusion für 10 min. </li><li> Schalten Sie die Perfusionslösung zu Kollagenase-Lösung [10 mM HEPES HBSS und 4,2 NaHCO 3 mit Typ I Kollagenase ergänzt (0,05%) und Trypsin-Inhibitor (50 ug / ml); pH 7,5] und perfuse für 10 bis 20 min mit einer Rate von 10 ml / min, bis die Leber leicht anschwillt und zeigt das Zeichen für den Zerfall der Leber-Struktur unter Serosa. </li></ol> 2. Vorbereitung der Parenchymale Hepatocyte-rich Zellfraktion <ol><li> Entfernen und transferieren es vorsichtig in der Leber in ein steriles Becherglas mit 25 ml Kollagenase-Lösung. Mince in kleine Stücke schneiden mit der Schere. </li><li> Fügen Sie 75 ml kaltem MEM in die resultierende Zellsuspension. Nach einer sanften Pipettieren, Filtrat durch eine Zelle Sieb (100 um) zu entfernen, Bindegewebe und unverdaute Gewebeteile. </li><li> Das Filtrat in 50 ml konische Röhrchen und zentrifugieren bei 50 xg für 1 min bei 4 ° C (Bremse aus). </li><li> Den Überstand sorgfältig entfernen. Das Pellet mit kaltem MEM. </li><li> Wiederholen 2,4) dreimal. </li></ol> 3. Mixed Primary Kultur von Leberzellen <ol><li> Suspend die Zellen in 2,5 erhalten) in das Wachstumsmedium DMEM mit 10% Hitze-inaktiviertem FCS, mit 100 uM β-Mercaptoethanol, 10 pg / ml Insulin, 100 ug / ml Streptomycin und 100 U / ml Penicillin und Samen in Ergänzung zusammen fünf vor zehn Zellkulturflaschen (Fläche: 75 cm 2) bei einer Dichte von 6,7 x 10 4 Zellen / cm 2 (5 x 10 6 Zellen / Kolben / 12 -15 ml Medium). </li><li> Inkubieren Sie die flasksat 37 ° C in einer Atmosphäre von 5% CO 2 bis 95% Luft. </li><li> Ersetzen Sie das Nährmedium alle 2 bis 3 Tage Abständen. </li></ol> 4. Selektive Isolierung von Makrophagen <ol><li> Nach 12 Tagen der Kultur, vermehren Makrophagen auf der Zellschicht. Diese Zellen sind durch gegenseitige ausgesetzt Schütteln der Kulturflaschen bei 80 bis 120 Hüben pro Minute für 30 Minuten bei 37 ° C. </li><li> Übertragen Sie die Kulturmedium in 100 mm nicht Gewebekultur grade Plastikschalen. Pool des Mediums aus zwei T75-Kolben in eine Plastikschale. Refill Kulturflaschen mit dem Nährmedium und bringt sie in den Inkubator. </li><li> Inkubieren Plastikschalen für 30 min bei 37 ° C in einer Atmosphäre von 5% CO 2 bis 95% Luft. Makrophagen leicht auf nicht-Gewebekultur grade Plastikschalen unter dieser Inkubation Prozess anhängen, während andere kontaminierenden Zellen nicht. </li><li> Saugen Sie das Medium und sanft spülen Sie die Plastikschale mit PBS. Wiederholen Sie diesen Schritt dreimal. </li><li> 1 ml TrypLE Express-Lösung in die Schüssel, und Inkubation für 10min bei 37 ° C in einer Atmosphäre von 5% CO 2 bis 95% Luft. </li><li> Add 9 ml des Nährmediums. Vorsichtig abkratzen der beigefügten Makrophagen durch einen Zellschaber. </li><li> Übertragen Sie die Zellsuspension in ein konisches 15 ml Tube und zentrifugieren bei 180 xg für 5 min bei 25 ° C (Bremse). </li><li> Überstand verwerfen und 1 ml Wachstumsmedium. Distanzieren in einzelne Zellen durch kräftiges Pipettieren. Zählt die Anzahl der Zellen durch eine Zählkammer-Zählen. </li><li> Isolation Schritte können mit der gleichen Kulturflaschen auf zwei vor drei tägigen Intervallen für mehr als zwei Wochen wiederholt werden. </li><li> Isolierte Makrophagen in das Nährmedium in 3.1 beschrieben kultiviert werden. </li></ol> 5. Repräsentative Ergebnisse Ein Beispiel für eine gemischte primäre Kultur der erwachsenen Ratte Leberzellen ist in Abbildung 2 dargestellt. Parenchymale Hepatozyten verlieren die Epithelzellen Morphologie innerhalb von wenigen Tagen in Kultur, degenerieren oder Umwandlung in Fibroblasten-ähnlichen Zellen.Dann um den Tag von 6 bis 12, Phasenkontrast-helle, runde Makrophagen-ähnlichen Zellen vigourouly wuchern auf den Fibroblasten Zell-Blatt. Durch Schütteln der Kulturflaschen, sind Makrophagen leicht in das Kulturmedium suspendiert und nachfolgende Übertragung und Inkubation in Plastikschalen in selektiven Adhäsion von Makrophagen (Abbildung 3) führen. Die Makrophagen-ähnlichen Zellen können so früh wie Tag 8 geerntet werden, und die Zahlen erreicht maximal Werte an den Tagen 12 bis 14. Mehr als 10 6 Zellen können aus einer T75 Kulturflasche geerntet wiederholt werden auf 2 bis 3 Tage-Intervallen für mehr als zwei Wochen, so dass insgesamt Zelle Ertrag pro Flasche von 10 7 pro T75 Kulturflasche (Abbildung 3). Die Reinheiten der isolierten Makrophagen wurden 95 bis 99%, wie durch Durchflusszytometrie oder Immunzytochemie mit Ratten-Makrophagen-spezifischen Antikörpern, wie ED-1 (Abbildung 4), ED-3, OX-41 (Abbildung 4) und Iba1 9. Bewertet Die isolierten Zellen zeigen typische Merkmale von Makrophagen, wie aktive Phagozytose von polystylene Perlen (Abbildung 5), proliferative Reaktion auf rekombinantes GM-CSF, die Sekretion von entzündlichen / anti-inflammatorischen Zytokinen nach Stimulation mit LPS, und die Bildung von vielkernigen Riesenzellen 9. <img src="/files/ftp_upload/2757/2757fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Ein Schema für die selektive Isolierung und Aufreinigung von Makrophagen-ähnliche Zellen aus gemischten Primärkultur von Leberzellen. <img src="/files/ftp_upload/2757/2757fig2.jpg" alt="Abbildung 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2. Primäre Kultur der Leberzellen und die Proliferation von Makrophagen-ähnlichen Zellen. Der Pfeil zeigt eine mehrkernige Riesenzelle. Maßstab = 100 um. Nachdruck aus der Zeitschrift für Immunologische Methoden, Vol.360, 47-55 (2010) 9 mit Genehmigung von Elsevier. <img src="/files/ftp_upload/2757/2757fig3.jpg" alt="Abbildung 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 3"> Abbildung 3. Selektive Isolierung von Makrophagen-ähnliche Zellen, die durch das Schütteln und Befestigungsart. Die Zellen wurden in das Kulturmedium durch Schütteln der Kolben suspendiert, anschließend in nicht-Gewebekultur grade Plastikschalen übertragen, und bei 37 ° C. Bereits 10 min nach dem Ausplattieren, Makrophagen-ähnlichen Zellen an das Gericht Oberfläche, während andere verunreinigende Fibroblasten-Zellen blieb suspendiert. Nach dem Spülen mit PBS wurde ein hochreines Makrophagen Bevölkerung erhalten. Diese Zellen gewonnen typischen Makrophagen Morphologie nach 40 min der Kultur, und mitotischen Zellen wurden häufig beobachtet (Pfeile). Nachträgliche Änderungen in Zellzahlen von Flaschen in verschiedenen Kultur Perioden erholt gezeigt. Die Werte sind im Durchschnitt ± SD 3-5 Flaschen. Die Experimente wurden dreimal wiederholt und die Daten sind durch unterschiedliche Symbole gekennzeichnet. Maßstab = 100 um. Nachdruck aus der Zeitschrift für Immunologische Methoden, Vol.360, 47-55 (2010) 9 mit Genehmigung von Elsevier. <img src="/files/ftp_upload/2757/2757fig4.jpg" alt="Abbildung 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 4"> Abbildung 4. Immunzytochemische Färbung von Makrophagen-ähnliche Zellen mit monoklonalen Antikörpern gegen Ratten-Makrophagen. <img src="/files/ftp_upload/2757/2757fig5.jpg" alt="Abbildung 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 5"> Abbildung 5. Phagozytose von FITC-markierten Mikrokugeln durch Makrophagen-ähnlichen Zellen.

