Name: Lentivirus-vermittelte Gen-Manipulation und Visualisierung von Riechzellen In vivo /em (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 34 s
Description: Lernen Sie eine lentivirale Methode zur Genmanipulation und Visualisierung einzelner olfaktorischer Sensorneuronen in vivo. Diese Technik ermöglicht die detaillierte Analyse von Axontrajektorien und terminalen Arborisationen im komplexen olfaktorischen System.

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Diese Studie wird von NIH DC052256 und DC006015 und NSF 0324769 zu QG und T32-DC008072 BS unterstützt.

1. Vorbereitung Dieses Verfahren ist Sicherheitsstufe 2, also all die folgenden Vorbereitungen sind in einem biohazard Haube, wo die Mikroinjektion Verfahren durchgeführt hat. <ol><li> Vorbereitung und Vorwärmung einem 37 ° C Wasserbett: Füllen Sie eine Plastik Aufbewahrungstasche mit Wasser - Dichtung und auf eine entleerte Heizblock Inkubator. Dies ermöglicht Mäusen nach Injektion zu erholen. </li><li> Füllen Sie ein biohazard Abfallbehälter mit 10% Bleichmittel auf eine angemessene Lautstärke zum Eintauchen des gesamten Abfalls aus diesem Verfahren. </li><li> Bereiten Sie eine kleine offene Schale mit 70% Ethanol und eine zweite Schüssel mit sterilisiert ddH2O Ort und in der biologischen Sicherheitswerkbank. </li><li> Sterilisieren ein 5μL Kapazität Hamilton-Spritze mit einer 33-Gauge-Nadel durch Besprühen Sie den Körper und die Nadel mit 70% Ethanol mit dem Kolben herausgezogen all the way. Immer wieder absaugen Ethanol aus der Schale und werfen Sie sie den ganzen Weg aus mindestens 5-mal. </li><li> Spülen Sie die Spritze Patrone durch Absaugen und Auswerfen sterilem Wasser mindestens 5-mal. Legen Spritze sicher beiseite in die Kultur Kapuze und trocknen lassen. </li><li> Entfernen Sie Virus Aktien von -80 ° C Gefrierschrank Lagerung und auf Eis stellen können Auftauen. Mikroinjektion erfordert 2μL Virus-Bestand pro Maus bei einem Titer von 10 9 infektiöse Einheiten / ml. Lentiviren können im Handel bezogen werden oder im Labor hergestellt nach dem etablierten Protokoll (Lois et al., 2002). </li><li> Bereiten Sie eine Injektion der Bühne, dass einem Bereich oberhalb der Motorhaube Oberfläche gehoben bietet - ein 10cm Kulturschale mit einem Blatt Kimwipe abgedeckt verwenden. </li><li> Vereinbaren Alkoholtupfern in der Nähe der Injektionsstelle entfernt. </li></ol> 2. Mikroinjektion von lentiviralen Partikeln in die olfaktorischen Epithel Alle tierischen Verfahren in dieser Methode durchgeführt werden nach IACUC genehmigten Richtlinien durchgeführt. Das Mus musculus Stammes C57BL/6J ist im Tiermodell in allen Versuchen verwendet hier gezeigt. <ol><li> Betäuben Maus Welpen durch Hypothermie, indem sie eine Maus pup (P0-P3) aus dem Käfig und setzen den Welpen auf einer aufgeschnittenen Handschuh auf Eis für 5 Minuten. </li><li> Während des Wartens auf den Welpen voll narkotisiert, absaugen 2μL von viralen Lager werden in der sterilisierten Hamilton-Spritze. </li><li> Platzieren Sie die Maus Welpe auf der Injektion der Bühne. Ziehen Haut weg von der Oberseite des Kopfes am Ohr in Richtung der Oberseite des Halses. Dies sollte ein gelehrt Hautoberfläche über die Nasenhöhle bieten und Injektion zu erleichtern. </li><li> Setzen Sie die Nadel durch den oberen Teil der Nasenhöhle ca. 3mm unter der Hautoberfläche auf die Riechschleimhaut erreichen. Microinject 0.5μL Virus-Lösung pro Schuss, der Wahl zwei Standorte pro Seite, links und rechts (vier Injektionen insgesamt pro Maus = 2μL des Virus erforderlich). Die Injektionsstelle sollte voneinander versetzt werden. Für die Ausrichtung der richtigen Injektionsstellen, Suche dorsalen Schädel Oberfläche für den Umriss der Riechkolben. Diese Linie ist kaum sichtbar bei der Geburt durch die semi-transluzente Haut und Schädel. Um zwei Injektionen pro Seite, Ziel einer Injektion nur rostral einer Lampe Umriß einer medialen Achse. Nehmen Sie die zweite Insertion lateral um die Birne skizzieren, aber achten Sie darauf, die Injektion medial, so dass Sie kann das olfaktorische Epithel, ventral liegt unterhalb der Lampe zu erreichen Winkel. Vermeiden Sie durchdringen den Riechkolben! </li><li> Trocken tupfen restliche Virus-Lösung oder Blut, das von der Injektionsstelle oder Nasenlöcher mit einem Kimwipe entweichen kann. Unmittelbar von Kimwipes verfügen in der verdünnten Lauge den geltenden Bestimmungen. </li><li> Legen Sie die injizierten Maus auf das Wasserbett Inkubator. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 1-4 für alle Mäuse injiziert werden, erinnern Sie über 2μL Virus-Bestand pro Maus benötigen. </li><li> Lassen Mäuse auf dem Wasserbett Inkubator für 30 Minuten erholen, bevor sie wieder in ihre ursprüngliche Verschachtelung Käfig. </li><li> Entsorgen Sie die Mikroinjektion Bühne, desinfizierende Tücher und keine zusätzlichen Reinigungs-Papier-Produkte in der Lauge biohazard Verfügung. </li><li> Reinigen Sie die Hamilton-Spritze durch mehrmaliges Ansaugen und Ausstoßen von Ethanol und dann mit Wasser, wie in der vorbereitenden Schritte getan. Lassen Sie die Spritze, um zu trocknen. </li><li> Für maximale Transduktionseffizienz wiederholen Sie diesen Vorgang wieder in 4 Stunden. Infizierte OSNs kann über die gesamte Länge der Zelle sichtbar gemacht werden, in nur drei Tagen. </li></ol> 3. Immunhistochemie von schwimmenden Riechkolben Abschnitte <ol><li> Sacrifice das injizierte Maus auf den gewünschten Zeitpunkt und Perfusion fix das Gewebe mit 4% Paraformaldehyd. Sezieren die OB. Inkubieren in Paraformaldehyd über Nacht und dann 30% Saccharose in PBS über Nacht. Embed in OCT Einbettmedium auf Trockeneis. </li><li> Koronare OB