Multi-Elektroden-Array Recordings neuronaler Lawinen in organotypischen Kulturen

Das Ziel dieses Experiments ist es, die Selbstorganisation gesunder Gehirnaktivität in neuronalen Lawinen zu untersuchen, dem Kennzeichen der Dynamik kritischer Zustände im Kortex. Dies wird durch die Kombination eines koronalen geschichteten Kortexschnitts mit einem Mittelhirnschnitt erreicht, der dem Kortex entwicklungswichtige dopaminerge Inputs liefert. In einem zweiten Schritt wird die Cortex-Co-Kultur des Mittelhirns auf einem Multi-Elektroden-Array gezüchtet, was eine Multi-Site-Stimulation und Aufzeichnung der neuronalen Aktivitäten in der Kultur ermöglicht.

Als nächstes lassen wir die Co-Kultur in den ersten ein bis zwei Wochen in einem speziell entwickelten Inkubator abflachen, ausdehnen und an der MEA-Oberfläche anheften, der die Kultur durch den Kontakt mit normaler Luft und Kultur durchläuft. Es werden fließende Ergebnisse erhalten, die zeigen, dass die spontane Selbstorganisation von raumzeitlichen lokalen Feldpotentialausbrüchen zu neuronalen Lawinen führt. Basierend auf MEA-Aufzeichnungen und Offline-Lawinenanalysen, die das Potenzgesetz in Lawinengrössen identifizieren.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden, wie z.B. dis assoziierten Kulturen, ist ihr systemischer, neurowissenschaftlicher Aspekt. Wir können viele Gehirnregionen zusammen kultivieren, und diese Multi-Region-Kulturen etablieren eine Gehirnorganisation, die auf den großen Skalen wie kortikalen Schichten und Projektionssystemen korrekt ist. Die Anwendungen dieser Technik gehen über die Untersuchung von Neuronolawinen hinaus.

Zum Beispiel können wir Stimulus als Reaktion auf Netzwerkebene unter genau kontrollierten in vitro-Bedingungen untersuchen. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da die korrekte Anwendung des Plasma-Thrombin-Gemisches und die Positionierung des Gewebes auf dem MEA schwer zu erlernen sind. Diese Schritte erfordern das richtige Timing, den richtigen Temperaturgradienten und die Vermeidung einer direkten Berührung der empfindlichen MEA-Oberfläche.

Um eine steril verschließbare Glaskammer für Aufnahmen vorzubereiten, schneiden Sie zunächst Gewindeglaszylinder mit einer Teflon-Kunststoffkappe, etwa zwei Millimeter von der Unterseite des Gewindes entfernt. Diese sind für einen sicheren und dichten Verschluss der Kulturkammer erforderlich. Reinigen Sie dann die Glasringe, indem Sie sie dreimal mit Wasser abspülen und dann fünf Minuten lang in 200 Starkem Ethylalkohol kochen.

Legen Sie diese zum Trocknen beiseite: Eine Silikonlösung wird benötigt, um die Glasringe an der MEA-Oberfläche zu befestigen. Verwenden Sie ein Cell Guard 180 4 Silikon-Elastomer-Kit und mischen Sie 15 Milliliter der Teile A und B gründlich. Dann setzen wir uns 15 Minuten hin, um Luftblasen zu entfernen.

Trennen Sie die Lösung in einen Milliliter Eloqua und lagern Sie sie für die zukünftige Verwendung bei minus 20 Grad Celsius. Kleben Sie nun einen Glasring auf die MEA, indem Sie mit einer kleinen Nadel einen Milliliter Silikon bei 23 Grad Celsius in einer Spritze aufnehmen und auf die unpolierte Schnittfläche des Glasrings auftragen. Zentrieren Sie dann den Glasring auf dem MEA und tragen Sie eine zusätzliche Schicht Silikon um die Außenseite des Rings auf, um eine stärkere Abdichtung zu erzielen.

