Name: Multi-Elektroden-Array Recordings neuronaler Lawinen in organotypischen Kulturen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 1 s
Description: Erfahren Sie, wie neuronale Lawinen in Kortex-Mittelhirn-Kokulturen mit Multi-Elektroden-Arrays aufgezeichnet werden. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung kritischer Zustandsdynamiken in neuronalen Netzwerken.

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Diese Studie wurde von der Abteilung für Interne Research Program (DIRP) des National Institute of Mental Health, National Institutes of Health gefördert.

1. Sterile, verschließbares Glasgefäß Kammer mit MEA für Langzeit-Aufzeichnungen <ol><li> Threaded Glaszylinder mit Teflon-Kunststoff (Ace Glass), für die sichere und dichte Kultur Kammer Schließung erforderlich ist, werden geschnitten (Aceglass) ca. 2 mm von der Unterseite des den Faden (Abb. 1A, B). Saubere Glas-Ringe durch Spülen mit Wasser (3x) und Kochen für 5 min in 200 Beweis Ethyl-Alkohol, trocknen lassen. </li><li> Aliquot Silizium-Lösung erforderlich, um Glas Ringe MEA Oberfläche befestigen. Mix 15 ml Teile A &amp; B von Sylgard 184 Silikon-Elastomer Kit gründlich, lassen Sie sich für 15 min, um Luftblasen zu entfernen, bewahren in 1 ml Aliquots bei -20 ° C. </li><li> Kleber Glasring der MEA (8x8 Gitter w / interne Masseelektrode, 30 um Elektroden-Durchmesser, 200/100 um inter-Elektrodenabstand für Ratte / Maus) (Abb. 1A, B). Nehmen Sie 1 ml von Silizium (23 ° C) in Spritze mit kleinen Nadel. Silikon auf ungeschliffen Schnittfläche Glasring, Zentrum Glasring auf MEA, gelten eine zusätzliche Schicht von Silizium an der Außenseite des Ringes für eine stärkere Dichtung, lassen Heilung für 1 bis 2 Stunden bei ~ 60 ° C auf einer Heizplatte. </li><li> Sterilisieren MEA Kammer-und Kammermusik Mützen in einer Sterilbank durch 3x in entionisiertem Wasser spülen um 70% Alkohol, gefolgt (3 x; für letzten Spülgang lassen Sie sich für 10 min in Alkohol), gefolgt von 10 min Exposition von Kammer und Deckel innen mit UV-Licht . Autoclave MEA Kammer (120 ° C; nass, 45 min) und trocknen lassen. </li><li> Coat MEA-Oberfläche im Inneren Kultur Kammer mit Poly-D-Lysin. Für neue MEAs, die eher lipophil sind, Mantel durch wiederholtes Tropfen Aspiration der Lösung von der Elektrode Gitter. Bei gebrauchten MEAs, Deckelkammer unten mit einer Lösung, die überschüssige Flüssigkeit absaugen, zu erlauben, unter sterilen Bedingungen in laminaren Haube verdampfen. Bringen Sie Kappe MEA Kammer für die Lagerung und die zukünftige Verwendung zu versiegeln. </li></ol> 2. Zutaten für die Zubereitung und das Wachstum von organotypischen Kulturen Required <ol><li> Lösen Sie sterile Agar in 0,9% NaCl, pour in sterile Petrischale (Falcon, 100 x15, ~ 5 mm Höhe), abkühlen lassen und sterilen Verpackung mit Parafilm für die Lagerung. Cut 20 x 10 x 5 mm Blöcke aus massivem Agar für den Einsatz. </li><li> Shop Sekundenkleber, zB Devcon Super Glue II, mit der Verpackung wischte sich mit 70% EtOH vor der Eröffnung, in der Sterilbank, um die Sterilität zu erhalten. </li><li> Bereiten Sie 50% D-Glucose (SIGMA ultra, G7528) durch Zugabe von 40 g Glucose in 40 ml deionisiertem Wasser Kultur (Sigma). Store in 2 ml Aliquots bei -20 ° C. </li><li> 4 ml 50% D-Glucose in 500 ml Balanced Salt Gey-Lösung und Kälte zu Matsch (Mischung aus Flüssigkeit / Eiskristalle) im Gefrierschrank vor dem Gebrauch. </li><li> Rekonstituieren Huhn Plasma in 5 ml deionisiertem Wasser Kultur (shake sanfte, Vermeidung der Bildung von Blasen), lassen Sie für 5 niederlassen - 10 min, leicht schwenken, und Dekantat den klaren Inhalt in eine sterile Petrischale. Sterile-Filter (0,22 um Porenfilter; protein)-Plasma-Lösung, Aliquot 350 ul in Kryoröhrchen (NuncTM), bei -20 ° C. </li><li> Rekonstituieren Thrombin aus bovinem Plasma entsprechend, steril-Filter (0,22 um Porenfilter), 40 ul Aliquot in Kryoröhrchen (NuncTM), bei -20 ° C. Für funktionierende Lösung, verdünnte 40 pl der Thrombin-Lösung in 375 ul einer ausgewogenen Salz Gey-Lösung w / D-Glucose. </li><li> Bereiten Sie 400 ml Kulturmedium durch Mischen von 100 ml Pferdeserum, 200 ml Basal Medium Eagle, 100 ml Hanks Salzlösung auf die 4 ml 50% Glucose und 2 ml 200 mM L-Glutamin hinzugefügt werden. Kann gespeichert werden 4 bis 8 Wochen in 100 ml Flaschen PYREX bei 4 ° C. </li><li> Bereiten Mitose-Hemmer durch Mischen 0,3 mM Uridin, 0,3 mM ARA-C Cytosin-β-D-arabinofuranosid und 0,3 mM 5-Fluor-2'-desoxyuridin, Sterilfilter, Aliquot 200 ul und bei -20 ° C für 6 - 12 Monate. </li></ol> 3. Cortex und ventralen Tegmentum (VTA) Gewebedissektion (Zeit: &lt;1 Stunde) <ol><li> Verfahren ergibt Kortex und VTA Gewebeschnitten für ~ 12 Co-Kulturen von Ratten oder Mäusen, und befindet sich in einer Sterilbank unter sterilen Bedingungen hergestellt. Insgesamt benötigte Zeit für die Gewebe-Sammlung soll als 1 Stunde sein. </li><li> Nehmen Sie gesund, gut ernährt Welpen (Wurfgröße ~ 10; Vorhandensein einer abdominalen Milch vor Ort ") bei 1 bis 2 postnatalen Tage (PND). Halten Sie einen Welpen sanft an der Schnauze, damit sie frei hängen und schnell an der Basis des Halses mit einer scharfen Schere zu enthaupten. </li><li> Für Gehirn entfernen, Haut entfernen (zwei seitlichen Scherenschnitt), schneiden Schädel öffnen mit feinem Auge Schere (1 sagittalen Mittellinie geschnitten, 1 koronalen Schnitt bei Cortex / Cerebellum-Kreuzung). Blättern Sie zurück alle 4 Schädel Klappen. Mit einem geschärften Spatel, frontal Schnitt durch den Riechkolben, vorab Spachtel kaudal unterhalb des Gehirns. Heben Sie das Gehirn aus dem Schädel und ließ es in sterile, gekühlt, Gey-Lösung für die schnelle Kühlung und Zwischenlagerung gleiten. Wiederholen Sie die Schritte 3,2 bis 3,3 für 2 weitere Köpfe (Gesamtdauer: &lt;20 min). </li><li> Um VTAGewebe, übertragen Sie die Gehirne auf eine sterile, trockene Petrischale mit einem kleinen Spachtel. Weitere entfernen überschüssige Flüssigkeit durch sanftes Gleiten jedes Gehirn etwa 1 cm seitlich. Entfernen Hirnstamm durch einen koronalen, vertikalen Schnitt auf dem Niveau des Kleinhirns mit einer Rasierklinge. </li><li> Kleber-Agar-Block auf Montage-Disc für die mechanische Stabilisierung des Gehirns während Slicing Verfahren. Legen Sie eine dünne Linie von Sekundenkleber wenige Millimeter vor dem Agar-Block auf der Festplatte (Vermeidung von Leim Berühren der Agar). </li><li> Mit einem kleinen Spatel, Transfer und montieren jedes Gehirn, frontalen Pol nach unten. Stellen Sie sicher, dass frontal Pole Montage Scheibe geklebt und das