Lentivirus-vermittelte Gen-Manipulation und Visualisierung von Riechzellen In vivo

Eine der Herausforderungen bei der Erforschung der Entwicklung in den Neurowissenschaften besteht darin, dendritische und axonale Morphologien auf Einzelzellebene in vivo zu erfassen. Im olfaktorischen System erstrecken olfaktorische sensorische Neuronen ihre Axone vom Riechepithel in der Nase bis zum Riechkolben im Gehirn. Wenn mehrere olfaktorische sensorische Neuronen in Richtung des Riechkolbens projizieren, fasziieren sie zu Bündeln.

Dies erschwert die Untersuchung einzelner Axontrajektorien und ihrer terminalen Morphologien. Wir haben eine Methode entwickelt, um einzelne olfaktorische sensorische Neuronen in vivo durch Mikroinjektion eines GFP-Konstrukts sichtbar zu machen. Trägt Lentivirus.

Die erfolgreiche Transduktion mit dem Lentivirus beleuchtet die gesamte olfaktorische sensorische Axonlänge, einschließlich des terminalen Dorns. Neben der Visualisierung einzelner olfaktorischer sensorischer Neuronen ermöglicht uns diese Methode, die Genexpression eines bestimmten Gens von Interesse zu manipulieren, um seine Funktion in einem In-vivo-Kontext zu untersuchen. Dieses Lentivirus-Verfahren ist Biosicherheitsstufe zwei und muss in einer Laminar-Flow-Haube durchgeführt werden.

Um eine sterile Umgebung zu erhalten, sprühen Sie alles, was in die Haube eingeführt wird, mit 70% Ethanol in die Haube, bereiten Sie ein 37-Grad-Wasserbett vor und heizen Sie es mindestens 20 Minuten lang vor. Vor der Injektion. Verschließen Sie einen Plastikbeutel, der zur Hälfte mit Wasser gefüllt ist, und stellen Sie ihn auf einen leeren Heizblock-Inkubator.

Dies ermöglicht es den Mäusen, sich nach der Injektion zu erholen. Füllen Sie einen Behälter für biologisch gefährliche Abfälle mit 10 % Bleichmittel, um sämtliches virenexponiertes Material zu dekontaminieren. Bereiten Sie nach diesem Verfahren eine kleine offene Schale mit 70 % Ethanol und eine zweite Schale mit sterilem destilliertem Wasser vor.

In einer Laminar-Flow-Haube verwenden wir eine Hamilton-Spritze mit einem Fassungsvermögen von fünf Mikrolitern und einer 33-Gauge-Nadel. Bei diesem speziellen Modell können Sie den Stößelwiderstand einstellen, indem Sie an einem Spannungsregler drehen, der sich oben an der Kolbenkammer befindet. Diese Funktion ermöglicht eine Volumenregelung für Mikroinjektionen, um die Nadel- und Spritzenkammer zu sterilisieren.

Wiederholen Sie das Ansaugen und Ausstoßen von Ethanol mehrmals aus der Schale. Spülen Sie die Spritzenpatrone aus, indem Sie steriles Wasser mehrmals ein- und ausstoßen. Legen Sie die Spritze sicher zur Seite in die Durchflusshaube.

Ordnen Sie Alkoholtupfer in der Nähe der Injektionsstation an. Bereiten Sie eine Injektionsstufe vor, die eine erhöhte Oberfläche bietet, die die Positionierung der Maus erleichtert. Man kann eine umgedrehte 10 Zentimeter große Kulturschale verwenden, die mit Kim-Tüchern bedeckt ist.

Mäusebabys können bis zum Entwöhnungsalter durch Unterkühlung betäubt werden. Schneiden Sie einen Finger eines Gummihandschuhs aus und legen Sie das Mausjungtier in den Fingerschnitt. Dann fünf Minuten auf Eis legen.

Der Handschuh verhindert Hautverbrennungen, die bei direktem Hautkontakt mit dem Eistest für eine gründliche Anästhesie auftreten würden, indem er die Hinterhand und die vier Füße des Welpen einklemmt, um sicherzustellen, dass das Tier nicht reagiert. Wir sind jetzt bereit für die Mikroinjektion von Lentiviren. Wir werden es mit einem neugeborenen Welpen vorführen.

Wenn eine ältere Maus verwendet wird, sollte man die 33-Gauge-Nadel durch eine dickere Nadel ersetzen, um die Schädeloberfläche zu durchdringen. Sterilisieren Sie die Nasenoberfläche der Maus, indem Sie sie mit einem Alkoholpad abwischen. Lentivirus-Stämme aus dem Gefrierschrank nehmen und auf Eis auftauen.