Abschnitte werden mit einer 60 um Dicke mit einem Kryostat erhalten. Sweep Glühbirne Abschnitte in einen 10cm Kulturschale mit 5 ml 1x PBS (pH 7,4). Die Schnitte werden schwimmend gehalten in PBS, um OAT d ermöglichenissolve. Transfer schwimmenden Abschnitte und PBS in ein 50ml-Fläschchen konisch. </li><li> Lassen Abschnitte auf den Grund des Fläschchens zu begleichen. Absaugen PBS ohne Ansaugen alle Abschnitte. Spülen Sie Gewebeschnitte mit 20ml PBS. Wiederholen Sie absetzen und Staubsaugen Schritte. Resuspendieren Gewebe mit 10 ml PBS und Transfer schwimmenden Abschnitte, um eine 15 ml konische Röhrchen für Immunfärbung. Sobald Gewebeschnitten niedergelassen haben, absaugen PBS Überstand ohne störende Gewebe. Resuspendieren Abschnitte mit 0,3% Triton X-100 in 1x PBS, pH 7,4 (PBS-Tx) ermöglicht Reinigungsmittel Zellmembranen zu perforieren. Inkubieren für 10 Minuten bei Raumtemperatur. Saugen Sie den Überstand und wiederholen Inkubation mit PBS-Tx zweimal. </li><li> Inkubieren Gewebeschnitte in 10 mL Blocking-Lösung (5% Pferdeserum in PBS-Tx) für zwei Stunden bei Raumtemperatur. </li><li> Spülen Blockierungslösung mindestens zweimal mit PBS-Tx für jeweils 15 Minuten bei Raumtemperatur. </li><li> Bereiten Sie 2 ml eines primären Antikörper-Lösung in PBS-Tx. Siehe Reagenzien und Geräte Abschnitt für Antikörper in diesem Experiment verwendet. </li><li> Ersetzen zweite PBS-Tx blockiert abwaschen mit primärer Antikörper-Lösung. Inkubieren auf einem langsam Wippschüttler (~ 30rpm) bei 4 ° C für 24-48 Stunden, um gründliche Eindringen in den 60 um schwebende Abschnitte zu gewährleisten. </li><li> Nach der Inkubation kann der primäre Antikörper-Lösung abgerufen vorsichtig mit einer Pipette und Lagerung bei 4 ° C für die Wiederverwendung von bis zu zwei weitere Male innerhalb von zwei Wochen ohne nennenswerten Verlust an Intensität der Färbung. </li><li> Wash Schnitte dreimal in PBS-Tx für 20 Minuten bei Raumtemperatur unter leichtem Drehen (~ 30rpm). </li><li> Bereiten Sie 2 ml des sekundären Antikörper-Verdünnung in PBS-Tx. Saugen Sie die letzte Waschung und fügen sekundären Antikörper-Lösung auf Gewebeschnitten. Wickeln Sie das außerhalb der Färbung Fläschchen in Aluminiumfolie ein, um Licht, das Fluorophor Ausbleichen führen kann blockieren. Legen Sie wickelte Durchstechflasche auf einer langsam Wippschüttler und inkubieren Sie bei 4 ° C über Nacht. </li><li> Discard sekundären Antikörper-Lösung durch Absaugen entfernt. Wash Abschnitte einmal mit PBS-Tx für jeweils 20 Minuten bei Raumtemperatur. Spülen Sie zwei weitere Male mit PBS (pH 7,4) für jeweils 20 Minuten bei Raumtemperatur. Montieren Sie die gefärbten Gewebeschnitten auf Glas-Objektträger mit Fluoromount G. </li><li> Bildschirm durch gefärbten Schnitten für positiv infizierten OSN Axone und Axon-Terminus mit einem Fluoreszenz-Mikroskop. </li><li> Zur Konstruktion eine dreidimensionale Ansicht eines markierten OSN Axon und Terminal-Laube, machen eine Reihe von optischen Schnitten durch die 60 um Tiefe des Ziels OB Gewebeschnitt (entlang der z-Achse) mit Hilfe der konfokalen Mikroskopie. </li><li> Dieser Stapel von Z-Abschnitt Bilder können anschließend gemeinsam projektiert werden, um eine 360 ​​° drehbaren Perspektive eines einzelnen markierten OSN Axon, einschließlich Terminal Laube Detail in allen ihren Teilen zu rekonstruieren. Jeder einzelne Drehwinkel erfasst und exportiert werden als Bilddatei (zB JPG, TIFF) für 2D-Format Präsentation. </li></ol> 4. Repräsentative Ergebnisse Mit der hier beschriebenen Methoden können wir Riechzellen durch Lentivirus in vivo transduzieren. Wir haben bisher visualisiert infiziert OSNs mit GFP und mCherry fluoreszierenden Reporter, als auch mit einem myc-Tag-Fusionsprotein über Immunzytochemie. Diese Technik bietet eine Fülle von infizierten OSNs. Dennoch tritt Transduktion sporadisch genug, um individuell beschriftet OSNs bieten, so dass für die Analyse der einzelnen Zelle Morphologie. Axone und Axon-Terminals sind in OB Gewebeschnitten inmitten ihrer natürlichen Umgebung durch konfokale Mikroskopie (Abbildung 1) abgebildet. Die gesamte OSN Axonterminal Laube kann in der Regel innerhalb einer 40-50 um optischen Schnitt begeistert sein. Hohe Vergrößerung der infizierten OSN Axonterminalen ermöglicht eine detaillierte Analyse der axonalen Laube Morphologie an der glomerulären Schicht. <img src="/files/ftp_upload/2951/2951fig1.jpg" /> Abbildung 1. Flugbahn der einzelnen Riechzelle Axon und seinen Anschluss Laube. A) A Frontalschnitt der Riechkolben einer P7-Maus, die den olfaktorischen Nerv Schicht (ONL) immungefärbt für OMP (rot) und der glomerulären Schicht (GL) immungefärbt sowohl mit OMP und VGLUT2 (grau). Ein einziger Riechzelle Axon, die GFP (grün) reist in den ONL und dringt in die glomeruläre Struktur. B) Die Axonterminal Laube Morphologie innerhalb der Glomerulus deutlich GFP-Expression hervorgehoben. VGLUT2 Co-Färbung in grau leuchtet die gesamte glomeruläre Bereich, in dem die GFP-positive Axon erarbeitet ein Terminal Abtreibung. C) Lentivirale infiziert OSNs, die GFP (grün) in der OE. Die cytostructure des olfaktorischen Epithels ist mit DAPI-Färbung (blau dargestellt). GFP-Expression ermöglicht die Visualisierung von OSN Zellkörper und ihre zelluläre Prozesse in der OE. D) Ein OSN Axon und seinen Anschluss Morphologie mit Rap1GAP2 Ausdruck knock-down von shRNA. Lentiviren tragen eine doppelte Expressionskassette mit Rap1GAP2 shRNA unter der Maus U6-Promotor und GFP unter einemCMV-Promotor wurden die OE angewendet. Infizierte olfaktorischen Axonterminalen zeigte einen vereinfachten Anschluss Laube, wenn der der GFP nur Kontrolle verglichen. Bar = 20 um.

