Quantitative RT-PCR mit hohem Durchsatz in Einzel- und Bulk-C. elegans Proben mit Nanofluidic-Technologie

Unser Protokoll verbesserte sowohl den Durchsatz als auch die Zeiteffizienz bei der Gewinnung von RT-qPCR-Daten direkt aus einzelnen oder kleinen Massenproben, ohne dass eine RNA-Isolierung erforderlich war. Mit diesem Protokoll können über 9.000 RT-qPCR-Ergebnisse in nur zwei Tagen Laborarbeit erhalten werden, ein Prozess, der bei Standard-96-Well-qPCR normalerweise etwa fünf Wochen dauern würde. Dieses Protokoll bietet einen schnelleren, robusten und hochsensitiven RT-qPCR-Assay in C.elegans, der sich ideal für die Überwachung der interindividuellen Variabilität in der Genexpression zwischen isogenen Würmern eignet.

Beginnen Sie damit, die Würmer von ihrem Bakterienrasen auf eine frische, unbesäte Nematodenwachstumsmediumplatte zu pflücken und lassen Sie die Würmer fünf Minuten lang auf der Platte herumlaufen. Während sich die Würmer akklimatisieren, mischen Sie in einer RNase-freien Haube 10 Mikroliter Lysepuffer mit einem bis 100 Dnase I pro Probe und legen Sie den Deckel eines PCR-Streifens kopfüber auf die Plattform eines Präparierfernrohrs. Geben Sie als Nächstes 10 Mikroliter der Lysemischung in gewölbte PCR-Röhrchenkappen und schöpfen Sie die Würmer aus der Platte, um eine Übertragung von Bakterien in jeden Schlitz des Deckels zu vermeiden.

Wenn alle Würmer übertragen wurden, schließen Sie die Verschlüsse und drehen Sie die Röhrchen fünf Sekunden lang, bevor Sie die Röhrchen in einen Dewargefäß mit flüssigem Stickstoff legen. Tauen Sie die Schläuche nach den letzten fünf Sekunden in einem 40 Grad Celsius warmen Wasserbad auf, bevor Sie den Einfrier-/Auftauvorgang neun weitere Male wiederholen. Nach dem letzten Gefrier-/Auftauzyklus werden die lysierten Proben auf einem thermischen Mischer 20 bis 30 Minuten lang bei vier Grad Celsius und etwa 1800 Umdrehungen pro Minute gemischt.

Am Ende der Mischinkubation schleudern Sie die Proben wie gezeigt herunter und fügen Sie jedem Röhrchen einen Mikroliter frisch aufgetaute Stopplösung hinzu. Für die reverse Transkription von warmen Bulk-Proben in einer RNase-freien Haube wird ein Enzympuffer-Mastermix hergestellt und 14 Mikroliter Mastermix zu 11 Mikrolitern jeder Probe hinzugefügt. Lassen Sie die Proben mit dem angegebenen reversen Transkriptionsprogramm durch einen Thermocycler laufen und verdünnen Sie das resultierende cDNA-Produkt im Verhältnis eins zu vier in nukleasefreiem Wasser.

Für die zielspezifische Präamplifikation geben Sie 3,75 Mikroliter Voramplifikations-Mastermix in eine Vertiefung pro Probe in einer 96-Well-Platte und fügen Sie 1,25 Mikroliter jeder cDNA-Lösung in jede Vertiefung des Mastermixes hinzu. Wenn alle Proben geladen sind, decken Sie die Platte mit Dichtungsband ab und wirbeln Sie die Proben kurz ein, bevor Sie sie durch Zentrifugation nach unten schleudern, dann laden Sie die Platte auf einen Thermocycler und führen Sie das Programm wie angegeben aus. Um nicht eingearbeitete Primer aus der Voramplifikation zu entfernen, zentrifugieren Sie am Ende des Thermozyklus die Probenplatte und entfernen Sie vorsichtig die Versiegelung.

Geben Sie zwei Mikroliter Exonuklease I Mastermix zu jeder Voramplifikationsreaktion und verschließen Sie die Platte wieder, zentrifugieren Sie sie und laden Sie sie wieder in den Thermocycler. Am Ende des Zyklus verdünnen Sie die Proben mit 18 Mikrolitern Tris-EDTA-Puffer. Um einen Multi-Array-Chip einzurichten, geben Sie 3,6 Mikroliter Assay-Loading-Mastermix und 0,4 Mikroliter 50 Mikromolare Forward-Reverse-Primer in eine Vertiefung pro Probe in einer 384-Well-Platte.