<ol><li>Crispe, I. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+liver+as+a+lymphoid+organ%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The liver as a lymphoid organ.</a> Annu. Rev. Immunol. 27, 147-163 (2009).</li>
<li>Roberts, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+Kupffer+cell+in+mediating+hepatic+toxicity+and+carcinogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Role of the Kupffer cell in mediating hepatic toxicity and carcinogenesis.</a> Toxicol. Sci. 96, 2-15 (2007).</li>
<li>Gao, B., Jeong, W. I., Tian, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver%3A+An+organ+with+predominant+innate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Liver: An organ with predominant innate immunity.</a> Hepatology. 47, 729-736 (2008).</li>
<li>Janousek, J., Strmen, E., Gervais, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+murine+Kupffer+cells+by+centrifugal+elutriation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Purification of murine Kupffer cells by centrifugal elutriation.</a> J. Immunol. Methods. 164, 109-117 (1993).</li>
<li>Olynyk, J. K., Clarke, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+primary+culture+of+rat+Kupffer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gastroenterol.+Hepatol%22%5BJournal%5D)">Isolation and primary culture of rat Kupffer cells.</a> J. Gastroenterol. Hepatol. 13, 842-845 (1998).</li>
<li>Heuff, G., Meyer, S., Beelen, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+rat+and+human+Kupffer+cells+by+a+modified+enzymatic+assay%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Isolation of rat and human Kupffer cells by a modified enzymatic assay.</a> J. Immunol. Methods. 174, 61-65 (1994).</li>
<li>Seglen, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+isolated+rat+liver+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Preparation of isolated rat liver cells.</a> Methods Cell Biol. 13, 29-83 (1976).</li>
<li>Yoshioka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+culture+and+expression+of+cytokine+mRNAs+by+lipopolysaccharide+in+bovine+Kupffer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Vet.+Immunol.+Immunopathol%22%5BJournal%5D)">Primary culture and expression of cytokine mRNAs by lipopolysaccharide in bovine Kupffer cells.</a> Vet. Immunol. Immunopathol. 58, 155-163 (1997).</li>
<li>Kitani, H., Takenouchi, T., Sato, M., Yoshioka, M., Yamanaka, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+isolation+method+for+macrophage-like+cells+from+mixed+primary+cultures+of+adult+rat+liver+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">A novel isolation method for macrophage-like cells from mixed primary cultures of adult rat liver cells.</a> J. Immunol. Methods. 360, 47-55 (2010).</li>
<li>Gorrell, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+fibrosis%3A+the+hepatocyte+revisited%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Liver fibrosis: the hepatocyte revisited.</a> Hepatology. 46, 1659-1661 (2007).</li>
</ol>