<ol><li>Chen, H., Kohno, K., Gong, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+ablation+of+mature+olfactory+sensory+neurons+mediated+by+diphtheria+toxin+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurocytol%22%5BJournal%5D)">Conditional ablation of mature olfactory sensory neurons mediated by diphtheria toxin receptor.</a> J Neurocytol. 34, 1-2 (2005).</li>
<li>Doi, K., Nibu, K., Ishida, H., Okado, H., Terashima, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenovirus-mediated+gene+transfer+in+olfactory+epithelium+and+olfactory+bulb%3A+a+long-term+study%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Otol+Rhinol+Laryngol%22%5BJournal%5D)">Adenovirus-mediated gene transfer in olfactory epithelium and olfactory bulb: a long-term study.</a> Ann Otol Rhinol Laryngol. 114, 629-633 (2005).</li>
<li>Lois, C., Hong, E. J., Pease, S., Brown, E. J., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germline+transmission+and+tissue-specific+expression+of+transgenes+delivered+by+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Germline transmission and tissue-specific expression of transgenes delivered by lentiviral vectors.</a> Science. 295, 868-872 (2002).</li>
<li>Zhao, H., Otaki, J. M., Firestein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenovirus-mediated+gene+transfer+in+olfactory+neurons+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Adenovirus-mediated gene transfer in olfactory neurons in vivo.</a> J Neurobiol. 30, 521-530 (1996).</li>
</ol>