Wir haben Lentiviren selbst im Labor nach etablierten Methoden hergestellt. Bei der Entwicklung dieser Methode haben wir festgestellt, dass ein minimaler Virustiter von 10 bis zur neunten infektiösen Einheit pro Monat für eine gute Transduktionsrate erforderlich ist. Aspirieren Sie zwei Mikroliter Lentivirus-Stammlösung in die sterilisierte Hamilton-Spritze.

Platzieren Sie das Maus-Welpen auf der Injektionsstufe. Fassen Sie die Haut auf dem Oberkopf an den Ohren und ziehen Sie sie vorsichtig zurück. Wir haben unsere Strömungshaube mit einem Präparierfernrohr ausgestattet.

Um Mikroinjektionen genau zu steuern, suchen Sie die dorsale Schädeloberfläche am Vorderhirn nach einem Umriss des Riechkolbens ab. Unsere Mikroinjektionsziele umgeben den Riechkolben eng, sollten aber nicht den Kolben selbst umfassen. Wir geben jedem Welpen vier Injektionen in das olfaktorische Epithel.

Diese Positionen, die mit blauen Punkten dargestellt werden, erfordern, dass die Nadel in einem nach medial gerichteten Winkel eingeführt wird. Die beiden zusätzlichen Injektionen, die mit grünen Punkten dargestellt sind, sind gestaffelt, mehr medial und anterior zum Riechkolben. Diese Injektionen können hätschbar abgewinkelt werden.

Die Vorschläge für die Nadelwinkel werden unter Berücksichtigung der ventralen Positionierung des Riechepithels gemacht, das sich meist unter dem Riechkolben befindet. Der senkrechte Zugang ist somit eingeschränkt. Führen Sie die Nadel etwa drei Millimeter unterhalb der Hautoberfläche durch die Oberseite der Nasenhöhle ein.

Um das olfaktorische Epithel zu erreichen. Eine trainierte Hand sollte den Abfall des Widerstands spüren, wenn der luminale Raum der Nasenhöhle erreicht ist. Dieser Bereich sollte gemieden werden.

Mikroinjizieren Sie 0,5 Mikroliter Virusstammlösung pro Position. Auch hier wurden zwei Stellen pro Seite gewählt, sowohl links als auch rechts, vier Injektionen von insgesamt 0,5 Mikrolitern. Jeder pro Maus bedeutet zwei Mikroliter Virus, die pro Maus in einer einzigen Injektionssitzung benötigt werden.

Achten Sie auch hier darauf, den Riechkolbentupfer nicht trocken zu injizieren und keine Viruslösung oder Blut zu trocknen, das aus der Injektionsstelle oder den Nasenlochöffnungen austreten könnte. Entsorgen Sie die Tücher mit einem Ethanoltuch in dem verdünnten flüssiggebleichten Behälter und legen Sie die injizierte Maus sofort zur Wiederherstellung auf den Wasserbett-Inkubator. Dekontaminieren Sie die Nadelspritze durch Wiederholung des während der Vorbereitung durchgeführten Sterilisationsvorgangs. Injizierte Mäuse können 30 Minuten nach der Genesung im Wasserbett-Inkubator in ihren Käfig zurückgebracht werden.

Diese gesamte Mikroinjektion kann in vier Stunden erneut wiederholt werden. Wenn Sie die Anzahl der olfaktorischen sensorischen Neuronen erhöhen möchten, die infiziert werden, können infizierte olfaktorische sensorische Neuronen in nur drei Tagen über die gesamte Länge der Zelle sichtbar gemacht werden. Die Tiere wurden zum gewünschten Zeitpunkt zur Beobachtung geopfert und perfundiert.

Mit Standardmethoden Um transduzierte einzellige olfaktorische sensorische Neuronentrajektorien und Axontermini sichtbar zu machen, präparieren und schneiden wir den Riechkolben koronal bei einer Dicke von 60 Mikrometern. Der Schnitt wird somit alle Zellschichten des Riechkolbens enthalten, einschließlich der olfaktorischen sensorischen Neuronenaxonbündel und der Axonendigungen, die in glomerulären Strukturen synapsieren, die an der Oberfläche des Bulbus gebunden sind, um die schwebende Immunhistochemie vorzubereiten. Serielle Schnitte des Riechkolbens werden hergestellt und gemeinsam in eine 10 Zentimeter große Kulturschale mit fünf Millilitern phosphatgepufferter Kochsalzlösung gespült.