Geben Sie dann 2,2 Mikroliter Proben-Mastermix und 1,8 Mikroliter jeder voramplifizierten Exonuklease, die ich behandelt habe, in die entsprechenden Vertiefungen der Platte. Um einen Single-Array-Chip einzurichten, geben Sie 5,4 Mikroliter des Assay-Loading-Mastermixes und 0,6 Mikroliter des Forward-Reverse-Primers in eine Vertiefung pro Probe einer zweiten 384-Well-Platte, fügen Sie dann 3,3 Mikroliter Proben-Mastermix und 2,7 Mikroliter jeder voramplifizierten Exonuklease, die ich behandelt habe, in die entsprechenden Vertiefungen der vorbereiteten Einzelarray-Platte hinzu. Um den Nanofluidik-Chip für den ersten Durchlauf vorzubereiten, halten Sie den Chip in einem 45-Grad-Winkel und injizieren Sie langsam und vorsichtig 150 Mikroliter Steuerleitungsflüssigkeit in die Akkumulatoren des Chips.

Wenn die gesamte Flüssigkeit geladen ist, entfernen Sie die blaue Schutzfolie von der Unterseite des Chips und legen Sie den Chip mit dem Barcode nach außen in die Nanofluidik-PCR-Priming-Maschine. Führen Sie dann das Skript Prime(153x) aus. Nach dem Priming wird der Chip auf eine dunkle Oberfläche gelegt, und während jeder Assay oder eine Probenmischung geladen wird, entfernen Sie bei Bedarf die entsprechenden Barrierestopfen und geben Sie das entsprechende Volumen des Assays oder der Probenmischung gemäß dem Versuchsplan in die entsprechenden Einlässe des nanofluidischen Chips.

Legen Sie den Chip nach dem Laden in den nanofluidischen Thermocycler und führen Sie das entsprechende Protokoll in der Datenerfassungssoftware aus. Wenn nicht der gesamte Multi-Array-Chip verwendet wird, führen Sie einen Post-Script-Lauf durch, um die nachgelagerte Verwendung der verbleibenden Chip-Arrays zu ermöglichen. Um zu testen, ob das Wurm-zu-Ct-Protokoll eine gültige cDNA-Extraktionsmethode ist, wurde die Methode mit Standard-Guanidiumthiocyanat-Phenol-Chloroform-Extraktionsmethoden verglichen.

Weltweit waren die hsp-70-mRNA-Expressionsniveaus pro 100 Nanogramm Gesamt-RNA sowohl mit der Phenol-Chloroform- als auch mit der Wurm-zu-Ct-Methode vergleichbar. In den Fällen der höchsten hsp-70-Expression war die Expression jedoch mit der Wurm-zu-Ct-Methode höher, was auf eine verbesserte Sensitivität hinweist. Bei der Guanidiumthiocyanat-Phenol-Chloroform-Extraktion aus Bulk-Proben sank hsp-70 bei hsf-1-Mutanten im Vergleich zu Kontrollen um 82,7 % und bei Warm-to-Ct um 92,3 %, was darauf hindeutet, dass die Abnahme zwischen den beiden Methoden vergleichbar war.

Unter Verwendung von cDNA, die entweder aus Massenproben von 25 Würmern oder aus durchschnittlich 36 Einzelwurmproben gewonnen wurde, ermittelten die Methoden vergleichbare Expressionsniveaus für alle getesteten Chaperone, was darauf hindeutet, dass die von einzelnen Würmern erhaltenen Parameter zuverlässig sind. Hier wird die mittlere Expression mehrerer hsp-Transkripte von einzelnen Würmern nach einem kurzen Hitzeschock gezeigt. Wie beobachtet, unterscheidet sich die Variabilität in der Expression der Transkripte dramatisch zwischen verschiedenen Genen.

Für jedes Transkript, das mit Einzelwurmproben getestet wurde, waren die technischen Variabilitätskoeffizienten niedriger als die biologischen Variabilitätskoeffizienten, was darauf hindeutet, dass bei der qPCR an einzelnen Würmern keine technischen Triplikate für die Parameterschätzung erforderlich waren. Bei der Durchführung dieses Protokolls ist es wichtig, kleine Volumina genau zu pipettieren und nicht rückwärts in den nanofluidischen Chip zu pipettieren. Dieses Protokoll kann verwendet werden, um große Mengen an RT-qPCR-Daten zu erhalten, die dann exportiert und mit Excel- oder R-Skripten wie gewünscht verarbeitet werden können.