Dieses Protokoll ist bio-Sicherheitsstufe 2 konform. Alle geeigneten Arbeitsplatz, persönliche Schutzausrüstung und virale Abfallstoffe Maßnahmen wurden entsprechend eingerichtet. Alle tierischen Verfahren wurden nach IACUC Leitlinien durchgeführt.

Mikroinjektion von Lentivirus führt zu einer dauerhaften Übertragung von Gen-Konstrukten in OSN genomischer DNA. Dieser Ansatz ermöglicht es uns, kurzfristige oder langfristige Manipulationen von Kandidatengenen über Überexpression oder shRNA vermittelten knock-down durchzuführen. Darüber hinaus können wir Fluoreszenz-Label einzigen OSNs in eine vorhandene transgene Maus Linie Co-Lokalisation von Geruchsrezeptoren Populationen zu beobachten. Mikroinjektion ist für lentivirale Transduktion OSNs erforderlich. Wir haben ve...

Mikroinjektion: Neugeborene Mäuse wurden mikroinjiziert mit einem 5μL Hamilton-Spritze (Hamilton # 7647-01) mit einer 33-Gauge-Nadel (Hamilton # 7762-06) ausgestattet. Immunocytochemistry Reagenzien: Primärantikörper: polyklonalen Kaninchen-Antikörper GFP (Molecular Probes # A-6455), Huhn polyklonalen Antikörper gegen OMP (custom) (Chen et al, 2005.), Meerschweinchen polyklonalen Antikörpers gegen VGLUT2 (Millipore # AB2251). Sekundärantikörper: Cy2-konjugierten Esel-anti-Kaninchen (Jackson Immunolab # 711-225-152), Cy3-konjugierten Esel-anti-Huhn (Jackson Immunolab # 703-165-155) und Cy5-konjugierten Ziege anti-Meerschweinchen (Jackson Immunolab # 106-175-008). Die Schnitte wurden auf Glasplättchen mit Fluoromount G (Southern Biotech # 0010-01) mit 50ng/mL DAPI Chromatin Färbelösung montiert. Konfokale Bildgebung: Z-Stapel-Aufnahmen wurden mit einer Olympus Flouview FV1000 konfokalen Mikroskop und Bilder gesammelt und in 3D-Projektionen mit Olympus FV10-ASW 2,01 konfokale Erfassung und Analyse-Software verarbeitet.

lentivirus-vermittelte gen-manipulation und visualisierung von riechzellen in vivo</em

Lentivirus-mediated Genetic Manipulation and Visualization of Olfactory Sensory Neurons in vivo