Übertragen Sie die schwimmenden Abschnitte in ein konisches 50-Milliliter-Fläschchen. Sobald sich die Abschnitte am Boden des Fläschchens abgesetzt haben, wird die phosphatgepufferte Kochsalzlösung abgesaugt. Achten Sie darauf, dass Sie nicht aufsaugen.

Ihre Abschnitte werden mit 10 Millilitern frischem Puffer aufgefüllt, um restliches Fixiermittel oder Einbettmaterial wegzuspülen. Pipettieren Sie diese Resuspension sofort in ein konisches 15-Milliliter-Fläschchen, achten Sie darauf, alle schwimmenden Abschnitte zu erfassen, die Spüllösung abzusaugen und die Abschnitte mit einer Lösung von 0,3 % Triton X 100 in Phosphatpuffer-Kochsalzlösung zu perforieren, und stellen Sie sie für 10 Minuten auf eine Wippplattform. Bei Raumtemperatur können Sie dann ein Standard-Immunfärbeprotokoll in demselben konischen Fläschchen durchlaufen, wobei Sie die Vakuum- und Wippschritte wiederholen, wie es für dieses Gefäß erforderlich ist, und ein Volumen von 10 Millilitern für die Färbe- und Spülschritte beibehalten.

Hier ist eine Liste von Antikörpern, die wir verwenden, um positiv transduzierte olfaktorische sensorische Neuronen und die allgemeine olfaktorische sensorische Neuronenpopulation zu färben. Für eine gründliche Antikörperpenetration der 60-Mikron-Bulbenschnitte wird empfohlen, über Nacht bei vier Grad Celsius zu inkubieren. Die Waschtiefe sollte ebenfalls nicht kürzer als jeweils 20 Minuten sein.

Verteilen Sie jeden Abschnitt vorsichtig mit einem Pinsel auf einem Objektträger, jeder Objektträger mit flora Mount G, ergänzt mit Chromatin-Fleckenlösung. Bemühen Sie sich, alle Blasen vom Einbettmedium zu entfernen. Montieren Sie Ihre Profile in Reihen, um den nachfolgenden Siebschritt zu vereinfachen.

Scannen Sie diese Schichten auf Ihren Immunfleck-Kolbenschnitten auf die GFP-positiven Axonfasern und -termini. Mit einem Fluoreszenzmikroskop können dann positiv infizierte Nervenendigungen durch Konfokalmikroskopie abgebildet werden. Es ist hilfreich, die Fokusebene in Ihrem Interessengebiet mithilfe der DPI- und olfaktorischen Markerproteinkanäle zu kalibrieren.

Diese Ergebnisse zeigen, dass eine einzelne olfaktorische Sensorneuron-Axonfaser und ein Axonterminal innerhalb des Glomerulus, das CO mit olfaktorischem Markerprotein in rot und vlu ist, zwei in grau infizierten olfaktorischen Sensorneuronenzellkörpern und deren dendritischer Knopf auch im olfaktorischen Epithel sichtbar gemacht werden können, wenn dieses Gewebe in die Dissektions- und Immunfärbeschritte einbezogen wurde. Hallo, meine konfokale Projektion liefert uns eine sehr detaillierte Morphologie eines einzelnen olfaktorischen sensorischen Neurons, eines axonalen Ausdehnungspfads und einer terminalen Dorn. Man kann das Einhaken der Axonfaser zurück in Richtung ihres glomerulären Ziels sehen, sowie die Details ihres Verzweigungsmusters innerhalb der glomerulären Neuropille.

Die lentivirale Mikroinjektionsmethode ermöglicht die Visualisierung von Einzelzellaxonen, Morphologien olfaktorischer sensorischer Neuronen und ermöglicht Studien, die die Genexpression manipulieren, die Lentivirus-Transduktion führt zu einer stabilen genomischen Integration von Konstrukten. Das Lentivirus infiziert benachbarte Zellen nicht transsynaptisch. Die Visualisierung kann in nur drei Tagen erreicht werden und es wurde bestätigt, dass sie mindestens drei Monate dauert und wahrscheinlich über längere Zeiträume anhält.

Geruchssinnige sensorische Neuronen werden nicht ohne weiteres durch eine nasale Infusion von Lentivirus-Lösung infiziert. Daher ist bei diesem Verfahren eine Mikroinjektion durch die Oberfläche erforderlich. Das ist also unser Lentivirus-Mikroinjektionsverfahren.

Ich hoffe, Sie haben all diese Informationen nützlich gefunden, um Einzelzellmorphologien Ihrer eigenen Happy Hunting zu erzielen.