ventrale Seiten berühren die Agar ohne Klebereste, um die ordnungsgemäße mechanische Stabilisierung während des Schneidens und easy lift-off der geschnittenen Scheiben. Erzielen </li><li> Vorsichtig tauchen und sichere Montage Festplatte mit Gehirn Montage in einem Vibratom Fach (zB Leica VT1000) mit einer sterilen, gekühlt Gey-Lösung gefüllt. Mit einem sorgfältig gereinigt Rasierklinge (90% EtOH), schneiden koronalen Schichten des Mittelhirns bei höchsten Schwingungsfrequenz und relativ niedrige Fahrgeschwindigkeit bei einer Dicke von 400 500 um. Mit einer umgekehrten Pasteur-Pipette mit Saug-Glühbirne, Transfer und sammeln Scheiben mit dem VTA in 35 x 10 mm Petrischalen mit sterilen, gekühlt Gey-Lösung gefüllt (Abb. 1C; siehe auch koronalen Platte 18 bis 20 auf E22 in 15). </li><li> Für Kortex Abschnitte, wiederholen Sie die Schritte 3,2 bis 3,6, sondern gelten vertikalen Schnitt zwischen Kortex und Kleinhirn, und montieren Vorderhirn mit frontalen Pol nach oben. Etwa 3 koronalen Scheiben (350 mu m Dicke) ab auf der Ebene des Striatum sind für zukünftige Cortex Dissektion gesammelt. </li><li> Mit einem Mikro-Messer von gebrochenen Rasierklingen gemacht, sezieren ~ 2 mm breiten Frontalschnitt des frontalen Kortex und des Mittelhirns die Bereiche mit der VTA (Abb. 1C) unter einem Stereomikroskop. Sammeln Gewebeschnitten separat in kleinen Gerichten (z. B. Kammer Dias) mit gekühltem Gey-Lösung gefüllt. </li></ol> 4. Montage Cortex und VTA Gewebeschnitten auf der MEA (Zeit: &lt;1 Stunde) <ol><li> Position MEA bei Raumtemperatur unter einem Stereomikroskop mit dem Elektroden-Array im Fokus. Center eine 25 ul Tropfen Plasma auf die saubere, staubfreie und sterile Elektroden-Array-Matrix. Mit kleinen Spachteln, sorgfältig schieben Sie einen Kortex und VTA Abschnitt in das Plasma Tropfen. </li><li> Legen MEA auf Kühlplatte, konzentrieren Sicht ruhen lassen ~ 15 s, dann fügen Sie 25 ul von Thrombin in das Plasma Tropfen. Mit dem Thrombin Pipettenspitze vorsichtig die Plasma / Thrombin-Gemisch mit kleinen kreisenden Bewegungen über die MEA verteilt. Berühren Sie nicht die spröde Elektroden-Array direkt. Vorsichtig Position der Hirnrinde auf das Array mit dorsalen Grenze entlang der zweiten Elektrode Zeile des Arrays. Auf diese Weise wird die Entwicklung von oberflächlichen Schichten schließlich decken die Erinnerung an die Reihe. Die VTA ist benachbart zu dem ventralen Rand des Kortex Abschnitt (Abb. 1D). </li><li> Cap und locker in der Nähe der MEA Kammer mit hoher Luftfeuchtigkeit zu halten, während der MEA / Kultur Montage sitzt ~ 5 min in die Haube bei Raumtemperatur für Plasma / Thrombin Koagulation zu ermöglichen. In der Zwischenzeit, wiederholen Sie Schritt von 4,1 bis 4,3 für 3 weitere Kulturen. </li><li> Vorsichtig 600 ul Kulturmedium in kleine Tröpfchen, die Kultur-Kammer unter Verwendung einer 1 ml-Spritze mit 25 x 5 / 8 Nadel. </li><li> Verschließen Sie die MEA Kammer und Ort MEA / Kultur Montage auf dem schaukelnden Ablage in den Inkubator (Abb. 1B). Zur Beschleunigung des Verfahrens, 3 bis 4 MEAs kann in überlappenden Sequenzen zusammengestellt werden. Montagezeit für 12 MEAs sollte &lt;1 Stunde sein. </li><li> Nach 2 Tagen in vitro (DIV), mit 10 ul der Mitose-Hemmer. Refresh Kulturmedien von 60% bei 4 DIV und alle 4 Tage danach. </li></ol> 5. Elektrophysiologische Aufzeichnung und Stimulus-Generation <ol><li> Um die Beziehung zwischen signifikante Ausschläge in den lokalen Bereich Potential (LFP) und die Tendenz der Neuronen Aktionspotenziale Brand zu etablieren, nach ca. 1 Woche 5,6 Rekord spontane Aktivität bei 24 kHz für ~ 10 min von jeder Elektrode des MEA (Hardware : MEA1060 w / Ausblendschaltung, x1200 gewinnen, 12 bit A / D, Bereich 0-4096 mV, mehrkanaligen Systemen, Software: MC_Rack). Ground ist entweder über den internen Masseelektrode vorgesehen, oder extern durch Zugabe einer Ag / AgCl-Halbzelle. </li><li> Trennen Sie die LFP mit einem Bandpass-Filter von 1 bis 200 Hz aus extrazellulären Spike-Aktivität (Bandpass 300 - 3.000 Hz). Spike-Aktivität kann weiter in Einzel-und Multi-Unit-Tätigkeit, bei der off-line spike Sorter (zB Plexon Inc.) klassifiziert werden. Berechnen Spike ausgelöst Durchschnittswerte für jede Elektrode. Für Kortex Kulturen, werden die meisten Durchschnitte negativen LFP Ausschläge (nLFP) als die bevorzugte Zeit der neuronalen Spikes in die Kultur zu identifizieren. </li><li> Berechnen Sie für jede Elektrode eine Schwelle von -3 Standardabweichungen der Lärm (SD) von der LFP Spuren (Abb. 2)Bestimmen Stoßzeiten und Amplituden nLFPs, dass Cross Schwelle (Abb. 2B, C). Wählen Sie eine Zeit bin At (zB zwischen 2 bis 8 ms) und identifizieren raumzeitlichen nLFP Cluster auf dem Array durch die Verkettung nLFPs aus allen Elektrode, die in der gleichen aufeinanderfolgenden Mal Turbinen der Länge At (Abb. 2D; für Details 2,4 s. , 5). </li><li> Um neuronale Lawinen zu identifizieren, berechnen Sie die Größe der einzelnen nLFP Cluster, z. B. Anzahl der aktiven Elektroden oder die Summe der nLFP Amplituden, konstruieren eine Größe Histogramm und Grundstück in doppelt-logarithmischen Koordinaten. Für neuronale Lawinen, folgt die Größenverteilung einem Potenzgesetz durch eine gerade Linie in doppelt-logarithmischen Koordinaten 2 (Abb. 2E, F) angenähert. Siehe 16 für statistische Tests auf Macht Gesetze. </li><li> Elicit evozierte Potentiale im Gewebe durch die Auswahl einer Elektrode, durch die Strom-gesteuerten Reize mit einer Amplitude von S aufgetragen (Stimulus-Generator STG 1008, Multichannel-Systeme) sind. Zur Reduzierung der Elektroden beschädigen, verwenden Sie einen Bereich beschränkt, ladungsneutrale Stimulation der einzelnen Schocks mit bipolaren Rechteck-Wellenform: 50 ms mit einer Amplitude-S, gefolgt von 100 &amp;mgr; mit Amplitude + S / 2 und S zwischen 10 bis 200 uA. Siehe Bedienungsanleitung für weitere Details. </li><li> Zur Erfassung der Dynamik 9, Rekord Stimulus aufgezeichnet LFP Reaktionen bei 4 kHz Abtastrate auf allen Elektroden nach 500 ms nach der Stimulation. Verwenden Sie Blanking-Schaltung (Multi-Kanal-Systeme), die den Kopf der Bühne Verstärker trennt während der Stimulation auf einen Reiz Artefakte zu reduzieren und Vorverstärker Sättigung zu verhindern. </li></ol> 6. Repräsentative Ergebnisse: Mit neuen MEAs über 8 bis 9 von 10 Kulturen werden für viele Wochen überleben. Die meisten unserer langfristigen Aufzeichnungen erfolgen im Inkubator in Kulturmedium, die uns auf die Entwicklung der einzelnen Kulturen im Laufe von vielen Wochen 5 verfolgen