Entwicklung eines präzisen olfaktorischen Schaltung basiert auf präzisen Projektion Riechzelle (OSN) Axone ihre synaptischen Ziele im Riechkolben (OB). Die molekularen Mechanismen der OSN Axonwachstum und Targeting sind nicht gut verstanden. Manipulation der Genexpression und die anschließende Visualisierung der einzelnen OSN Axone und deren Terminal Laube Morphologie haben bislang eine Herausforderung. Zur Untersuchung der Genfunktion in der einzelnen Zelle Ebene innerhalb eines bestimmten Zeitrahmens, entwickelten wir eine lentivirale basierende Technik, um die Genexpression in OSNs in vivo zu manipulieren. Lentivirale Partikel werden OSNs durch Mikroinjektion in die olfaktorischen Epithels (OE) geliefert. Expressionskassetten sind dann permanent in das Genom der transduzierten OSNs integriert. Das grün fluoreszierende Protein-Expression identifiziert infiziert OSNs und skizziert ihre gesamte Morphologie, einschließlich der Axonterminal Laube. Aufgrund der kurzen Zeitspanne zwischen Mikroinjektion und Reporter-Erkennung kann Genfunktion Studien in einem sehr engen Zeitraum der Entwicklung konzentrieren. Mit dieser Methode haben wir die GFP-Expression innerhalb von nur 3 Tage erkannt und so lange wie 3 Monate nach der Injektion. Wir haben sowohl Überexpression und shRNA vermittelten knock-down von lentiviralen Mikroinjektion erreicht. Diese Methode liefert detaillierte Morphologien der OSN Zellkörper und Axone an der einzelnen Zelle Ebene in vivo, und ermöglicht damit die Charakterisierung der Kandidaten-Gen-Funktion während olfaktorischen Entwicklung.

Wir präsentieren einen lentiviralen Technik zur genetischen Manipulation und Visualisierung von einzelnen Riechzelle Axon und seine Endverzweigung<em&gt; In vivo</em&gt;.

Lentivirus-vermittelte Gen-Manipulation und Visualisierung von Riechzellen In vivo</em

Die Entwicklung eines präzisen olfaktorischen Schaltkreises beruht auf der genauen Projektion von Axonen olfaktorischer Sinnesneuronen (OSN) zu ihren synaptischen Zielgebieten in den ...