Alle Tiere wurden gehalten und betrieben in der Tierhaltung in der National Institute of Animal Health, nach den Richtlinien und Vorschriften her durch die Institution des Ausschusses für Tierversuche eingestellt.

Hier berichten wir über eine einfache und effiziente Methode, um Makrophagen aus dem gemischten primären Kulturen von adulten Ratten Leberzellen zu erhalten. Unsere Methode beruht zunächst auf dem Roman proliferative Aktivität von Makrophagen in der Mischkultur von Leberzellen, und anschließender Isolierung und Aufreinigung dieser Zellen auf der Basis ihrer biologischen Eigenschaften wie Makrophagen 9. Es kann möglich sein die Makrophagen in der gemischten Primärkultur von erwachsenen Leberzellen vermehrt könnte von Kupffer oder verwandten Zellen, die in den parenchymatösen Hepatozyten Bruchteil kontaminierten entstanden sein. Die Makrophagen könnte zu spezifischen Veränderungen der Umwelt durch Umwandlung von parenchymatösen Hepatozyten 10 und andere Fibroblasten-Zellen in der gemischten primären Kulturen verursacht geantwortet haben. Zusammenfassend bietet unsere Methode Isolierung von Makrophagen-ähnlichen Zellen in ausreichender Zahl und Reinheit aus dem primären Kultur von Rattenleber cellswithout mit hoch entwickelten Geräten und technischen Fähigkeiten. Darüber hinaus kann die Isolierung Verfahren mit der gleichen Kulturflasche für mehr als zwei Wochen wiederholt werden. Diese Methode könnte auch für andere Säugetierarten.