können. Basierend auf unseren Experimenten können LFP-Aufnahmen zuverlässig mit MEAs für mehr als 100 Kultur Tagen verwendet eingeholt werden. Im Gegensatz dazu ist extrazellulären Spike-Aktivität mehr zuverlässig mit relativ neue MEAs (&lt;40 Kultur Tage) gemessen. In einem typischen Experiment, übertragen wir eine MEA aus der Ablage (Abb. 1B, rechts), um das Fach mit dem Kopf der Bühne befestigt (Abb. 1B, links) halten die Kultur abgedichtet. Für die Hirnrinde 5, Cortex-VTA Co-Kulturen 6, sowie in der narkotisierten Ratte 6 und die wach Affen in vivo 7, neuronale Aktivität während der neuronalen Lawinen in oberflächlichen Schichten tritt vorwiegend in der Nähe der Spitze negativen Auslenkung der LFP (nLFP ). So kann die räumlich-zeitliche Organisation der lokal synchrone neuronale Gruppen, die durch die Messung des Auftretens von nLFPs in Raum und Zeit auf dem Array 17 geschätzt werden. Aktivität auf dem MEA neigt dazu, in zeitlichen Clustern entstehen, ist, dass Aktivität an einer Elektrode durch Aktivität an anderen Standorten begleitet. Typische Verläufe der LFP während einer solchen Tätigkeit Perioden sind in Abbildung 2a dargestellt, um über Plotten 3 Cluster auftretenden mehrere Sekunden auseinander. Für jedes Cluster können negative Feld Ausschläge an mehreren Elektroden innerhalb eines Fensters von 1 zu sehen s. Beim Extrahieren nLFP Spitzen, die einen Schwellenwert von mehreren negativen SD Kreuz ist die Aktivität in Form von nLFP Spitzenzeiten komfortabel visualisiert in einem Raster, in der "Säulen" der Punkte gibt in der Nähe deckungsgleich nLFPs an verschiedenen Elektroden (Abb. 2B). Die raum-zeitliche Organisation dieser Aktivität ist ziemlich komplex; 'Spalten', die mehr oder weniger homogenen bei niedrigen zeitlichen Auflösung erscheinen, werden von getrennten Clustern auf höhere zeitliche Auflösung und so weiter (Abb. 2C) zusammen. In der Tat ist die Entstehung von räumlich-zeitlichen nLFP Clustern hoch in kortikalen Netzwerken organisiert. Genauer gesagt, ist die Organisation skaleninvarianten für neuronale Lawinen. Dies wird durch die Berechnung der Wahrscheinlichkeit von Cluster-Größen zu einem bestimmten zeitlichen Auflösung At demonstriert. Hier sind Cluster von nLFPs, dass in der gleichen oder aufeinanderfolgenden Zeitintervallen (Abb. 2D) auftreten zusammen. Wenn die Größe eines solchen Clusters in der Gesamtzahl der nLFPs pro Cluster, oder integriert nLFP Amplituden pro Cluster exprimiert wird, zeigt die Cluster-Größe Distributionen einem Potenzgesetz, deren Steigung hat sich gezeigt, auf -1,5 2,4,5,7 werden ( Abb.. 2E, F). Beachten Sie, dass diese Verteilung ein Scale-invariant Bestellung von Cluster-Größen, die das Verhältnis der Größen S bis KXS, wobei k ein konstanter Faktor ist identifiziert, ist k -1,5, die unabhängig von s ist Diese Kraft Gesetzes Organisation ist unabhängig von der Größe des Arrays 2, Ausschläge der zeitlichen Auflösung At 2, und die Schwelle zur erheblichen nLFP identifizieren 7. Da nLFP Amplitude skaliert mit neuronalen Gruppe Größe 7, spiegelt die skaleninvarianten Organisation nLFPs ein Scale-invariant, dh fraktale, Bestellung of lokal neuronalen Gruppen, dass alle Größen sind synchronisiert. <img src="/files/ftp_upload/2949/2949fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. (A) Seitenansicht und Draufsicht der MEA mit Gewinde Glasring montiert, und die entsprechenden cap. (B) Innenansicht des Inkubators. Links: headstage Halterung ermöglicht für die Aufnahme von einer einzigen Kultur unter Inkubator Zustand. Rechts: Tray hält zahlreiche MEAs für Kultur Wachstum. Side Räder: Schrittmotor gesteuert rocking Gerät für wechselnde untergetaucht und Atmosphäre ausgesetzt Phase für Kultur das Wachstum notwendig. (C) Schematische Darstellung der koronalen Ratte Scheiben für Cortex-VTA Co-Kulturen verwendet. Cortex Abschnitte (links) und Mittelhirn Abschnitte (Mitte, rechts) mit dem VTA ventralen Tegmentum (VTA; grau) sind durch Schneiden entlang der gestrichelten Linien erhalten. CTX: Cortex, wm: weiße Substanz; cpu: striatum; vta: Pons: pontine Bereich. Siehe auch entsprechende koronalen Platten 8, 18 und 20 um 15. (D) Placement und das Wachstum von einem einzigen Cortex-VTA Co-Kulturen auf der MEA und ihre Entwicklung in den ersten 9 DIV in der Kultur. Beachten Sie die Verflachung der Kultur und deren schrittweise Ausweitung auf dem Array. Reflektierende Gewebeteile zeigen entarteten Zellen und Gewebereste. Gesundes Gewebe ist undurchsichtig und grau unter Durchleuchtung mit sichtbarem Licht. <img src="/files/ftp_upload/2949/2949fig2.jpg" alt="Abbildung 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2. Neuronale Lawinen in kortikalen organotypischen Kulturen. (A) Overplot drei Zeitraum von spontaner Aktivität auf dem Array von mehreren Sekunden getrennt. Beachten Sie, dass jede Aktivität Zeitraum von negativen LFP Ausschläge auf vielen Elektroden auf dem Array (jede Farbe Etiketten eine Aktivität Periode) besteht. (B) Negative Spitzenzeiten nLFPs von jeder Elektrode werden in einem Raster von Aktivitäten zusammengestellt. "Column' Strukturen angegeben Zeiten in der Nähe synchrone Aktivität. (C) Beachten Sie, dass Spalten, die sehr an einer Zeitskala angezeigt werden synchronisiert von mehreren Spalten in den höheren zeitlichen Skalen (3 zeitlichen Skalen dargestellt) bestehen. (D) Schematische Darstellung der neuronalen Lawine Algorithmus. Auf einer 2 x 2 Elektroden-Array Peak-Zeit und Amplitude der negativen Ausschläge LFP (nLFP) Überqueren einer Schwelle von-x SD des Lärms identifiziert. Räumlich-zeitliche Organisation der nLFPs ist in der Reihe der aktiven Zeit bins der Breite At geclustert. Die Größe eines Clusters wird entweder durch die Anzahl der aktiven Zentren, dh Elektroden mit nLFP identifiziert (s = 4) oder die integrierte Summe nLFP Amplituden (s = 130 uV). Die Lebensdauer wird in Vielfachen von At gemessen. (E, F) Power Gesetz in Cluster-Größenverteilung identifiziert Cluster als neuronale Lawinen. Beachten Sie, dass die Wahl eines bestimmten interelectrode Entfernungen für das Array (hier 200 pm) Dd eine besondere At, bei dem die Dynamik beobachtet werden sollte einführt. Genauer gesagt, in welchem ​​Verhältnis Dd / At nähert sich der durchschnittliche Ausbreitungsgeschwindigkeit im Netz, bei der die Steigung α der Macht Recht ist annähernd -1,5 für die neuronale Lawinen 2,4,5. Bitte <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2949/2949largefig2.jpg">klicken Sie hier,</a> um eine größere Version der Abbildung 2 zu sehen.