Eine der Herausforderungen bei der Erforschung der Entwicklung in der Neurowissenschaft besteht darin, die dendritischen und axonalen Morphologien auf Ebene einzelner Zellen in vivo zu erfassen. Im Geruchssystem verlängern olfaktorische Sinnesneuronen ihre Axone vom olfaktorischen Epithel in der Nase bis zum Riechkolben im Gehirn. Während mehrere olfaktorische Sinnesneuronen in Richtung des Riechkolbens projizieren, bündeln sie sich zu Faszikeln. Dies erschwert die Untersuchung individueller Axonverläufe und ihrer terminalen Morphologien. Wir haben eine Methode entwickelt, um einzelne olfaktorische Sinnesneuronen in vivo durch Mikroinjektion eines GFP-Konstrukts mit lentiviralem Träger sichtbar zu machen.Eine erfolgreiche Transduktion mit Lentivirus leuchtet die gesamte Länge des olfaktorischen sensorischen Axons einschließlich der terminalen Verzweigung auf. Neben der Visualisierung einzelner olfaktorischer sensorischer Neuronen ermöglicht diese Methode uns, die Genexpression eines bestimmten Gens von Interesse zu manipulieren, um dessen Funktion in einem in-vivo-Kontext zu untersuchen. Dieses Lentivirus-Verfahren erfordert Biosicherheitsstufe zwei und muss in einer laminarer Luftströmung gewährleistenden Sicherheitswerkbank durchgeführt werden.Um eine sterile Umgebung aufrechtzuerhalten, besprühen Sie im Sicherheitswerkbank alles, was hineingelegt wird, mit 70 %igem Ethanol, bereiten Sie einen 37-Grad-Wasserbett mindestens 20 Minuten vor der Injektion vor und heizen Sie ihn vor. Verschließen Sie eine halb mit Wasser gefüllte Plastiklagerungsbeutel und stellen Sie sie auf einen leeren Heizblockinkubator.Dadurch können sich die Mäuse nach der Injektion erholen. Füllen Sie einen Bioabfallbehälter mit 10%iger Bleiche, um alle mit Virus in Kontakt gekommenen Materialien zu desinfizieren. Bereiten Sie im Rahmen dieses Verfahrens eine kleine offene Schale mit 70%igem Ethanol und eine zweite Schale mit steriler destillierter Wasser vor.Unter einer laminaren Luftströmungshaube verwenden wir eine Hamilton-Spritze mit einem Fassungsvermögen von fünf Mikrolitern und einer Nadel der Größe 33. Bei diesem speziellen Modell lässt sich der Kolbenwiderstand durch Drehen eines Spannungsreglers an der Oberseite der Kolbenkammer einstellen. Diese Funktion ermöglicht die Kontrolle des Mikroinjektionsvolumens und die Sterilisation der Nadel sowie der Spritzenkammer.Aspirieren und spritzen Sie Ethanol mehrmals wiederholt aus der Schale. Spülen Sie die Spritzenkartusche, indem Sie mehrmals steriles Wasser ansaugen und abstoßen. Stellen Sie die Spritze sicher in der Flusshaube beiseite.Stellen Sie Alkoholtücher in der Nähe der Injektionsstation bereit. Bereiten Sie einen Injektionsplatz vor, der eine erhöhte Oberfläche bietet und die Positionierung der Maus erleichtert. Dazu kann eine umgedrehte 10 cm große Kulturschale verwendet werden, die mit Kim-Tüchern bedeckt ist.Mäusewelpen können bis zum Absetzalter durch Hypothermie anästhesiert werden. Schneiden Sie einen Finger aus einem Gummihandschuh aus und legen Sie den Mäusewelpen in den ausgeschnittenen Fingerteil. Anschließend fünf Minuten lang auf Eis legen.Der Handschuh verhindert Hautverbrennungen, die durch direkten Hautkontakt mit dem Eis entstehen würden. Führen Sie einen Test zur vollständigen Anästhesie durch, indem Sie die Hinter- und Vorderpfoten des Welpen zwicken, um sicherzustellen, dass das Tier nicht reagiert. Nun sind wir bereit für die Mikroinjektion von Lentivirus. Wir werden dies an einem neugeborenen Welpen demonstrieren.Wenn ein älteres Mausalter verwendet wird, sollte man die Nadel mit 33er Gauge durch eine dickere Nadel ersetzen, um die Schädeloberfläche durchdringen zu können. Desinfizieren Sie die Nasenoberfläche der Maus, indem Sie sie mit einem Alkoholtupfer abwischen. Entnehmen Sie die Lentivirus-Stämme aus der Gefrierspeicherung und tauchen Sie sie auf Eis auf. Wir haben Lentivirus im Labor selbst mithilfe etablierter Methoden hergestellt. Bei der Entwicklung dieser Methode haben wir festgestellt, dass ein minimaler viraler Titer von 10 hoch neun infektiösen Einheiten pro Milliliter für eine gute Transduktionsrate erforderlich ist. Aspirieren Sie zwei Mikroliter der Lentivirus-Stammlösung in die sterilisierte Hamilton-Spritze.Platzieren Sie das Mäusejunge auf der Injektionsplattform. Greifen Sie die Haut an der Kopfoberseite an den Ohren und ziehen Sie sie sanft zurück. Unsere Flusswerkbank ist mit einem Stereomikroskop ausgestattet.Um Mikroinjektionen präzise zu führen, suchen Sie auf der dorsalen Schädeloberfläche im Bereich des Vorderhirns nach dem Umriss der Riechbülbe. Unsere Mikroinjektionsziele liegen dicht um die Riechbülbe herum, sollten diese jedoch nicht einbeziehen. Wir führen vier Injektionen in das Riechepithel jedes Welpen durch.Diese mit blauen Punkten markierten Positionen erfordern, dass die Nadel in einem nach medial gerichteten Winkel eingeführt wird. Die zusätzlichen zwei Injektionen, die mit grünen Punkten dargestellt sind, sind versetzt, weiter medial und anterior zum Riechkolben angeordnet. Diese Injektionen können schräg erfolgen.Die Empfehlungen zur Nadelposition berücksichtigen die ventrale Lage des Riechepithels, das sich hauptsächlich unterhalb des Bulbus olfactorius befindet. Ein senkrechter Zugang ist daher eingeschränkt. Führen Sie die Nadel etwa drei Millimeter unterhalb der Hautoberfläche durch die Oberseite der Nasenhöhle ein.Um das Riechepithel zu erreichen. Eine geübte Hand sollte den Widerstandsabfall spüren, wenn der luminalen Raum der Nasenhöhle erreicht ist. Dieser Bereich sollte vermieden werden.Injizieren Sie 0,5 µL Virus-Stammlösung pro Position. Wählen Sie erneut zwei Stellen pro Seite, sowohl links als auch rechts, insgesamt vier