<table border="1"><tbody><tr><th> Name des Reagenzes </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nummer </th><th> Kommentare (optional) </th></tr><tr><td> Natrium-Pentobarbital-Lösung </td><td> Kyoritsu Seiyaku </td><td> Somnopentyl Injection </td><td></td></tr><tr><td> Hanks balanced salt solution (HBSS) </td><td> Invitrogen </td><td> 14185-052 </td><td></td></tr><tr><td> Ethylenglykol tetraessigsäure (EGTA) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> E-4378 </td><td></td></tr><tr><td> Collagenase </td><td> Wako Pure Chemical Industries, Ltd </td><td> 032-10534 </td><td> Zelldissoziation grade (Lot Check erforderlich) </td></tr><tr><td> Trypsin-Inhibitor </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T-9128 </td><td></td></tr><tr><td> Eagle Minimum Essential Medium (MEM) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M-4655 </td><td></td></tr><tr><td> Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D-6459 </td><td> Hohe Glukose-Typ </td></tr><tr><td> Fötalem Kälberserum (FCS) </td><td> HyClone </td><td> SH30070.03 </td><td> Wärme bei 56 ° C für 30 min inaktiviert. (Lot Check erforderlich) </td></tr><tr><td> TrypLE Express </td><td> Invitrogen </td><td> 12605 </td><td></td></tr><tr><td> Dulbeccos Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) </td><td> Invitrogen </td><td> 14190 </td><td> Ca 2 +-Mg 2 + frei </td></tr><tr><td> β-Mercaptoethanol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M-7522 </td><td> Stock: 100 mM in destilliertem Wasser </td></tr><tr><td> Insulin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> I-5500 </td><td> Stock: 10 mg / ml in 0,1 N HCl </td></tr><tr><td> Penicillin / Streptomycin </td><td> Invitrogen </td><td> 15070 </td><td></td></tr><tr><td> Zellsieb </td><td> BD Biosciences </td><td> 352360 </td><td> Maschenweite: 100 pm </td></tr><tr><td> Zellkulturflasche </td><td> Sumitomo Bakelite Co., Ltd </td><td> MS-21250 </td><td> Fläche: 75 cm 2 </td></tr><tr><td> Non-Gewebekultur Plastikschalen </td><td> BD Biosciences </td><td> 351005 </td><td></td></tr><tr><td> Zellschaber </td><td> Corning Inc. </td><td> 3010 </td><td></td></tr><tr><td> Gegenseitige Schüttler </td><td> TAITEC </td><td> NR-1 </td><td></td></tr></tbody></table>

eine einfache und effiziente methode, um makrophagen aus mixed primären kulturen von adulten leber zellen zu isolieren

A Simple and Efficient Method to Isolate Macrophages from Mixed Primary Cultures of Adult Liver Cells