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<li>Götz, M., Bolz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+vasoactive+intestinal+polypeptide+%28VIP%29-containing+neurons+in+organotypic+slice+cultures+from+rat+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Lett%22%5BJournal%5D)">Development of vasoactive intestinal polypeptide (VIP)-containing neurons in organotypic slice cultures from rat visual cortex.</a> Neurosci. Lett. 107, 6-11 (1989).</li>
<li>Götz, M., Bolz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+and+Preservation+of+cortical+layers+in+slice+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Formation and Preservation of cortical layers in slice cultures.</a> J. Neurobiol. 23, 783-802 (1992).</li>
<li>Bolz, J., Novak, N., Götz, M., Bonhoeffer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+target-specific+neuronal+projections+in+organotypic+slice+cultures+from+rat+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Formation of target-specific neuronal projections in organotypic slice cultures from rat visual cortex.</a> Nature. 346, 359-362 (1990).</li>
<li>Bolz, J., Novak, N., Staiger, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+specific+afferent+connections+in+organotypic+slice+cultures+from+rat+visual+cortex+cocultured+with+lateral+geniculate+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Formation of specific afferent connections in organotypic slice cultures from rat visual cortex cocultured with lateral geniculate nucleus.</a> J. Neurosci. 12, 3054-3070 (1992).</li>
<li>Novak, N., Bolz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+specific+efferent+connections+in+organotypic+slice+cultures+from+rat+visual+cortex+cocultured+with+lateral+geniculate+nucleus+and+superior+colliculus%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Formation of specific efferent connections in organotypic slice cultures from rat visual cortex cocultured with lateral geniculate nucleus and superior colliculus.</a> Eur. J. Neurosci. 5, 15-24 (1993).</li>
<li>Plenz, D., Aertsen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+dynamics+in+cortex-striatum+co-cultures.+I.+Anatomy+and+electrophysiology+of+neuronal+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neural dynamics in cortex-striatum co-cultures. I. Anatomy and electrophysiology of neuronal cell types.</a> Neurosci. 70, 861-891 (1996).</li>
<li>Plenz, D., Aertsen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+dynamics+in+cortex-striatum+co-cultures.+II.+Spatio-temporal+characteristics+of+neuronal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neuronal dynamics in cortex-striatum co-cultures. II. Spatio-temporal characteristics of neuronal activity.</a> Neurosci. 70, 893-924 (1996).</li>
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<li>Plenz, D., Herrera-Marschitz, M., Kitai, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+organization+of+the+globus+pallidus-subthalamic+nucleus+system+studied+in+organotypic+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Morphological organization of the globus pallidus-subthalamic nucleus system studied in organotypic cultures.</a> J. Comp. Neurol. 397, 437-457 (1998).</li>
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<li>Plenz, D., Kitai, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+high-frequency+oscillations+in+local+circuits+of+rat+somatosensory+cortex+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Generation of high-frequency oscillations in local circuits of rat somatosensory cortex cultures.</a> J Neurophysiol. 76, 4180-4184 (1996).</li>
<li>Klostermann, O., Wahle, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterns+of+spontaneous+activity+and+morphology+of+interneuron+types+in+organotypic+cortex+and+thalamus-cortex+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci%22%5BJournal%5D)">Patterns of spontaneous activity and morphology of interneuron types in organotypic cortex and thalamus-cortex cultures.</a> Neurosci. 92, 1243-1259 (1999).</li>
<li>Cowan, R. L., Wilson, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+firing+patterns+and+axonal+projections+of+single+cortico-striatal+neurons+in+the+rat+medial+agranular+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Spontaneous firing patterns and axonal projections of single cortico-striatal neurons in the rat medial agranular cortex.</a> J. Neurophysiol. 71, 17-32 (1994).</li>
<li>Porter, L. L., Rizzo, E., Hornung, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopamine+affects+parvalbumin+expression+during+cortical+development+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Dopamine affects parvalbumin expression during cortical development in vitro.</a> J Neurosci. 19, 8990-9003 (1999).</li>
</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

1. Technische Fragen: <ol><li> Sterile Technik. Die Aufstellung von MEAs und Kultur Vorbereitung sind alle in einer Sterilbank unter sterilen Bedingungen durchgeführt. Antibiotika, die neuronale Aktivität beeinflussen, sind nicht zu jeder Zeit während der Vorbereitung und Kultur eingesetzt. </li><li> Plasma / Thrombin Koagulation und Gewebe Einhaltung der MEA. Tissue Überleben auf dem MEA erfordert eine sorgfältige Balance zwischen der Zeit, für Plasma / Thrombin Koagulation und die Zeit des Gewebes an der Luft erforderlich. Eine kurze Gerinnungszeit Risiken vorzeitigen Ablösung von Abschnitten aus der MEA, während längerer Atmosphäre löst Gewebedegeneration. Da die Stärke des Thrombin-Lösung bestimmt die Geschwindigkeit der Koagulation ist es ein sehr wichtiger Parameter für die erfolgreiche Anbringung, gesunde Kulturen der MEA-Oberfläche. Wir erzielen die besten Ergebnisse mit 1000 Einheiten (1KU; 1 NIH-Einheit = 0,324 ± 0,073 mg). Wichtig ist, dass unvollständige Vermischung der Plasma / Thrombin-Lösung resultiert in räumlich heterogenen Koagulation Förderung Plasma-Brüche während der Kultivierung. Diese