Injektionen mit jeweils 0,5 µL. Dies entspricht insgesamt 2 µL Virus pro Maus in einer einzelnen Injektionssitzung.Auch hier vorsichtig sein, um nicht den Geruchsbullen-Blot trocken zu injizieren, da eventuell verbleibende Viruslösung oder Blut aus der Injektionsstelle oder den Nasenöffnungen austreten kann. Mit einem Ethanol-Tupfer die benutzten Tupfer im verdünnten, gebleichten Flüssigkeitsbehälter entsorgen und die injizierte Maus unverzüglich auf den Wasserbett-Inkubator zur Erholung legen. Die Nadel und Spritze durch Wiederholung des Sterilisationsverfahrens, das während der Vorbereitung durchgeführt wurde, desinfizieren. Injizierte Mäuse können 30 Minuten nach der Erholung auf dem Wasserbett-Inkubator in ihren Käfig zurückgebracht werden.Diese gesamte Mikroinjektion kann nach vier Stunden erneut durchgeführt werden. Wenn Sie die Anzahl der olfaktorischen Sinnesneuronen erhöhen möchten, die infiziert werden sollen, können infizierte olfaktorische Sinnesneuronen bereits nach wenigen Tagen über die gesamte Länge des Zells entlang verfolgt werden. Die Tiere werden zum gewünschten Zeitpunkt getötet und zur Beobachtung perfundiert.Mithilfe standardisierter Methoden präparieren und schneiden wir die Riechbülbe koronal mit einer Dicke von 60 Mikrometer, um transduzierte Einzelzell-Riechsinnesneuronen-Trajektorien und Axonendigungen sichtbar zu machen. Der Schnittabschnitt enthält somit alle Zellschichten der Riechbülbe, einschließlich der Axonbündel der Riechsinnesneuronen und der Axonendigungen, die in glomerulären Strukturen synaptisch verbinden, die an der Oberfläche der Bülbe gebunden sind, vorbereitend für die Schwimm-Immunhistochemie. Es werden serielle Schnitte der Riechbülbe angefertigt und gemeinsam in eine 10 Zentimeter große Kulturschale mit fünf Milliliter phosphatgepufferter Kochsalzlösung überführt.Überführen Sie die schwimmenden Schnitte in ein kegelförmiges 50-Milliliter-Gefäß. Sobald die Schnitte am Boden des Gefäßes abgesetzt haben, saugen Sie die phosphatgepufferte Kochsalzlösung vorsichtig ab. Achten Sie darauf, die Schnitte nicht mit abzusaugen.Ihre Schnitte werden mit 10 Milliliter frischem Puffer aufgefüllt, um jeglichen Restfixator oder Einbettungsmaterial zu entfernen. Pipettieren Sie diese Suspension unverzüglich in ein kegelförmiges 15-Milliliter-Gefäß und achten Sie darauf, alle schwimmenden Schnitte aufzufangen. Saugen Sie die Spüllösung ab und permeabilisieren Sie die Schnitte mit einer Lösung von 0,3 % Triton X-100 in Phosphat-gepufferter Salzlösung, die 10 Minuten lang auf einer Rüttelplattform steht. Anschließend können Sie bei Raumtemperatur einen standardmäßigen Immunfärbeprotokoll im selben kegelförmigen Gefäß durchführen, wobei Sie die Schritte zum Absaugen und Rütteln nach Bedarf für dieses Gefäßvolumen wiederholen und ein Volumen von 10 Milliliter für die Färbungs- und Spülschritte beibehalten.Hier ist eine Liste der Antikörper, die wir zur gleichzeitigen Färbung positiv transduzierter olfaktorischer Sinnesneuronen und der allgemeinen Population olfaktorischer Sinnesneuronen verwenden. Um eine gründliche Penetration der Antikörper in die 60 µm dicken Bulbusschnitte zu gewährleisten, wird eine Inkubation über Nacht bei vier Grad Celsius empfohlen. Auch die Waschdurchführung sollte jeweils nicht kürzer als 20 Minuten sein.Verteilen Sie jeden Schnitt vorsichtig mit einem Pinsel auf einem Objektträger und decken Sie jeden Objektträger mit Flora Mount-G, ergänzt durch eine Chromatin-Anfärbungslösung, ab. Bemühen Sie sich, alle Blasen aus dem Einbettungsmedium zu entfernen. Bringen Sie Ihre Schnitte in Reihen an, um den anschließenden Screening-Schritt zu vereinfachen.Scannen Sie diese Schichten Ihrer immunohistologisch gefärbten Bulbus-Schnitte nach GFP-positiven Axonfasern und -endigungen. Mit einem Fluoreszenzmikroskop können anschließend positiv infizierte Nervenendigungen mittels konfokaler Mikroskopie abgebildet werden. Es ist hilfreich, die Fokusebene in Ihrem Bereich von Interesse anhand der DPI- und Olfactory-Marker-Protein-Kanäle zu kalibrieren.Diese Ergebnisse zeigen eine einzelne Axonfaser und Axonendigung eines olfaktorischen Sinnesneurons innerhalb des Glomerulus, das mit olfaktorischem Markerprotein in Rot und vlu zwei in Grau gefärbt ist; infizierte Zellkörper olfaktorischer Sinnesneuronen sowie deren dendritische Knöpfchen können zudem im olfaktorischen Epithel sichtbar gemacht werden, sofern dieses Gewebe in die Dissektion und Immunfärbungsschritte einbezogen wurde. Meine konfokale Projektion liefert uns eine äußerst detaillierte Morphologie des axonalen Verlaufs und der terminalen Verzweigung eines einzelnen olfaktorischen Sinnesneurons. Man kann erkennen, wie sich die Axonfaser zurück zu ihrem glomerulären Ziel krümmt, sowie die Details ihres Verzweigungsmusters innerhalb des glomerulären Neuropils.Die lentivirale Mikroinjektionsmethode ermöglicht die Visualisierung einzelner axonaler Zellen, die Morphologie olfaktorischer Sinnesneuronen sowie Untersuchungen zur gezielten Manipulation der Genexpression. Die Lentivirus-Transduktion führt zu einer stabilen genomischen Integration der Konstrukte. Lentiviren infizieren benachbarte Zellen nicht transsynaptisch. Die Visualisierung kann bereits nach nur drei Tagen erreicht werden und hält nachweislich mindestens drei Monate an, vermutlich sogar noch länger.Riechsinneszellen lassen sich durch nasale Infusion einer Lentiviren-Lösung nicht leicht infizieren. Daher ist in diesem Verfahren eine Mikroinjektion durch die Oberfläche erforderlich. Das ist also unser Verfahren zur Lentiviren-Mikroinjektion.Ich hoffe, Sie haben alle diese Informationen als nützlich empfunden, um eigene Einzelzell-Morphologien zu erzielen. Viel Erfolg bei der Suche.