Kupffer-Zellen sind Leber-spezifische Makrophagen und spielen eine wichtige Rolle in der physiologischen und pathologischen Funktionen der Leber 1-3. Obwohl die Isolierung Methoden der Leber Makrophagen wurden gut beschrieben 4-6, erfordern die meisten dieser Methoden gehobene Ausstattung, wie eine Zentrifugalkraft elutriator und technischen Fähigkeiten. Hier bieten wir eine neuartige Methode zur Leber Makrophagen in ausreichender Zahl und Reinheit zu erhalten aus gemischten primären Kulturen von adulten Ratten Leberzellen, wie in Abbildung 1 schematisch dargestellt. Nach Dissoziation der Leberzellen durch Zwei-Schritt-Perfusion-Methode 7,8, einem Bruchteil meist parenchymatösen Hepatozyten besteht vorbereitet und entkernt in T75 Zellkulturflaschen mit Kulturmedium DMEM und 10% FCS.Parenchymal Hepatozyten besteht verlieren die Epithelzellen Morphologie innerhalb von wenigen Tagen in Kultur, degenerieren oder Umwandlung in Fibroblasten-ähnlichen Zellen (Abbildung 2). Wie die Kultur geht, um den Tag 6, Phasenkontrast-hellen, starten rund Makrophagen-ähnlichen Zellen auf die Fibroblasten Zellrasen vermehren (Abbildung 2). Das Wachstum der Makrophagen-ähnlichen Zellen weiter und erreichen Höchstwerte um 12 Tage, für die Zellschicht auf der Flasche Oberfläche. Durch Schütteln der Kulturflaschen, sind Makrophagen leicht in das Kulturmedium suspendiert. Nachfolgende Übertragung und kurze Inkubation in Plastikschalen Ergebnis der selektiven Adhäsion von Makrophagen (Abbildung 3), wo andere kontaminierenden Zellen suspendiert bleiben. Nach mehreren Spülungen mit PBS, angeschlossen sind Makrophagen geerntet. Mehr als 10 6 Zellen können wieder aus dem gleichen T75 Zellkulturflasche auf zwei vor drei tägigen Intervallen geerntet werden für mehr als zwei Wochen (Abbildung 3). Die Reinheiten der isolierten Makrophagen wurden 95 bis 99%, wie mittels Durchflusszytometrie ausgewertet oder Immunzytochemie mit Ratten-Makrophagen-spezifischen Antikörpern (Abbildung 4). Die isolierten Zellen zeigen aktive Phagozytose von polystylene Perlen (Abbildung 5), proliferative Reaktion auf rekombinantes GM-CSF, die Sekretion von entzündlichen / anti-inflammatorischen Zytokinen nach Stimulation mit LPS und Bildung vielkernigen Riesenzellen 9. Abschließend stellen wir eine einfache und effiziente Methode, um Leber-Makrophagen in ausreichender Zahl und Reinheit zu erhalten, ohne komplexe Anlagen und skills.This Methode auf andere Säugetierarten können.

Eine neuartige Methode, um Makrophagen aus primären Kultur von Leberzellen zu erhalten, ist beschrieben. Diese Methode nutzt die Proliferation von Makrophagen in der Kultur, durch Schütteln der Kulturflaschen und Reinigung durch selektive Bindung an Plastikschalen gefolgt. Diese Technik bietet effiziente Leber Makrophagen ohne komplexe Anlagen und Fähigkeiten.

Eine einfache und effiziente Methode, um Makrophagen aus Mixed primären Kulturen von adulten Leber Zellen zu isolieren