Plasma-&quot;Löcher&quot; erheblich beeinträchtigen Kultur Gesundheit und lösen Sie die Kultur von Mikroelektroden, damit Abstriche bei der Qualität der elektrophysiologischen Aufzeichnung. Arbeiten mit Kühlplatten während der MEA / Gewebe Montage verlangsamt die Blutgerinnung und ermöglicht eine homogene Durchmischung des Plasmas / Thrombin-Lösung und die richtige Positionierung der Gewebeschnitten. Auch durch Zugabe von Medium in einzelne Tröpfchen, die Kultur Kammer zu versenken die Kultur nach nur 5 min von Koagulation, reduziert das Risiko von Gewebe Abteilungen aufgrund der Oberflächenspannung. Eine erfolgreiche Kultur wird auf der MEA flach und leicht zu erweitern, welche ein gesundes Wachstum für Wochen, ohne größere Anzeichen von unvollständiger Gewebe-MEA Kontakt oder Gewebedegeneration (z. B. Abb. 1D). </li><li> Gewebedissektion. Micro Messer haben unsere Dissektion Prozess verbessert. Wir verwenden doppelte Rasierklingen (Fine Science Tools - zerbrechlich Skalpellklingen - 100050-00), aus denen wir uns trennen ~ 2 mm breite Klingen &quot;mit einer Zange, und halten Sie sie mit einem Skalpell Inhaber. Gewebeproben aus den koronalen Schnitt mit einem glatten, senkrechten festen Bewegung des Messers seziert dabei stark reduziert mechanische Belastung durch Ziehen des Gewebes insgesamt verbessern Kultur Gesundheit. </li><li> Tissue Kühlung. Ordnungsgemäße Kühlung der Scheiben und Gewebeschnitte während der Vorbereitung ist unerlässlich für die Kultur Erfolg. Wir verwenden maßgeschneiderte kalten Platten von Peltier-Elementen unter einer Metallscheibe befestigt gebaut. Die Wärme, die durch das Peltier-Element erzeugt wird, durch kaltes Wasser Perfusion entfernt. Dies reduziert die Vorbereitungszeit und standardisiert Kühlung während jeder Phase der Vorbereitung (Dold Labs &amp; Engineering 131 Plantation Dr. Seguin, TX 78155;. (830) 560-1471)). </li><li> Incubator Zustand. Eine maßgeschneiderte Inkubator mit präzisen internen rocking Bedingungen war entscheidend für unseren Erfolg in der Pflege Scheiben auf MEAs. Basierend auf einem Original in-house design by Multichannelsystems (derzeit nicht im Handel erhältlich), besteht die interne rocking Gerät von Schalen, die mit zwei großen seitlichen Rädern angebracht sind. Schrittmotoren und EDV-Steuerung ermöglicht eine präzise Flugbahn rocking (rocking Winkel, rocking Geschwindigkeit und intermittierenden Pausen). Letztlich müssen Slice Kulturen in die Atmosphäre und Kulturmedium in langsamen Wechsel ausgesetzt werden. Der traditionelle Ansatz besteht darin, Slice Kulturen in engen Röhren, die sich langsam entlang gibt es am längsten Achse zu drehen statt. Dabei spielt langsame Rotation nicht produzieren mechanische Belastung durch die Rotation selbst, und die Rotationsgeschwindigkeit ist hoch genug, um eine optimale Fütterung / Atmung &quot;-Zyklus von etwa 5 erhalten - 10 min Dauer. Je kompakter Innere des MEA Kammer, ihre Gesamtvolumen von ca. 2 ccm, und die kleine Kulturmedium Volumen für mittlere Konditionierung durch das Gewebe selbst erforderlich sind, stellt eine erhebliche Herausforderung. Durch Schütteln der MEA zwischen ± 70 ° Winkel (Zykluszeit: ~ 200 s), Verlangsamung der rocking Geschwindigkeit wie die Kultur Übergänge zwischen der flüssigen Phase und die Atmosphäre, und die Eindämmung des rocking an den äußersten Winkeln für längere Einwirkung der Atmosphäre hat wesentlich gewesen für die Kultur überleben. </li></ol> 2. Developmental Alter von Cortex Kulturen zu neuronalen Lawinen-Studie Akute Scheiben von Rattencortex werden in der Regel bei PND 0 Gewinner - 1 und kultiviert für viele Wochen auf der MEA. Frühe Studien haben deutlich gezeigt, dass einzelne Kortex Scheibe Kulturen, nach mehreren Wochen in vitro, pflegen eine geschichtete Struktur mit identifizierbaren Zelltypen, die sich leicht in vivo Zell-Klassen 18,18-21 verglichen werden kann. Das geschichtete Organisation in diesem in vitro-System wurde verwendet, um bequem Thalamus StudieInnervation der Hirnrinde während der Entwicklung 22-24, sowie für den Antrieb subkortikale Strukturen wie das Striatum 25,26. In der Tat ermöglicht die Spezifität bei der Bildung von neuronalen Verbindungen innerhalb und zwischen den Hirnregionen für den Bau des Komplexes in vitro-Systeme, zahlreiche detaillierte Projektionssysteme zurückzuerobern, zB, dass der Kortex-Basalganglien-Schaltung 27-30. Nach 4 bis 6 Wochen in vitro, single Kortex Scheiben 31 und Cortex Scheiben mit striatum 26 oder Thalamus 32 zeigen spontane co-kultivierten Up-und Down Staaten typischerweise in vivo in der Urethan-narkotisierten Ratten 33 gefunden. Die feine zeitliche Organisation dieser up-Staaten trägt die Handschrift von verschachtelten θ-und γ-Oszillationen weisen auf eine elektrophysiologisch reifen Netzwerk von pyramidalen Neuronen und schnell spiking GABAergen Interneuronen 31. Wichtig ist, dass in der Abwesenheit von Dopamin-D2-Rezeptor-Stimulation, ist die Reifung von Parvalbumin-positive kortikale Interneuronen von ca. 2 Wochen in Cortex Schnittkulturen 34 verzögert. Im Einklang mit diesen Ergebnissen die Entwicklung zeitlichen Verlauf der verschachtelten θ-, β-und γ-Oszillationen ist, dass in vivo trifft zu, wenn Kortex Scheiben sind mit dem ventralen Tegmentum (VTA), die dopaminergen Neuronen projizieren, die enthält co-kultivierten Cortex 6. Diese Studien zeigen, dass bei der Untersuchung neuronaler Lawinen, die entscheidend davon abhängen, reifen schnell GABAergen Hemmung und sind in oberflächlichen Schichten des Kortex 2,4 gelegen, großer Sorgfalt zu treffen, um eine ordnungsgemäße Reifung der kortikalen Gewebes zu gewährleisten werden muss. Während neuronale Lawinen in einzelnen Kortex Kulturen entstehen über den zeitlichen Verlauf der 2 bis 5 Wochen 4, wenn die eine Entwicklungszeit natürlich, dass die in vivo Entwicklung abgestimmt ist, müssen Kortex Scheiben eine entsprechende Dopamin-Rezeptor-Stimulation, zB durch Co-Kultivierung Kortex Scheiben mit dem VTA 6.