Lassen Sie diese ein bis zwei Stunden bei etwa 60 Grad Celsius auf einer heißen Platte aushärten. Sterilisieren Sie anschließend die MEA-Kammer und die Kammerkappen unter der Lamina-Flow-Haube, indem Sie dreimal in entionisiertem Wasser spülen, dann dreimal mit 70 % Alkohol für die letzte Spülung. Lassen Sie die Kammer 10 Minuten im Alkohol ruhen.

Setzen Sie anschließend das Innere der Kammer und der Kappe 10 Minuten lang UV-Licht aus. 45 Minuten lang bei 120 Grad Celsius autoklavieren. Lassen Sie diese nach dem Sterilisieren trocknen.

Nun bestreichen Sie die MEA-Oberfläche im Inneren der Kulturkammer mit Poly-D-Lysin. Neue Maße, wie sie in diesem Experiment verwendet werden, sind eher lipophil, daher überziehen sie mit wiederholten Tröpfchen. Aspiration der Lösung aus dem Elektrodengitter.

Bringen Sie die Kappe an, um die MEA-Kammer für die Lagerung und zukünftige Verwendung abzudichten. Dieses Verfahren liefert Cortex- und VTA-Schnitte für etwa 12 Co-Kulturen und sollte in einer Lamina-Flow-Haube unter sterilen Bedingungen an gesunden Tieren ein bis zwei Tage nach der Geburt durchgeführt werden, wobei die Gesamtzeit für die Gewebeentnahme weniger als eine Stunde betragen sollte. Beginnen Sie nach der Enthauptung mit der Entfernung des Gehirns, indem Sie zunächst zwei seitliche Scherenschnitte machen, um die Haut von der Kopfhaut zu entfernen.

Entfernen Sie den Schädel und schneiden Sie ihn mit einer feinen Augenschere auf, wobei Sie einen sagittalen Mittellinienschnitt an einem koronalen Schnitt an der Kleinhirnübergangsstelle der Rinde machen. Klappen Sie alle vier Schädelklappen zurück, um das Gehirn freizulegen. Anschließend mit einem angespitzten Spachtel frontal durch den Riechkolben schneiden.

Schieben Sie dann den Spatel vierteljährlich unter das Gehirn vor. Hebe das Gehirn sanft aus dem Schädel und lass es in einen kühlen Blick gleiten. Lösung für schnelles Kühlen und Zwischenlagern.

Wiederholen Sie den obigen Vorgang für zwei weitere Gehirne. Um VTA-Gewebe zu erhalten, übertragen Sie das Gehirn auf eine sterile trockene Petrischale. Entfernen Sie mit einem kleinen Spatel überschüssige Flüssigkeit, indem Sie jedes Gehirn vorsichtig etwa einen Zentimeter seitlich schieben.

Verwenden Sie dann eine Rasierklinge, um den Hirnstamm zu entfernen, indem Sie einen koronalen vertikalen Schnitt auf Höhe des Kleinhirns machen. Kleben Sie nun einen Agarblock auf eine Montagescheibe zur mechanischen Stabilisierung des Gehirns während des Schneidevorgangs. Lege dann einen dünnen Strich Sekundenkleber einige Millimeter vor dem Agarblock auf die Scheibe, vermeide es aber, dass der Kleber mit einem kleinen Spachtel den Agar berührt.

Übertragen Sie jeden Frontpol des Gehirns nach unten und montieren Sie ihn. Stellen Sie sicher, dass die vorderen Pole mit der Montagescheibe verklebt sind und dass die Bauchseiten den Agar ohne Klebstoffrückstände berühren. Dies gewährleistet eine ordnungsgemäße mechanische Stabilisierung während des Schneidens und ein leichtes Abheben der geschnittenen Scheiben.

