Lentivirus-vermittelte Gen-Manipulation und Visualisierung von Riechzellen In vivo

Eine der Herausforderungen bei der Erforschung der Entwicklung in der Neurowissenschaft besteht darin, die dendritischen und axonalen Morphologien auf Ebene einzelner Zellen in vivo zu erfassen. Im Geruchssystem verlängern olfaktorische Sinnesneuronen ihre Axone vom olfaktorischen Epithel in der Nase bis zum Riechkolben im Gehirn. Während mehrere olfaktorische Sinnesneuronen in Richtung des Riechkolbens projizieren, bündeln sie sich zu Faszikeln.

Dies erschwert die Untersuchung individueller Axonverläufe und ihrer terminalen Morphologien. Wir haben eine Methode entwickelt, um einzelne olfaktorische Sinnesneuronen in vivo durch Mikroinjektion eines GFP-Konstrukts mit lentiviralem Träger sichtbar zu machen.

Eine erfolgreiche Transduktion mit Lentivirus leuchtet die gesamte Länge des olfaktorischen sensorischen Axons einschließlich der terminalen Verzweigung auf. Neben der Visualisierung einzelner olfaktorischer sensorischer Neuronen ermöglicht diese Methode uns, die Genexpression eines bestimmten Gens von Interesse zu manipulieren, um dessen Funktion in einem in-vivo-Kontext zu untersuchen. Dieses Lentivirus-Verfahren erfordert Biosicherheitsstufe zwei und muss in einer laminarer Luftströmung gewährleistenden Sicherheitswerkbank durchgeführt werden.

Um eine sterile Umgebung aufrechtzuerhalten, besprühen Sie im Sicherheitswerkbank alles, was hineingelegt wird, mit 70 %igem Ethanol, bereiten Sie einen 37-Grad-Wasserbett mindestens 20 Minuten vor der Injektion vor und heizen Sie ihn vor. Verschließen Sie eine halb mit Wasser gefüllte Plastiklagerungsbeutel und stellen Sie sie auf einen leeren Heizblockinkubator.

Dadurch können sich die Mäuse nach der Injektion erholen. Füllen Sie einen Bioabfallbehälter mit 10%iger Bleiche, um alle mit Virus in Kontakt gekommenen Materialien zu desinfizieren. Bereiten Sie im Rahmen dieses Verfahrens eine kleine offene Schale mit 70%igem Ethanol und eine zweite Schale mit steriler destillierter Wasser vor.

Unter einer laminaren Luftströmungshaube verwenden wir eine Hamilton-Spritze mit einem Fassungsvermögen von fünf Mikrolitern und einer Nadel der Größe 33. Bei diesem speziellen Modell lässt sich der Kolbenwiderstand durch Drehen eines Spannungsreglers an der Oberseite der Kolbenkammer einstellen. Diese Funktion ermöglicht die Kontrolle des Mikroinjektionsvolumens und die Sterilisation der Nadel sowie der Spritzenkammer.

Aspirieren und spritzen Sie Ethanol mehrmals wiederholt aus der Schale. Spülen Sie die Spritzenkartusche, indem Sie mehrmals steriles Wasser ansaugen und abstoßen. Stellen Sie die Spritze sicher in der Flusshaube beiseite.

Stellen Sie Alkoholtücher in der Nähe der Injektionsstation bereit. Bereiten Sie einen Injektionsplatz vor, der eine erhöhte Oberfläche bietet und die Positionierung der Maus erleichtert. Dazu kann eine umgedrehte 10 cm große Kulturschale verwendet werden, die mit Kim-Tüchern bedeckt ist.

Mäusewelpen können bis zum Absetzalter durch Hypothermie anästhesiert werden. Schneiden Sie einen Finger aus einem Gummihandschuh aus und legen Sie den Mäusewelpen in den ausgeschnittenen Fingerteil. Anschließend fünf Minuten lang auf Eis legen.

Der Handschuh verhindert Hautverbrennungen, die durch direkten Hautkontakt mit dem Eis entstehen würden. Führen Sie einen Test zur vollständigen Anästhesie durch, indem Sie die Hinter- und Vorderpfoten des Welpen zwicken, um sicherzustellen, dass das Tier nicht reagiert. Nun sind wir bereit für die Mikroinjektion von Lentivirus. Wir werden dies an einem neugeborenen Welpen demonstrieren.

Wenn ein älteres Mausalter verwendet wird, sollte man die Nadel mit 33er Gauge durch eine dickere Nadel ersetzen, um die Schädeloberfläche durchdringen zu können. Desinfizieren Sie die Nasenoberfläche der Maus, indem Sie sie mit einem Alkoholtupfer abwischen. Entnehmen Sie die Lentivirus-Stämme aus der Gefrierspeicherung und tauchen Sie sie auf Eis auf.