<table border="1"><tbody><tr><th> Name des Reagenzes </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nummer </th><th> Kommentare (optional) </th></tr><tr><td> Integrierte planare Multielektroden Array </td><td> Multichannel Systems ( <a href="www.multichannelsystems.com">www.multichannelsystems.com</a> ) ALA Scientific Instruments (Www.alascience.com) </td><td> <a href="http://www.multichannelsystems.com/products-mea/product-details/products/158/20030ir-ito-wo.html">200/30iR-ITO-w/o</a> </td><td> Titannitrat (TiN)-Elektroden (30 mm Durchmesser) haben große Oberfläche führt mit niedriger Impedanz (~ 1,5 kOhm bei 1 kHz) und eine hervorragende Breitband-Aufnahmen (w / o - ohne Ring) </td></tr><tr><td> Kammer aus Glas </td><td> www.aceglass.com </td><td> 7620-32 </td><td> Threaded Glaszylinder </td></tr><tr><td> Kammer Kappe </td><td> www.aceglass.com </td><td> 7622-114 </td><td> Kunststoffkappe mit Teflon-Einsatz </td></tr><tr><td> Sylgard 184 </td><td> www.wpiinc.com </td><td> SYLG184 </td><td> Zwei-Komponenten-Silikon-Elastomer </td></tr><tr><td> Poly-D-Lysin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P6407-5mg </td><td> γ-bestrahlt, lyophilisierte Pulver-, Zell-kultivierten getestet. Rekonstitution mit 5 ml VE-Wasser vor dem Gebrauch. </td></tr><tr><td> Gey-Balanced Salt-Lösung </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G9779-500ml </td><td> sterilfiltriert und kultiviert getestet </td></tr><tr><td> Huhn Plasma </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P3266-5 ml </td><td> Lyophilisierte, rekonstruieren mit 5 ml VE-Wasser vor dem Gebrauch. </td></tr><tr><td> Thrombin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T6634-1KU </td><td> aus Rinder-Plasma, Pulver lyophilisiert. </td></tr><tr><td> Pferdeserum </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H1138-100mL </td><td> Spender Herde, getestet Hitze inaktiviert, Zellkultur </td></tr><tr><td> Basal Medium Eagle </td><td> Invitrogen </td><td> 21010-046 </td><td> 1x, 500 ml - (+) Earle-Salzen, (-) L-Glutamin), </td></tr><tr><td> Hanks Salzlösung </td><td> Invitrogen </td><td> 24020-117 </td><td> 500 ml - (+) Magnesium, (+) Kalzium, w / Phenolrot) </td></tr><tr><td> Chamber Slides </td><td> Lab-Tek Chamber Slide-w / Deckel (Nunc), steril </td><td> 177429 </td><td></td></tr><tr><td> Uridin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> U3003 </td><td></td></tr><tr><td> ARA-C Cytosin-β-D-arabinofuranosid </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C6645 </td><td></td></tr><tr><td> 5-Fluor-2&#39;-desoxyuridin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> F0503 </td><td></td></tr></tbody></table>

multi-elektroden-array recordings neuronaler lawinen in organotypischen kulturen

Multi-electrode Array Recordings of Neuronal Avalanches in Organotypic Cultures

Der Kortex ist spontan aktiv, auch in Abwesenheit eines bestimmten Eingang oder Motorleistung. Während der Entwicklung, ist diese Tätigkeit für die Migration und Differenzierung von Cortex Zelltypen und die Bildung neuronaler Verbindungen 1 wichtig. In den reifen Tier, ein Ausdruck der fortlaufenden Tätigkeit der Vergangenheit und den gegenwärtigen Zustand eines Tieres in die Sinnesreize nahtlos integriert sind, um künftige Aktionen zu berechnen. Somit ist ein klares Verständnis von der Organisation der laufenden dh spontane Aktivität eine Voraussetzung für die Cortex-Funktion zu verstehen. Zahlreiche Aufnahme-Techniken ergab, dass die laufenden Aktivitäten in der Rinde der vielen Neuronen, deren einzelne Aktivitäten vorübergehend zu größeren Veranstaltungen, die im lokalen Bereich Potential (LFP) mit extrazellulären Mikroelektroden detektiert werden können Summe, oder in das Elektroenzephalogramm (EEG), die Magnetoenzephalogramm (MEG ist zusammen ) und das BOLD-Signal von der funktionellen Magnetresonanztomographie (fMRI). Die LFP wird derzeit die Methode der Wahl bei der Untersuchung neuronaler Aktivität Bevölkerung mit hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung bei der mesoskopischen Skala (mehrere tausend Neuronen). Bei der extrazellulären Mikroelektroden, lokal Aktivitäten von räumlich benachbarten Neuronen führen schnelle Ausschläge in den LFP bis zu mehreren hundert Mikrovolt synchronisiert. Bei Verwendung einer Anordnung von Mikroelektroden, können die Organisationen wie Ausschläge bequem in Raum und Zeit überwacht werden. Neuronale Lawinen beschreiben die skaleninvarianten raumzeitliche Organisation der laufenden neuronalen Aktivität im Gehirn 2,3. Sie sind spezifisch für den oberflächlichen Schichten des Kortex als in vitro 4,5 etabliert, in vivo in der narkotisierten Ratte 6 und in der wachen Affen 7. Wichtig ist, deuten sowohl theoretische als auch empirische Studien 2,8-10, dass neuronale Lawinen ein exquisit ausgewogene kritischen Zustand Dynamik des Kortex, die Informationen übertragen und Informationsverarbeitung optimiert anzuzeigen. Um die Mechanismen der neuronalen Lawine Entwicklung, Wartung und Regulierung Studie, in vitro Vorbereitungen sind sehr nützlich, da sie für stabile Aufnahmen von Lawinen unter genau kontrollierten Bedingungen zu ermöglichen. Das aktuelle Protokoll beschreibt, wie neuronale Lawinen in vitro durch die Nutzung der oberflächlichen Schicht Entwicklung in organotypischen Kulturen Kortex, also Scheibe Kulturen, auf ebenen, integrierter Mikroelektroden-Arrays (MEA, siehe auch 11-14) gewachsen zu studieren.

Eine robuste Art und Weise die neuronale Lawinen, dh skaleninvarianten räumlich-zeitliche Aktivitätsmuster platzt, was auf kritischen Zustand Dynamik in Kortex zu untersuchen. Lawinen entstehen spontan bei der Entwicklung von oberflächlichen Schichten der kultivierten Cortex, die für die langfristige Messungen der Aktivität ermöglicht mit planaren integrierten Multi-Elektroden-Arrays (MEA) unter genau kontrollierten Bedingungen.

Multi-Elektroden-Array Recordings neuronaler Lawinen in organotypischen Kulturen

Der Kortex ist spontan aktiv, selbst in Abwesenheit eines bestimmten Inputs oder motorischen Outputs. Während der Entwicklung ist diese Aktivität wichtig für die ...