Tauchen Sie dann die Montagescheibe vorsichtig ein und sichern Sie sie mit den montierten Gehirnen in einer Vibram-Schale, die mit gekühlter Blicklösung gefüllt ist. Dann werden mit einer sorgfältig gereinigten Rasierklinge 400 Mikrometer dicke koronale Schnitte des Mittelhirns bei höchster Vibrationsfrequenz und relativ niedriger Vorwärtsgeschwindigkeit mit einer umgekehrten Nudelpipette mit Saugkolben gesammelt und in 35 mal 10 Millimeter große Petrischalen überführt, die mit steriler gekühlter Blicklösung für kortikale Schnitte gefüllt sind. Wiederholen Sie die vorherigen Schnittschritte, aber wenden Sie einen vertikalen Schnitt zwischen Kortex und Kleinhirn an und montieren Sie die vier Gehirne mit dem Frontpol nach oben.

Entnehmen Sie etwa drei koronale Scheiben mit einer Dicke von 350 Mikrometern, beginnend auf Höhe des Striatums. Mit einem Mikromesser aus abgebrochenen Rasierklingen sezieren Sie nun unter einem Stereomikroskop etwa zwei Millimeter breite koronale Schnitte des frontalen Kortex und der Mittelhirnbereiche, die das VTA enthalten. Sammeln Sie den Gewebeschnitt separat in kleinen Schalen, die mit gekühlter Blicklösung gefüllt sind.

Um mit der Montage des Gewebes in der ersten Position der MEA-Kammer zu beginnen, wird das MEA bei Raumtemperatur unter einem Stereomikroskop mit dem Elektrodenarray im Fokus gehalten. Zentrieren Sie dann ein 25-Mikroliter-Tröpfchen Plasma auf die saubere, staubfreie und sterile Elektrodenarray-Matrix. Schieben Sie mit einem kleinen Spatel vorsichtig einen Cortex- und VTA-Schnitt in das Plasmatröpfchen.

Platzieren Sie nun den MEA auf einer Kühlplatte und fokussieren Sie die Ansicht neu. Lassen Sie dies etwa 15 Sekunden lang abkühlen, bevor Sie 25 Mikroliter Thrombin in das Plasmatröpfchen geben. Verteilen Sie dann mit der Thrombin-Pipettenspitze vorsichtig das Plasma-Thrombingemisch mit kleinen kreisenden Bewegungen über den MEA.

Achten Sie darauf, das spröde Elektrodenarray nicht direkt zu berühren. Positionieren Sie als Nächstes den Kortex vorsichtig auf dem Array, wobei der dorsale Rand entlang der zweiten Elektrodenreihe des Arrays liegt. Auf diese Weise bedecken die sich entwickelnden oberflächlichen Schichten schließlich den Rest des Arrays.

Platzieren Sie dann den VTA neben dem ventralen Rand des Kortexabschnitts. Verschließen Sie nun die MEA-Kammer und verschließen Sie sie locker, um die hohe Luftfeuchtigkeit zu erhalten. Lassen Sie die MEA-Kulturbaugruppe etwa sechs Minuten lang bei Raumtemperatur in der Haube sitzen, um Plasma-Thrombin, Koagulation und Hochstimmung zu ermöglichen.

Wiederholen Sie in der Zwischenzeit den Vorgang, um drei weitere Kulturen vorzubereiten. Anschließend werden in kleinen Tröpfchen vorsichtig 600 Mikroliter Nährmedium in die Kulturkammern gegeben, wobei eine Ein-cm³-Spritze mit einer 25 x fünf Achtelnadeln verwendet wird. Schließen Sie dann die MEA-Kammer fest und stellen Sie die MEA-Kulturbaugruppe auf das wippende Aufbewahrungstablett im Inkubator.

Fügen Sie nach zwei Tagen in vitro 10 Mikroliter Mitosehemmer hinzu. Anschließend wird der Nährboden vier Tage in vitro und danach alle vier Tage um 60 % aufgefrischt. Während des normalen Wachstums flacht die Kultur stark ab und dehnt sich nach dorsal leicht aus.

Aufgrund der Entwicklung oberflächlicher kortikaler Schichten ist eine gesunde Kultur an ihrem undurchsichtigen gräulichen Gewebe im Hellfeld zu erkennen. Umgekehrt sind hell reflektierende Vesikel, ein Merkmal abgestorbener degenerativer Zellen, etwa 10 bis 12 Tage nach der Vorbereitung der Kulturen, bereit für die Aufzeichnung und Stimulation. Um eine Aufnahmesitzung zu starten, wird die MEA aus dem Ablagefach auf die Aufnahmekopfbühne übertragen.