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Forschung

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Neurowissenschaften

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Wir beschreiben ein Protokoll für die in vivo-Markierung von olfaktorischen sensorischen Neuronen durch Elektroporation und anschließende konfokale Laser-Scanning- oder Multiphotonenmikroskopie, um die neuronale Morphologie und ihre Entwicklung im Laufe der Zeit zu visualisieren.

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Intraspinal Injektion von Rekombinase abhängigen recombinant Adeno-assoziierte Virus (rAAV) kann verwendet werden, um jeden genetisch gekennzeichneten Zelltyp im Rückenmark zu manipulieren. Hier beschreiben wir, wie Neuronen im Hinterhorn des Rückenmarks lumbale transduzieren. Diese Technik ermöglicht funktionale Verhör des Subtyps manipulierten Neuron.

Adeno-assoziierten Virus-vermittelten Transgene Ausdruck in genetisch definierten Nervenzellen des Rückenmarks

Das aktuelle Protokoll demonstriert eine einfache Methode zur Rückverfolgung von ventralen Tegmentalflächen (VTA) Glutamatprojektionen auf den Hippocampus. Die Photostimulation von VTA-Glutamat-Neuronen wurde mit CA1-Aufnahmen kombiniert, um zu zeigen, wie VTA-Glutamat-Terminals die mutmaßliche pyramidale CA1-Feuerrate in vivo modulieren.

Kombinierte in vivo anatomische und funktionelle Spurensuche von ventralen Tegmentalflächen-Glutamat-Terminals im Hippocampus

Hier stellen wir ein Protokoll vor, das die virale Transduktion diskreter Hirnregionen mit optogenetischen Konstrukten beschreibt, um eine synapsenspezifische elektrophysiologische Charakterisierung in akuten Nagetierhirnschnitten zu ermöglichen.

Ex vivo Optogenetische Befragung der synaptischen Übertragung und Plastizität über große Entfernungen vom medialen präfrontalen Kortex zum lateralen entohinalen Kortex

Wir beschreiben hier Methoden zur Induktion und Analyse des olfaktorischen erfahrungsabhängigen Umbaus von synaptischen Glomeruli des Antennenlappens im juvenilen Gehirn von Drosophila .

Erfahrungsabhängiger Umbau der synaptischen Konnektivität von olfaktorischen sensorischen Neuronen im juvenilen Gehirn in einer kritischen Phase im frühen Leben

Lernen Sie eine lentivirale Methode zur Genmanipulation und Visualisierung einzelner olfaktorischer Sensorneuronen in vivo. Diese Technik ermöglicht die detaillierte Analyse von Axontrajektorien und terminalen Arborisationen im komplexen olfaktorischen System.

Lentivirus-vermittelte Gen-Manipulation und Visualisierung von Riechzellen In vivo

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