Kupffer-Zellen sind leverspezifische residente Makrophagen und spielen eine wichtige Rolle bei den physiologischen und pathologischen Funktionen der Leber1-3. Obwohl ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, mehrere Makrophagenkulturen aus gemischten primären Kulturen von Rattenleberzellen zu gewinnen, ohne komplexe Ausrüstung oder spezielle Fähigkeiten zu benötigen. Dies wird zunächst durch die Dissoziation von Leberzellen erwachsener Ratten mittels Kollagenase-Perfusion erreicht, gefolgt von der Isolierung der parenchymalen Hepatozyten-Fraktion. Anschließend werden die Zellen in T-75-Zellkulturgefäßen mit Wachstumsmedium inkubiert, um gemischte primäre Leberzellkulturen anzulegen.Danach werden die Kulturgefäße nach 10 bis 12 Tagen Kultivierung geschüttelt, um die Übertragung der Makrophagen auf Kunststoffschalen zu erleichtern, von denen sie anschließend nach einer kurzen Inkubationsphase durch selektive Adhärenz gewonnen werden. Schließlich können mehr als 10 der sechs Zellen wiederholt aus denselben T-75-Zellkulturgefäßen im Abstand von zwei bis drei Tagen über einen Zeitraum von mehr als zwei Wochen gewonnen werden. Isolationsmethoden für Lebermakrophagen sind ausführlich beschrieben worden.Jedoch erfordern die meisten bisherigen Methoden aufwendige Geräte, wie einen Zentrifugal-Illustrator, und ausgefeilte technische Fähigkeiten. Hier stellen wir eine einfache und neuartige Methode vor, um Lebermakrophagen in ausreichender Zahl und Reinheit aus gemischten primären Kulturen erwachsener umhüllter Leberzellen zu gewinnen, die keiner speziellen Ausrüstung oder fortgeschrittener Laborkenntnisse bedarf. Die Tiersektion, die Leberperfusion und die Zellpräparation werden von den Ärzten Norco, Yamanaka und Miko Yoshioka am Nationalen Institut für Tiergesundheit demonstriert.Danach wird Dr. Taketo Takeno vom Nationalen Institut für Agrarbiowissenschaften die Isolierung und Reinigung von Lebermakrophagen aus Kulturgefahren demonstrieren. Beginnen wir also. Um die Perfusion der Rattenleber vorzubereiten, erwärmen Sie zunächst eine Flasche Waschlösung und eine Flasche Kollagenaselösung vor.Danach nach Bestätigung der Sedierung durch eine Hautquetschung einen anästhesierten erwachsenen männlichen Rat in einer Edelstahlschale platzieren und 70 %igen Ethanol auf den Bauch und die Brust sprühen. Anschließend mit einer Präzisionsschere einen kleinen Schnitt in der Mitte des Bauches machen und die Haut zurückklappen. Danach den Bauch mit der Schere öffnen und die Lage der Pfortader bestätigen.Als Nächstes führen Sie den chirurgischen Faden unter die Pfortader und ziehen den Faden locker an. Danach klemmen Sie den distalen Teil der unteren Hohlvene und der mesenterialen Vene mit einer feinen Klemme ab, um einen Blutrückfluss in die Leber zu verhindern. Öffnen Sie die Brusthöhle, indem Sie das Zwerchfell mit einer Schere durchtrennen, und setzen Sie nach einer kleinen Inzision in der Pfortader mit Augenchirurgieschere einen zwei Millimeter großen Kunststoffkatheter in die Vene ein und ziehen den Faden fest um den Katheter.Füllen Sie ein Perfusionsystem mit der vorgewärmten Spüllösung und verbinden Sie es anschließend mit dem Katheter. Beginnen Sie die Perfusion in C zwei mit einer Geschwindigkeit von 10 Milliliter pro Minute. Gleichzeitig schneiden Sie mit der Präzisionsschere eine Öffnung in die Wand des rechten Vorhofs.Führen Sie die Perfusion 10 Minuten lang fort, wechseln Sie dann die Perfusionslösung zur Kollagenase-Lösung und perfundieren Sie 10 bis 20 Minuten lang. Füllen Sie bei einem Fluss von 10 Milliliter pro Minute einen sterilen Becher mit 25 Milliliter Kollagenase-Lösung. Entfernen Sie dann die perfundierte Leber und legen Sie sie vorsichtig in den Becher.Den Leber mit einer Schere in kleine Stücke zerkleinern. 