Um lokales Feldpotenzial oder LFP aufzunehmen, verwenden Sie einen Bandpassfilter von einem bis 200 Hertz. Die Aktivität mehrerer Einheiten kann auch mit einem Bandpassfilter von 300 bis 3000 Hertz untersucht werden. Gesunde spontane Aktivität tritt in der Regel in Schüben unterschiedlicher Größe und Dauer auf.

Um die Beziehung zwischen LFP und Einheitsaktivität zu untersuchen, können wir die durch Spike ausgelösten Durchschnittswerte von LFP berechnen. Für diese Kortexkulturen werden negative LFP-Ablenkungen mit neuronalem Spiking korreliert, um die durch Stimulus evozierte Aktivität aufzuzeichnen. Zunächst werden die zeitliche Wellenform und die Amplitude von Stimuli mit einer Software spezifiziert, die einen Stimulusgenerator steuert.

Ein nützliches Stimulationsparadigma ist der stromgesteuerte ladungsneutrale Einzelschock mit bipolarer Rechteckwellenform. Als nächstes wird eine Elektrode ausgewählt, mit der die Reize abgegeben werden. Typische reizevozierte LFP-Reaktionen ähneln spontanen Aktivitätsausbrüchen.

Die Austastschaltung trennt die Verstärker während der Stimulation, um Stimulusartefakte zu reduzieren und eine Sättigung des Verstärkers zu verhindern. Die Stimulationselektrode benötigt mehrere Sekunden, um sich von der Stimulation zu erholen, und kann daher nicht zur Aufzeichnung der Reaktionsaktivität verwendet werden. Auf der MEA tritt sie tendenziell in raumzeitlichen Clustern mit Aktivität an einer Elektrode auf, oft begleitet von Aktivität an anderen Stellen.

Gleichzeitig werden hier typische Wellenformen des LFP während solcher Aktivitätsperioden gezeigt, indem drei Cluster im Abstand von mehreren Sekunden für jeden Cluster dargestellt werden. Negative LFP-Auslenkungen können an mehreren Elektroden innerhalb eines Fensters von einer Sekunde beobachtet werden. Bei der Extraktion von NLFP-Peaks, die eine Schwelle von mehreren negativen sd überschreiten, wird die Aktivität in Form von NLFP-Peakzeiten bequem in einem Rasta visualisiert, in dem Punktsäulen den nahezu zusammenfallenden NPS an verschiedenen Elektroden darstellen. Die raumzeitliche Organisation dieser Aktivität ist ziemlich komplex.

Säulen, die bei niedriger zeitlicher Auflösung mehr oder weniger homogen erscheinen, bestehen bei höherer zeitlicher Auflösung aus separaten Clustern und so weiter. Die Entstehung von Raum-, GEOTEMPORAL- und LFP-Clustern ist stark in kortikalen Netzwerken organisiert. Genauer gesagt ist die Organisation in der Skalenvariante für neuronale Lawinen.

Dies wird durch die Berechnung der Wahrscheinlichkeit von Clustergrößen bei einer gegebenen zeitlichen Auflösung demonstriert. Delta T.Hier bestehen Cluster aus NL-FPS, die im gleichen oder aufeinanderfolgenden Zeiträumen auftreten, wenn die Größe eines solchen Clusters in der Gesamtzahl der NFPS pro Cluster oder in integrierten NLFP-Amplituden pro Cluster ausgedrückt wird, zeigt die Clustergrößenverteilung ein Potenzgesetz mit einem Exponenten nahe minus 1,5. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Hirngewebe sorgfältig seziert und Kulturen auf Mehrelektrodenarrays züchtet, um die Selbstorganisation der neuronalen Aktivität zu untersuchen.

Diese Methoden wurden auch verwendet, um die Beziehung zwischen spontaner Aktivität und reizevozierter Aktivität in kortikalen Netzwerken zu untersuchen.