Wir haben Lentivirus im Labor selbst mithilfe etablierter Methoden hergestellt. Bei der Entwicklung dieser Methode haben wir festgestellt, dass ein minimaler viraler Titer von 10 hoch neun infektiösen Einheiten pro Milliliter für eine gute Transduktionsrate erforderlich ist. Aspirieren Sie zwei Mikroliter der Lentivirus-Stammlösung in die sterilisierte Hamilton-Spritze.

Platzieren Sie das Mäusejunge auf der Injektionsplattform. Greifen Sie die Haut an der Kopfoberseite an den Ohren und ziehen Sie sie sanft zurück. Unsere Flusswerkbank ist mit einem Stereomikroskop ausgestattet.

Um Mikroinjektionen präzise zu führen, suchen Sie auf der dorsalen Schädeloberfläche im Bereich des Vorderhirns nach dem Umriss der Riechbülbe. Unsere Mikroinjektionsziele liegen dicht um die Riechbülbe herum, sollten diese jedoch nicht einbeziehen. Wir führen vier Injektionen in das Riechepithel jedes Welpen durch.

Diese mit blauen Punkten markierten Positionen erfordern, dass die Nadel in einem nach medial gerichteten Winkel eingeführt wird. Die zusätzlichen zwei Injektionen, die mit grünen Punkten dargestellt sind, sind versetzt, weiter medial und anterior zum Riechkolben angeordnet. Diese Injektionen können schräg erfolgen.

Die Empfehlungen zur Nadelposition berücksichtigen die ventrale Lage des Riechepithels, das sich hauptsächlich unterhalb des Bulbus olfactorius befindet. Ein senkrechter Zugang ist daher eingeschränkt. Führen Sie die Nadel etwa drei Millimeter unterhalb der Hautoberfläche durch die Oberseite der Nasenhöhle ein.

Um das Riechepithel zu erreichen. Eine geübte Hand sollte den Widerstandsabfall spüren, wenn der luminalen Raum der Nasenhöhle erreicht ist. Dieser Bereich sollte vermieden werden.

Injizieren Sie 0,5 µL Virus-Stammlösung pro Position. Wählen Sie erneut zwei Stellen pro Seite, sowohl links als auch rechts, insgesamt vier Injektionen mit jeweils 0,5 µL. Dies entspricht insgesamt 2 µL Virus pro Maus in einer einzelnen Injektionssitzung.

Auch hier vorsichtig sein, um nicht den Geruchsbullen-Blot trocken zu injizieren, da eventuell verbleibende Viruslösung oder Blut aus der Injektionsstelle oder den Nasenöffnungen austreten kann. Mit einem Ethanol-Tupfer die benutzten Tupfer im verdünnten, gebleichten Flüssigkeitsbehälter entsorgen und die injizierte Maus unverzüglich auf den Wasserbett-Inkubator zur Erholung legen. Die Nadel und Spritze durch Wiederholung des Sterilisationsverfahrens, das während der Vorbereitung durchgeführt wurde, desinfizieren. Injizierte Mäuse können 30 Minuten nach der Erholung auf dem Wasserbett-Inkubator in ihren Käfig zurückgebracht werden.

Diese gesamte Mikroinjektion kann nach vier Stunden erneut durchgeführt werden. Wenn Sie die Anzahl der olfaktorischen Sinnesneuronen erhöhen möchten, die infiziert werden sollen, können infizierte olfaktorische Sinnesneuronen bereits nach wenigen Tagen über die gesamte Länge des Zells entlang verfolgt werden. Die Tiere werden zum gewünschten Zeitpunkt getötet und zur Beobachtung perfundiert.

Mithilfe standardisierter Methoden präparieren und schneiden wir die Riechbülbe koronal mit einer Dicke von 60 Mikrometer, um transduzierte Einzelzell-Riechsinnesneuronen-Trajektorien und Axonendigungen sichtbar zu machen. Der Schnittabschnitt enthält somit alle Zellschichten der Riechbülbe, einschließlich der Axonbündel der Riechsinnesneuronen und der Axonendigungen, die in glomerulären Strukturen synaptisch verbinden, die an der Oberfläche der Bülbe gebunden sind, vorbereitend für die Schwimm-Immunhistochemie. Es werden serielle Schnitte der Riechbülbe angefertigt und gemeinsam in eine 10 Zentimeter große Kulturschale mit fünf Milliliter phosphatgepufferter Kochsalzlösung überführt.