75 Milliliter kaltes MEM zur resultierenden Zellsuspension hinzufügen. Nach vorsichtigem Pipettieren die Suspension durch einen 100-Mikrometer-Zellsieb filtern.Um das Bindegewebe in den undigested Gewebefragmenten zu entfernen, sammeln Sie das Filtrat in 50-Milliliter-Konischgefäßen. Überführen Sie das Filtrat in 50-Milliliter-Konischgefäße und waschen Sie die Zellen viermal, indem Sie die Zellen zunächst bei 50 Gs für eine Minute bei vier Grad Celsius abzentrifugieren. Mit der Bremse ausschalten, entfernen Sie vorsichtig das Überstand und resuspendieren anschließend das Pellet in kaltem MEM, bevor Sie die Zellen nach der letzten Wäsche erneut abzentrifugieren.Suspendieren Sie die Leberzellen erneut in Wachstumsmedium. Impfen Sie die Zellen nun in fünf bis zehn T-75-Zellkulturgefäßen mit einer Dichte von 6,7 × 10⁴ Zellen pro Quadratzentimeter aus. Stellen Sie die Kulturgefäße in einen Inkubator und wechseln Sie das Wachstumsmedium alle zwei bis drei Tage.Nach einem Tag der Kultur breiten sich die parenchymalen Hepatozyten auf der Flächenoberfläche des Kolbens aus und zeigen eine typische polygonale, kieselsteinartige Morphologie mit einem oder zwei runden Kernen. Innerhalb weniger Tage verlieren die parenchymalen Hepatozyten ihre epitheliale Zellmorphologie und wandeln sich in stärker abgeflachte, fibroblastenähnliche Zellen um. Um Tag sechs herum beginnen sich unter Phasenkontrastmikroskopie helle, runde, makrophagenähnliche Zellen auf dem Blatt der fibroblastenähnlichen Zellen zu vermehren. Das Wachstum der makrophagenähnlichen Zellen erreicht um Tag 12 herum sein Maximum.Die Anzahl an makrophagenähnlichen Zellen nimmt um Tag 19 herum ab, wenn das fibroblastische Zellblatt zu degenerieren beginnt. Daher suspendieren wir nach etwa sieben bis zehn Tagen Kultur die Makrophagen, die auf dem Zellblatt proliferiert haben, durch 30-minütiges Hin-und-her-Schütteln der Kulturgefäße für 30 Minuten nach der Resuspension in das Kulturmedium. Befüllen Sie jede der 100 Millimeter großen nicht-tissuekulturgeeigneten Kunststoffschalen mit dem Medium aus zwei T-75-Flaschen.Füllen Sie die Kulturgefäße erneut mit Wachstumsmedium auf und stellen Sie sie in den Inkubator zurück. Inkubieren Sie die Kunststoffschalen 30 Minuten nach der Inkubationszeit, waschen Sie die Schalen dreimal, indem Sie das Medium absaugen und die Kunststoffschale vorsichtig mit PBS spülen, wie hier gezeigt, bereits 10 Minuten nach der Aussaat, wobei makrophagenähnliche Zellen an der Oberfläche der Schale haften, während andere kontaminierende fibroblastische Zellen in Suspension verbleiben. Nach dem PBS-Spülvorgang erhält man eine hochreine Makrophagenpopulation.Wie in dieser Abbildung zu sehen ist, nehmen die Zellen nach 40 Minuten Kultivierung eine typische Makrophagen-Morphologie an, und mitotische Zellen werden häufig beobachtet, wie durch die Pfeile angezeigt. Um diese neu gewonnene hochreine Makrophagen-Population zu gewinnen, geben Sie ein Milliliter trip-LE-Express-Lösung zu den gewaschenen Zellen hinzu und stellen die Schalen weitere 10 Minuten in den Inkubator. Nach dieser Inkubationszeit fügen Sie neun Milliliter Wachstumsmedium hinzu, lösen vorsichtig die anhaftenden Makrophagen mit dem Zellabstreifer ab, überführen sie in ein 15-Milliliter-Kegelrohr, zentrifugieren und verwerfen den Überstand.Geben Sie ein Milliliter des Wachstumsmediums hinzu, dissoziieren Sie die resuspendierten Zellklumpen durch kräftiges Pipettieren in Einzelzellen, und bestimmen Sie die Zellzahl mittels Hämozytometer, wie in diesem Diagramm dargestellt. Mehr als 10⁶ Zellen können wiederholt im Abstand von zwei bis drei Tagen über einen Zeitraum von mehr als zwei Wochen aus einem T75-Kulturkolben gewonnen werden, was eine Gesamtausbeute von 10⁷ Zellen pro T75-Kulturkolben ermöglicht. Wie in diesen Bildern gezeigt, werden die isolierten Zellen mit monoklonalen Antikörpern gegen Rattenmakrophagen-Antigene wie CD68 oder ED1 sowie CD172a oder OX41 immunhistochemisch gefärbt. Diese Zellen weisen funktionelle Eigenschaften von Makrophagen auf, wie beispielsweise die aktive Phagozytose von FITC-markierten Mikroperlen.In diesem Video stellen wir eine einfache und effiziente Methode zur Gewinnung von Makrophagen aus gemischten primären Kulturen adulter roter Leberzellen vor. Unser Verfahren erfordert keine komplexen Geräte oder besonderen Fähigkeiten, liefert aber dennoch ausreichende Mengen reiner Makrophagen, die wiederholt aus derselben Kultur von Brass gewonnen werden können. Diese Methode kann auf andere Säugetierarten angewendet werden.Vielen Dank fürs Anschauen des Videos und viel Erfolg bei Ihren zukünftigen Experimenten. Prost.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Wir stellen ein einfaches und effizientes Protokoll für die Herstellung von menschlichen Makrophagen. Buffy Coats werden durch Doppel Dichtegradientenzentrifugation isoliert verarbeitet und Monozyten werden dann an Makrophagen in Teflon-beschichtete Zellkulturbeutel differenziert. Dies maximiert Makrophagen-Renditen und erleichtert die Zellernte für nachfolgende Experimente.

