Eine einfache und effiziente Methode, um Makrophagen aus Mixed primären Kulturen von adulten Leber Zellen zu isolieren

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, mehrere Makrophagenkulturen aus gemischten Primärkulturen von Rattenleberzellen zu gewinnen, ohne dass komplexe Geräte oder Fähigkeiten erforderlich sind. Dies wird zunächst durch Dissoziation adulter Rattenleberzellen durch Kollagenase-Perfusion erreicht, gefolgt von der Isolierung der parenchymalen Hepatozytenzellfraktion. Anschließend werden die Zellen in T 75, Gewebekulturflaschen mit Wachstumsmedium, inkubiert, um gemischte Primärkulturen von Leberzellen zu etablieren.

Nach 10 bis 12 Tagen Kultur werden die Kulturflaschen geschüttelt, um den Transfer der Makrophagen in Kunststoffschalen zu erleichtern, aus denen sie dann nach einer kurzen Inkubationszeit durch selektive Adhäsion geerntet werden. Schließlich können mehr als 10 der sechs Zellen mehr als zwei Wochen lang wiederholt aus denselben T 75-Gewebekulturflaschen im Abstand von zwei bis drei Tagen entnommen werden. Die Isolierungsmethoden für Lebermakrophagen sind gut beschrieben.

Die meisten der bisherigen Methoden erfordern jedoch eine ausgeklügelte Ausrüstung wie einen Zentrifugalzeichner und ausgefeilte technische Fähigkeiten. Hier stellen wir eine einfache und neuartige Methode vor, um Lebermakrophagen in ausreichender Anzahl und Reinheit aus gemischten Primärkulturen adulter verpackter Leberzellen zu gewinnen, die keine spezielle Ausrüstung oder fortgeschrittene Laborkenntnisse erfordern. Die Sektion von Tieren, die Perfusion der Leber und die Aufbereitung von Zyten werden von den Ärzten Norco, Yamanaka und Miko Yoshioka am Nationalen Institut für Tiergesundheit demonstriert.

Anschließend wird die Isolierung und Reinigung von Lebermakrophagen vor kulturellen Risiken von Dr. Taketo Takeno am National Institute of Agro Biological Sciences gezeigt. Also lasst uns loslegen. Um sich auf eine Fülle der Rattenleber vorzubereiten, beginnen Sie mit dem Vorwärmen einer Flasche Waschlösung und einer Flasche Kollagenaselösung.

Nachdem Sie die Sedierung durch Zusammenkneifen der Haut bestätigt haben, legen Sie eine betäubte erwachsene männliche Ratte in eine Edelstahlpfanne und sprühen Sie 70%iges Ethanol auf ihren Bauch und Thorax. Machen Sie anschließend mit einer Präparierschere einen kleinen Schnitt in der Mitte des Bauches und schälen Sie die Haut zurück. Öffnen Sie dann den Bauch mit der Schere und bestätigen Sie die Lage der Pfortader.

Führen Sie anschließend den chirurgischen Faden unter die Pfortader und ziehen Sie den Faden locker fest. Klemmen Sie dann den distalen Teil der Vena vanoc cava inferior und der Vena mesenterialis mit einer Moskitoklemme ab, um einen Blutrückfluss in die Leber zu verhindern. Öffnen Sie die Brusthöhle, indem Sie das Zwerchfell mit einer Schere durchtrennen und legen Sie das Herz frei, nachdem Sie mit einer Augenschere einen kleinen Schnitt in der Pfortader gemacht haben, führen Sie einen zwei Millimeter langen Kunststoffkatheter in die Vene ein und ziehen Sie den Faden fest um den Katheter fest.

Befüllen Sie ein Perfusionssystem mit der vorwarmen Waschlösung und schließen Sie es dann an den Katheter an. Beginnen Sie die Perfusion in C zwei mit einer Geschwindigkeit von 10 Millilitern pro Minute. Machen Sie gleichzeitig mit einer Präparierschere einen Schnitt in die rechte Vorhofwand.

Setzen Sie die Profusion 10 Minuten lang fort, wechseln Sie dann die Profusionslösung zur Kollagenaselösung und perfundieren Sie sie 10 bis 20 Minuten lang. Füllen Sie ein steriles Becherglas mit einer Geschwindigkeit von 10 Millilitern pro Minute mit 25 Millilitern Kollagenaselösung. Dann die Perfusleber herausnehmen und vorsichtig in das Becherglas geben.

Die Leber mit einer Schere in kleine Stücke hacken. Geben Sie 75 Milliliter kaltes MEM in die resultierende Zellsuspension. Nach dem schonenden Pipettieren filtrieren Sie die Suspension durch ein 100-Mikrometer-Zellensieb.

Um das Bindegewebe in den unverdauten Gewebsfragmenten zu entfernen, sammeln Sie das Filtrat in konische 50-Milliliter-Röhrchen. Füllen Sie das Filtrat in konische 50-Milliliter-Röhrchen und waschen Sie die Zellen viermal, indem Sie die Zellen zunächst eine Minute lang bei 50 g bei vier Grad Celsius herunterschleudern. Beim Abbrechen den Überstand vorsichtig entsorgen und dann das Pellet in kaltem MEM resuspendieren und die Zellen nach dem letzten Waschen wieder herunterschleudern.