Das Ziel dieses Experiments besteht darin, die Selbstorganisation gesunder Hirnaktivität in neuronale Lawinen zu untersuchen, die das Kennzeichen kritischer Zustandsdynamiken in der Großhirnrinde darstellen. Dies wird erreicht, indem ein koronarer Schnitt der geschichteten Großhirnrinde mit einem Mittelhirnschnitt kombiniert wird, der entwicklungsbedeutsame dopaminerge Eingaben an die Großhirnrinde liefert. Als zweiter Schritt wird die Kokultur aus Großhirnrinde und Mittelhirn auf einem Multielektrodenarray kultiviert, das eine multizentrische Stimulation und Aufzeichnung neuronaler Aktivitäten in der Kultur ermöglicht.Anschließend lassen wir die Kokultur während der ersten ein bis zwei Wochen in einem speziell konstruierten Inkubator abflachen, sich ausdehnen und an der MEA-Oberfläche anheften, wobei die Kultur periodisch normaler Luft und Kulturmedium ausgesetzt wird. Es werden flüssige Ergebnisse erhalten, die die spontane Selbstorganisation räumlich-zeitlicher Ausschläge des lokalen Feldpotentials in neuronale Lawinen zeigen. Die Grundlage bilden MEA-Aufzeichnungen und eine Offline-Analyse der Lawinen, die das Potenzgesetz in den Größen der Lawinen identifiziert.Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden, wie dissoziierten Kulturen, liegt in ihrem systemischen, neurowissenschaftlichen Aspekt. Wir können viele Hirnregionen gemeinsam kultivieren, und diese Kulturen aus mehreren Regionen bilden eine Hirnorganisation, die auf großer Skala korrekt ist, beispielsweise hinsichtlich kortikaler Schichten und Projektionssysteme. Die Anwendungen dieser Technik reichen über die Untersuchung neuronaler Lawinen hinaus.Beispielsweise können wir die Reizantwort auf Netzwerkebene unter genau kontrollierten In-vitro-Bedingungen untersuchen. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist entscheidend, da das korrekte Auftragen der Plasma-Thrombin-Mischung und das Positionieren des Gewebes auf der MEA schwer zu erlernen sind. Diese Schritte erfordern einen geeigneten Zeitpunkt, das richtige Temperaturgefälle und vermeiden, die empfindliche MEA-Oberfläche direkt zu berühren.Um eine sterile, verschließbare Glaswanne für die Ableitungen vorzubereiten, schneiden Sie zunächst gewindeförmige Glaszylinder mit einem Teflonkunststoffdeckel etwa zwei Millimeter unterhalb des Gewindes ab. Diese werden benötigt, um die Kulturwanne sicher und dicht zu verschließen. Anschließend reinigen Sie die Glaskolben, indem Sie sie dreimal mit Wasser spülen und dann fünf Minuten lang in absolutem Ethylalkohol kochen.Stellen Sie diese beiseite, um sie zu trocknen; eine Silikonlösung ist erforderlich, um die Glasringe an der MEA-Oberfläche zu befestigen. Verwenden Sie ein Cell Guard 180 4 Silikon-Elastomer-Kit und mischen Sie 15 Milliliter der Komponenten A und B gründlich. Anschließend 15 Minuten ruhen lassen, um Luftblasen zu entfernen.Trennen Sie die Lösung in ein Milliliter Eloqua ab und lagern Sie sie bei minus 20 Grad Celsius für die spätere Verwendung. Kleben Sie nun einen Glasring auf die MEA, indem Sie ein Milliliter Silikon bei 23 Grad Celsius mit einer Spritze und einer Nadel mit kleinem Durchmesser aufnehmen und auf die unpolierte Schnittfläche des Glasrings auftragen. Zentrieren Sie dann den Glasring auf der MEA und tragen Sie eine zusätzliche Schicht Silikon außen um den Ring herum auf, um eine stärkere Abdichtung zu erzielen.Lassen Sie dies für eine bis zwei Stunden bei etwa 60 Grad Celsius auf einem Heizblock aushärten. Anschließend sterilisieren Sie die MEA-Kammer und die Kammerdeckel unter dem laminaren Luftstrom, indem Sie sie dreimal mit entionisiertem Wasser und danach dreimal mit 70 %igem Alkohol spülen, wobei der letzte Spülgang mit Alkohol erfolgt. Lassen Sie die Kammer 10 Minuten im Alkohol stehen.Im Anschluss die Kammer und das Innere des Deckels 10 Minuten lang UV-Licht aussetzen. Bei 120 Grad Celsius 45 Minuten lang autoklavieren. Nach der Sterilisation diese trocknen lassen.Bestreichen Sie nun die MEA-Oberfläche innerhalb der Kulturkammer mit Poly-D-Lysin. Neue MEAs, wie sie in diesem Experiment verwendet werden, sind eher lipophil, daher mehrfaches Auftragen von Tropfen erforderlich. Absaugen der Lösung vom Elektrodengitter.Befestigen Sie die Kappe, um die MEA-Kammer zur Lagerung und zukünftigen Verwendung abzudichten. Dieses Verfahren ergibt Cortex- und VTA-Schnitte für etwa 12 Co-Kulturen und sollte innerhalb eines laminaren Luftstromgehäuses unter sterilen Bedingungen mit gesunden ein- bis zweitägigen nachgeborenen Tieren durchgeführt werden; die Gesamtzeit für die Gewebegewinnung sollte weniger als eine Stunde betragen. Beginnen Sie nach der Enthauptung mit der Entnahme des Gehirns, indem Sie zunächst zwei seitliche Schnitte mit der Schere ausführen, um die Haut von der Kopfhaut zu entfernen.Entfernen Sie den Schädel und öffnen Sie ihn mit einer feinen Augenscheren, indem Sie einen sagittalen Median- und einen koronalen Schnitt am Übergang zwischen Kortex und Kleinhirn anlegen. Klappen Sie die vier Schädelflächen zurück, um das Gehirn freizulegen. Schneiden Sie anschließend mit einem geschärften Spatel frontal durch den Riechkolben.Dann bewegen Sie den Spatel viertelweise unter das Gehirn. Heben Sie das Gehirn vorsichtig aus dem Schädel und lassen Sie es in gekühlte Gaze gleiten. Lösung zur schnellen Abkühlung und vorübergehenden Lagerung.Wiederholen Sie das obige Verfahren für zwei weitere Gehirne. Um VTA-Gewebe zu erhalten, überführen Sie die Gehirne auf eine sterile, trockene Petrischale. Entfernen Sie mit einem kleinen Spatel vorsichtig die überschüssige Flüssigkeit, indem Sie jedes Gehirn etwa einen Zentimeter seitlich verschieben.Entfernen Sie dann mit einem Rasierklinge den Hirnstamm, indem Sie einen koronalen vertikalen Schnitt auf Höhe des Kleinhirns durchführen. Kleben Sie nun einen Agarblock auf eine Montagescheibe, um die Gehirne während des Schneidens mechanisch zu stabilisieren. Bringen Sie anschließend mit einem kleinen Spatel einen dünnen Strich Sekundenkleber einige Millimeter vor dem Agarblock auf der Scheibe an, wobei darauf zu achten ist, dass der Kleber den Agarblock nicht berührt.