Isolierung humaner Monozyten durch Doppel-Zentrifugation und ihre Differenzierung zu Makrophagen in Teflon-beschichteten Zellkultur-Taschen

Eine Technik zur Isolierung menschlicher Hepatozyten und nicht-parenchymaler Leberzellen vom selben Spender wird beschrieben. Die unterschiedlichen Leberzelltypen bilden die Grundlage für funktionelle Lebermodelle und Tissue Engineering. Diese neue Methode zielt darauf ab, Leberzellen in einer hohen Ausbeute und Lebensfähigkeit zu isolieren.

Protokoll für die Isolierung von primären humanen Hepatozyten und entsprechende Hauptpopulationen von Nicht-parenchymale Leberzellen

Es wird ein Protokoll für die Zellkultur von Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktor (M-CSF) differenzierten menschlichen Monozyten-abgeleiteten Makrophagen vorgestellt. Das Protokoll nutzt die Kryokonservierung von Monozyten in Verbindung mit ihrer Massendifferenzierung in Makrophagen. Dann können geerntete Makrophagen in Kulturvertiefungen mit den erforderlichen Zelldichten für die Durchführung von Experimenten ausgesät werden.

Kultur von M-CSF Differentiated Menschliche Monozyten abgeleiteten Makrophagen

Leberschädigungen durch Vorläuferzellexpansion begleitet, die eine heterogene Zellpopulation darstellt. Neuartige Klassifizierung dieses Zellkompartiment ermöglicht die Unterscheidung von mehreren Untergruppen. Das hier beschriebene Verfahren zeigt die Durchflusszytometrie-Analyse und hoher Reinheit Isolierung verschiedener Untermengen, die für die weiteren Tests verwendet werden kann.

Isolierung und Anreicherung von Progenitor-Subsets Leber identifiziert durch eine neuartige Oberflächenmarkerkombination

Hier zeigen wir eine enzymatische Annäherung an primären Hepatozyten aus erwachsenen Mäusen zu isolieren, und wir beschreiben die Quantifizierung einer Entzündungsreaktion mittels ELISA und real-time PCR.

Die Induktion einer entzündlichen Reaktion in der Primär Hepatozyten-Kulturen von Mäusen

Dieses Protokoll ermöglicht ein Forscher zu isolieren und zu charakterisieren, Gewebe-Bewohner Makrophagen in verschiedenen hallmark entzündetem Gewebe extrahiert aus Diät-induzierten Modelle der Stoffwechselstörungen.

Isolierung, Charakterisierung und Reinigung der Makrophagen aus den Geweben von Fettleibigkeit bedingte Entzündung betroffen

Wir präsentieren Ihnen ein Protokoll zur Proteomic Unterschriften von menschlichen Makrophagen und wenden Sie diese zur Bestimmung der Auswirkungen einer sauerstoffarmen Umgebung auf Makrophagen Polarisation.

Proteomic Analysen der menschlichen Makrophagen Polarisierung in einer sauerstoffarmen Umgebung

Hier wird ein optimiertes Protokoll zur Isolierung, Kultivierung, Transfekung und Unterscheidung menschlicher Primärmonozyten von HIV-infizierten Personen und gesunden Kontrollen vorgestellt.

Isolation, Transfektion und Kultur der primären menschlichen Monozyten

Dieses Protokoll ist eine effiziente, kostengünstige und robuste Methode zur Isolierung primärer Mikroglia aus lebendem, erwachsenem, menschlichem Hirngewebe. Isolierte primäre menschliche Mikroglia kann als Werkzeug für die Untersuchung zellulärer Prozesse bei Homöostase und Krankheit dienen.

Gewinnung menschlicher Mikroglia aus erwachsenem menschlichem Hirngewebe

Das vorliegende Protokoll beschreibt die Isolierung und Kultivierung von aus dem Knochenmark gewonnenen Makrophagen aus Mäusen.

Isolierung und Kultivierung von Makrophagen aus dem Knochenmark aus Mäusen

In dieser Arbeit stellen wir ein Protokoll vor, um die Interaktion von primären humanen Monozyten-abgeleiteten Makrophagen mit einem Tumorsphäroid in einer dreidimensionalen (3D) Kollagen-I-Matrix zu untersuchen, mit der Möglichkeit, den Einfluss löslicher und physikalischer Eigenschaften der Mikroumgebung auf die Zellinvasion zu vergleichen.

Ein Makrophagen-Tumor-Sphäroid-Co-Invasions-Assay

Lernen Sie eine einfache Methode zur Isolierung von Makrophagen aus primären Leberzellkulturen von Ratten mittels selektiver Adhäsion. Diese Technik liefert reine Zellen ohne komplexe Geräte.

Eine einfache und effiziente Methode, um Makrophagen aus Mixed primären Kulturen von adulten Leber Zellen zu isolieren

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