Resuspendieren Sie die Leberzellen im Wachstumsmedium. Nun säen Sie die Zellen in fünf bis 10 T 75 Gewebekulturkolben mit einer Dichte von 6,7 mal 10 bis vier Zellen pro Quadratzentimeter aus. Stellen Sie die Kulturkolben in einen Inkubator und tauschen Sie das Nährmedium alle zwei bis drei Tage aus.

Nach einem Tag Kultivierung breiten sich parenchymale Hepatozyten auf der Kolbenoberfläche aus und zeigen eine typische polygonale copale steinartige Morphologie mit einem oder zwei runden Kernen. Innerhalb weniger Tage nach der Kultivierung verlieren parenchymale Hepatozyten ihre epitheliale Zellmorphologie und verwandeln sich in abgeflachte fibroblastische Zellen. Etwa am sechsten Tag beginnen sich im Phasenkontrast helle, runde makrophagenähnliche Zellen auf dem fibroblastischen Zellblatt zu vermehren. Das Wachstum der makrophagenartigen Zellen erreicht um den 12. Tag herum sein Maximum.

Die Anzahl der makrophagenähnlichen Zellen nimmt um den 19. Tag ab, wenn das fibroblastische Zellblatt zu degenerieren beginnt. So suspendieren wir nach etwa sieben bis 10 Tagen Kultur die Makrophagen, die sich auf dem Zellblatt vermehrt haben, durch wechselseitiges Schütteln der Kulturflaschen für 30 Minuten nach der Resuspendierung der Makrophagen in das Kulturmedium. Spielen Sie jede der 100-Millimeter-Kunststoffschalen ohne Gewebekultur mit dem Medium aus zwei T 75-Kolben.

Füllen Sie die Kulturkolben wieder mit Wachstumsmedium und stellen Sie sie wieder in den Inkubator. Inkubieren Sie die Kunststoffschalen nach der Inkubationszeit 30 Minuten lang, spülen Sie das Geschirr dreimal, indem Sie das Medium aspirieren und die Kunststoffschale vorsichtig mit PBS spülen, wie hier zu sehen, bereits 10 Minuten nach dem Plattieren von Makrophagen-ähnlichen Zellen, die an der Schalenoberfläche haften, während andere kontaminierende fibroblastische Zellen suspendiert bleiben. Nach der PBS-Spülung erhält man eine hochreine Makrophagenpopulation.

Wie in dieser Abbildung zu sehen ist, nehmen die Zellen nach 40-minütiger Kultur eine typische Makrophagenmorphologie an, und mitotische Zellen werden häufig beobachtet, wie durch die Pfeile angedeutet. Um diese neue hochgereinigte Makrophagenpopulation mit einem Milliliter LE Express-Lösung zu sammeln, geben Sie sie in die gewaschenen Zellen und stellen Sie die Schalen für weitere 10 Minuten in den Inkubator. Nach dieser Inkubationszeit fügen Sie neun Milliliter Wachstumsmedium hinzu und kratzen Sie dann die anhaftenden Makrophagen vorsichtig mit dem Zellschaber ab und geben Sie sie in eine konische 15-Milliliter-Röhrchenzentrifuge und verwerfen Sie den Überstand.

Fügen Sie einen Milliliter des Wachstumsmediums hinzu, dissoziieren Sie die resuspendierten Zellklumpen durch kräftiges Pipettieren in einzelne Zellen, zählen Sie die Zellzahl mit dem Hämozytometer auf, wie in dieser Grafik gezeigt, mehr als 10 der sechs Zellen können mehr als zwei Wochen lang wiederholt in Abständen von zwei bis drei Tagen aus einem Kulturkolben T 75 geerntet werden, Dies ermöglicht eine Gesamtzellausbeute von 10 bis sieben pro T 75 Kulturkolben. Wie in diesen Bildern zu sehen ist, werden die isolierten Zellen mit monoklonalen Antikörpern gegen Rattenmakrophagen-Antigene wie CD 68 oder ED one und CD 1 72 A oder OX 41 immungefärbt. Diese Zellen besaßen funktionelle Eigenschaften von Makrophagen, wie z.B. die aktive Phagozytose von FITC-markierten Mikrokügelchen.

In diesem Video haben wir eine einfache und effiziente Methode vorgestellt, um Makrophagen aus gemischten Primärkulturen adulter roter Leberzellen zu gewinnen. Unser Verfahren erfordert keine komplexe Ausrüstung oder Fähigkeiten, sondern liefert eine ausreichende Anzahl reiner Makrophagen, die wiederholt aus der gleichen Messingkultur geerntet werden können. Diese Methode kann auf andere Säugetierarten angewendet werden.

Vielen Dank, dass Sie sich das Video angesehen haben, und viel Glück bei Ihren zukünftigen Experimenten. Prost.