Überführen Sie die schwimmenden Schnitte in ein kegelförmiges 50-Milliliter-Gefäß. Sobald die Schnitte am Boden des Gefäßes abgesetzt haben, saugen Sie die phosphatgepufferte Kochsalzlösung vorsichtig ab. Achten Sie darauf, die Schnitte nicht mit abzusaugen.

Ihre Schnitte werden mit 10 Milliliter frischem Puffer aufgefüllt, um jeglichen Restfixator oder Einbettungsmaterial zu entfernen. Pipettieren Sie diese Suspension unverzüglich in ein kegelförmiges 15-Milliliter-Gefäß und achten Sie darauf, alle schwimmenden Schnitte aufzufangen. Saugen Sie die Spüllösung ab und permeabilisieren Sie die Schnitte mit einer Lösung von 0,3 % Triton X-100 in Phosphat-gepufferter Salzlösung, die 10 Minuten lang auf einer Rüttelplattform steht. Anschließend können Sie bei Raumtemperatur einen standardmäßigen Immunfärbeprotokoll im selben kegelförmigen Gefäß durchführen, wobei Sie die Schritte zum Absaugen und Rütteln nach Bedarf für dieses Gefäßvolumen wiederholen und ein Volumen von 10 Milliliter für die Färbungs- und Spülschritte beibehalten.

Hier ist eine Liste der Antikörper, die wir zur gleichzeitigen Färbung positiv transduzierter olfaktorischer Sinnesneuronen und der allgemeinen Population olfaktorischer Sinnesneuronen verwenden. Um eine gründliche Penetration der Antikörper in die 60 µm dicken Bulbusschnitte zu gewährleisten, wird eine Inkubation über Nacht bei vier Grad Celsius empfohlen. Auch die Waschdurchführung sollte jeweils nicht kürzer als 20 Minuten sein.

Verteilen Sie jeden Schnitt vorsichtig mit einem Pinsel auf einem Objektträger und decken Sie jeden Objektträger mit Flora Mount-G, ergänzt durch eine Chromatin-Anfärbungslösung, ab. Bemühen Sie sich, alle Blasen aus dem Einbettungsmedium zu entfernen. Bringen Sie Ihre Schnitte in Reihen an, um den anschließenden Screening-Schritt zu vereinfachen.

Scannen Sie diese Schichten Ihrer immunohistologisch gefärbten Bulbus-Schnitte nach GFP-positiven Axonfasern und -endigungen. Mit einem Fluoreszenzmikroskop können anschließend positiv infizierte Nervenendigungen mittels konfokaler Mikroskopie abgebildet werden. Es ist hilfreich, die Fokusebene in Ihrem Bereich von Interesse anhand der DPI- und Olfactory-Marker-Protein-Kanäle zu kalibrieren.

Diese Ergebnisse zeigen eine einzelne Axonfaser und Axonendigung eines olfaktorischen Sinnesneurons innerhalb des Glomerulus, das mit olfaktorischem Markerprotein in Rot und vlu zwei in Grau gefärbt ist; infizierte Zellkörper olfaktorischer Sinnesneuronen sowie deren dendritische Knöpfchen können zudem im olfaktorischen Epithel sichtbar gemacht werden, sofern dieses Gewebe in die Dissektion und Immunfärbungsschritte einbezogen wurde. Meine konfokale Projektion liefert uns eine äußerst detaillierte Morphologie des axonalen Verlaufs und der terminalen Verzweigung eines einzelnen olfaktorischen Sinnesneurons. Man kann erkennen, wie sich die Axonfaser zurück zu ihrem glomerulären Ziel krümmt, sowie die Details ihres Verzweigungsmusters innerhalb des glomerulären Neuropils.

Die lentivirale Mikroinjektionsmethode ermöglicht die Visualisierung einzelner axonaler Zellen, die Morphologie olfaktorischer Sinnesneuronen sowie Untersuchungen zur gezielten Manipulation der Genexpression. Die Lentivirus-Transduktion führt zu einer stabilen genomischen Integration der Konstrukte. Lentiviren infizieren benachbarte Zellen nicht transsynaptisch. Die Visualisierung kann bereits nach nur drei Tagen erreicht werden und hält nachweislich mindestens drei Monate an, vermutlich sogar noch länger.

Riechsinneszellen lassen sich durch nasale Infusion einer Lentiviren-Lösung nicht leicht infizieren. Daher ist in diesem Verfahren eine Mikroinjektion durch die Oberfläche erforderlich. Das ist also unser Verfahren zur Lentiviren-Mikroinjektion.

Ich hoffe, Sie haben alle diese Informationen als nützlich empfunden, um eigene Einzelzell-Morphologien zu erzielen. Viel Erfolg bei der Suche.