Übertragen und montieren Sie jedes Gehirn mit der Frontalpole nach unten. Stellen Sie sicher, dass die Frontalpole auf der Montagescheibe befestigt sind und die ventralen Seiten die Agarose berühren, ohne dass Klebstoffrückstände vorhanden sind. Dies gewährleistet eine geeignete mechanische Stabilisierung während des Schneidens und eine einfache Entnahme der geschnittenen Schnitte.Danach tauchen Sie die Montagescheibe mit den darauf befestigten Gehirnen vorsichtig ein und sichern sie in einer Vibram-Schale, die mit gekühlter Gaze-Lösung gefüllt ist. Anschließend schneiden Sie mit einer sorgfältig gereinigten Rasierklinge 400 Mikrometer dicke koronare Schnitte des Mittelhirns bei höchster Vibrationsfrequenz und relativ niedriger Vorschubgeschwindigkeit. Sammeln und überführen Sie die Schnitte, die das VTA enthalten, mithilfe einer umgedrehten Pasteur-Pipette mit Saugbirne in 35 × 10 Millimeter große Petrischalen, die mit steriler, gekühlter Gaze-Lösung für kortikale Schnitte gefüllt sind. Wiederholen Sie die vorherigen Schrittschneidenschritte, führen Sie jedoch einen vertikalen Schnitt zwischen Kortex und Kleinhirn durch und befestigen Sie die vier Gehirne mit der Frontalpole nach oben. Sammeln Sie etwa drei koronale Schnitte mit einer Dicke von 350 Mikrometern, beginnend auf der Ebene des Striatums. Verwenden Sie nun ein Mikromesser aus gebrochenen Rasierklingen, um unter einem Stereomikroskop etwa zwei Millimeter breite koronale Abschnitte des frontalen Kortex und von Mittelhirnarealen, die die VTA enthalten, zu dissezieren. Sammeln Sie die Gewebeschnitte getrennt in kleinen Schalen, die mit gekühlter Gaze-Lösung gefüllt sind.Um mit dem Montieren des Gewebes in der MEA-Kammer zu beginnen, positionieren Sie zunächst die MEA bei Raumtemperatur unter einem Stereomikroskop, sodass das Elektrodenarray scharf gestellt ist. Anschließend bringen Sie einen 25-Mikroliter-Tropfen Plasma mittig auf der sauberen, staubfreien und sterilen Matrix des Elektrodenarrays auf. Mit einem kleinen Spatel schieben Sie vorsichtig einen Cortex- und VTA-Abschnitt in den Plasma-Tropfen.Platzieren Sie nun die MEA auf einer Kühlplatte und stellen Sie die Ansicht erneut scharf. Lassen Sie dies etwa 15 Sekunden lang abkühlen, bevor Sie 25 Mikroliter Thrombin in den Plasmatropfen geben. Verteilen Sie dann mit der Thrombin-Pipettenspitze vorsichtig die Plasmathrombin-Mischung durch kleine kreisförmige Bewegungen über die MEA.Vermeiden Sie es sorgfältig, die spröde Elektrodenanordnung direkt zu berühren. Positionieren Sie anschließend vorsichtig den Kortex auf der Anordnung, wobei die dorsale Begrenzung entlang der zweiten Elektrodenreihe liegen sollte. Auf diese Weise werden die sich entwickelnden oberflächlichen Schichten schließlich den restlichen Teil der Anordnung bedecken.Platzieren Sie dann die VTA benachbart zur ventralen Grenze des kortikalen Schnitts. Verschließen Sie nun die MEA-Kammer und schließen Sie sie locker, um eine hohe Luftfeuchtigkeit zu bewahren. Lassen Sie die MEA-Kulturvorrichtung etwa sechs Minuten lang bei Raumtemperatur im Sicherheitswerkbankgehäuse stehen, damit das Plasma-Thrombin gerinnt und koaguliert.Unterdessen wiederholen Sie den Vorgang, um drei weitere Kulturen vorzubereiten. Fügen Sie anschließend mit einer 1-cc-Spritze und einer 25 × 5/8-Zoll-Nadel vorsichtig in kleinen Tropfen 600 Mikroliter Kulturmedium zu den Kulturkammern hinzu. Schließen Sie danach die MEA-Kammer fest und stellen Sie die MEA-Kulturanordnung auf das schwenkbare Lageregister im Inneren des Inkubators.Nach zwei Tagen in vitro 10 Mikroliter Mitoseinhibitor hinzufügen. Anschließend erneuern Sie das Kulturmedium zu 60 % nach vier Tagen in vitro und danach alle vier Tage. Während des normalen Wachstums wird sich die Kultur deutlich abflachen und leicht dorsal expandieren.Aufgrund der Entwicklung oberflächlicher kortikaler Schichten zeichnet sich eine gesunde Kultur im Hellfeld durch ihr undurchsichtiges, grauliches Gewebe aus. Umgekehrt weisen helle, reflektierende Vesikel, ein Merkmal absterbender, degenerativer Zellen, etwa 10 bis 12 Tage nach der Herstellung der Kulturen darauf hin, dass diese zum Aufzeichnen und Stimulieren bereit sind. Um eine Aufnahmesitzung zu beginnen, wird die MEA von der Lagertasche auf die Aufzeichnungs-Headstage übertragen.Um das lokale Feldpotential (LFP) aufzuzeichnen, verwenden Sie einen Bandpassfilter von eins bis 200 Hertz. Multieinheitenaktivität kann ebenfalls mit einem Bandpassfilter von 300 bis 3000 Hertz untersucht werden. Gesunde spontane Aktivität tritt typischerweise in Bursts unterschiedlicher Größe und Dauer auf.Um die Beziehung zwischen LFP und Einzelzellaktivität zu untersuchen, können wir die aus Spikes ausgelösten Mittelwerte des LFP berechnen. Bei diesen Kortexkulturen korrelieren negative LFP-Ausschläge mit neuronalem Spiking, um stimulusinduzierte Aktivität aufzuzeichnen. Zunächst werden die zeitliche Wellenform und die Amplitude der Reize mittels einer Software festgelegt, die einen Stimulansgenerator steuert.Ein nützliches Stimulationsparadigma ist der stromgesteuerte, ladungsneutrale Einzelimpuls mit bipolarem Rechteckverlauf. Anschließend wird eine Elektrode ausgewählt, die zur Applikation der Reize verwendet wird. Typische, durch den Reiz hervorgerufene LFP-Antworten ähneln spontanen Aktivitätsausbrüchen. Die Blankingschaltung trennt die Verstärker während der Stimulation, um Stimulationsartefakte zu verringern und eine Sättigung der Verstärker zu verhindern. Die Stimulations-Elektrode benötigt mehrere Sekunden, um sich von der Stimulation zu erholen, und kann daher nicht zur Aufzeichnung der Antwortaktivität verwendet werden. Auf der MEA treten Aktivitäten tendenziell in räumlich-zeitlichen Clustern auf, wobei die Aktivität an einer Elektrode oft von Aktivitäten an anderen Stellen begleitet wird.Gleichzeitig werden hier typische Wellenformen des LFP während solcher Aktivitätsphasen gezeigt, indem drei Cluster, die jeweils mehrere Sekunden auseinanderliegen, übereinander gelegt werden. Negative LFP-Ausschläge sind an mehreren Elektroden innerhalb eines Zeitfensters von einer Sekunde erkennbar, wenn NLFP-Peaks extrahiert werden, die einen Schwellenwert aus mehreren negativen Standardabweichungen (sd) überschreiten. Die Aktivität in Form von NLFP-Peak-Zeiten lässt sich zweckmäßigerweise in einem Rasta darstellen, bei dem Spalten von Punkten nahezu gleichzeitige NPS an verschiedenen Elektroden repräsentieren. Die räumlich-zeitliche Organisation dieser Aktivität ist recht komplex.Spalten, die bei niedriger zeitlicher Auflösung mehr oder weniger homogen erscheinen, bestehen bei höherer zeitlicher Auflösung aus separaten Clustern und so weiter. Das Entstehen von räumlichen, geotemporalen und LFP-Clustern ist in kortikalen Netzwerken hochgradig organisiert. Genauer gesagt ist die Organisation skaleninvariant für neuronale Lawinen. Dies wird durch die Berechnung der Wahrscheinlichkeit von Clustern in einer bestimmten zeitlichen Auflösung veranschaulicht. Delta T. Hier bestehen die Cluster aus NL-FPS, die im selben oder aufeinanderfolgenden Zeitintervallen auftreten. Wenn die Größe eines solchen Clusters als Gesamtanzahl der NFPS pro Cluster oder als integrierte NLFP-Amplituden pro Cluster ausgedrückt wird, zeigt die Verteilung der Clustergrößen ein Potenzgesetz mit einem Exponenten nahe minus 1,5. Nachdem Sie dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Gehirngewebe vorsichtig präpariert und Kulturen auf Multielektrodenarrays züchtet, um die Selbstorganisation neuronaler Aktivität zu untersuchen.Mit diesen Methoden wurde außerdem der Zusammenhang zwischen spontaner Aktivität und stimulusinduzierter Aktivität in kortikalen Netzwerken untersucht.

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