Name: Effiziente Gene Lieferung in mehrere ZNS Territories mit In Utero Elektroporation (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 12 s
Description: Lernen Sie die In-Utero-Elektroporation zur präzisen Gendelivery in embryonale ZNS-Regionen wie Telencephalon und Retina. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Genfunktionen während der Neuroentwicklung.

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Die Autoren möchten sich bei Eva Hadzimova, Pierre Mattar und Christopher Kovach für ihre ersten Arbeit danken in Gründung in utero Elektroporation Technologie in der CS-Labor. Diese Arbeit wurde von einem kanadischen Institute of Health Research (CIHR) zu gewähren (MOP 44094) und CIHR / Foundation Fighting Blindness (FFB) Emerging-Team Grant (00933-000) zur CS und Alberta Kinderkrankenhaus Research Foundation Grant DMK finanziert. RD von einem CIHR Kanada Hoffnung Stipendium unterstützt wurde, ist RC durch einen FFB Studentship unterstützt und LML wurde von einem CIHR Training Grant in der Genetik und Entwicklung des Kindes unterstützt.

1. Set-up <ol><li> Set-up OP-Bereich, wie in Abb. gezeigt. 1A, A '. Die wichtigsten Komponenten des Set-up gehören ein Eppendorf FemtoJet Mikroinjektor, Narishige Mikromanipulator mit Nadelhalter, Leica steromicroscope, Glasfaser-Beleuchtung, ECM 830 Square Wave Elektroporation System mit Elektroden, Heizkissen und einem Verdampfer für Isofluran Narkose. </li><li> Reinigen Sie alle Werkzeuge mit einem Bransonic Ultraschallreiniger mit Metriclean2 Schaumarmes Lösung für Beschallung chirurgische Instrumente. Sterilisieren Instrumente durch Autoklavieren. Sterilisiert Werkzeuge werden dann in Germex gehalten. </li><li> Bereiten Sie Spritzen mit warmen steriler Kochsalzlösung und sterile Ringer-Laktat-Lösung. </li></ol> 2. Anästhesie <ol><li> Legen Tier in einem kleinen (12cm x 20cm) Betäubung Kammer. Mit einem Verdampfer, liefern 5% Isofluran Anästhesie und Sauerstoff bei 1l/min (Abb. 1A, A '). Bemerkenswert ist, ist es wichtig, Isofluran Auspuff sammeln mit einem Spülsystem. </li><li> Entfernen Tier aus der Kammer beim Atmen tief und regelmäßig wird. Toe Quetsch-und Lidschlag-Reflex-Tests werden verwendet, um Vollnarkose zu gewährleisten. </li><li> Legen Sie schwanger Maus auf dem Rücken auf einem Heizkissen (37 ° C). Das Heizkissen ist zunächst durch Abreiben mit 70% Ethanol sterilisiert und dann mit einer sterilisierten, fusselfreien Gaze abgedeckt. Verwenden Sie eine Atemmaske und Maske Gerät zu liefern Isofluran (2,25%) während der Operation. </li><li> Inject Buprenorphin (0.1mg/kg Körpergewicht) subkutan unter die Haut am Nacken. </li><li> Monitor Tier während der Operation für tiefe und regelmäßige Atmung. Das Tier sollte nicht schnappen, atmen flach und schnell. Flache, schnelle Atmung kann ein Anzeichen einer flachen Narkose werden, und der Durchfluss von Isofluran sollte erhöht werden. Wenn das Tier beginnt zu keuchen, reduzieren Sie die Strömung von Isofluran. Im Falle eines Atemstillstands, schalten Isofluran aus und erhöhen Zustrom von Sauerstoff bis Tier erholt. Starten Sie Isofluran bei einer geringeren Konzentration. </li></ol> 3. Tierische Vorbereitung für Chirurgie <ol><li> Band Vorderbeine des Tieres auf die Heizkissen und prüfen Sie erneut für einen Widerruf Reaktion durch Einklemmen des Rückfußes mit einer stumpfen Zange. </li><li> Mit einem sterilen Wattestäbchen Wattestäbchen, verbreitet eine dicke Schicht von Enthaarungscreme (dh Nair) auf den Bauch. In festen Strichen, sicherzustellen, dass die Unterwolle komplett beschichtet ist. Lassen Sie bei einem mittleren von drei Minuten, Kontrolle zeitweise mit einem sterilen Wattestäbchen für die Haarentfernung. Wet eine sterile Gaze mit sterilem Wasser und wischen Sie den Bauch, bis alle Spuren verschwunden sind. Wiederholen Sie mit Chlorhexidin (dh Stanhexidine) Haut sauberer und Wasser. Dry den Bauch mit einem sauberen, sterilen Gaze. </li><li> Sterilisieren Inzisionsstelle mit einem Chlorhexidin (dh Stanhexidine) um mehr sterilem Wasser gefolgt. Dry den Bauch mit einem sauberen, sterilen Gaze. Wiederholen Sie diesen Schritt mit 70% Ethanol und einem frischen, sterilisierten Wattestäbchen. </li><li> Legen Sie eine sterile Gaze über den Bauch mit einem Schlitz in der Mitte, durch die die Uterushörner während der Operation gezogen werden. </li></ol> 4. Inzision und Freilegung der Uterushörner <ol><li> Zur Freilegung der Uterushörner, suchen Sie zunächst der Linea alba, wie die schwache Linie unter der Haut an der Mittellinie. Mit einer Pinzette, ziehen Sie die Haut von der Bauchwand und schneiden Sie ein kleines, gerade Schnitt aus der Mitte des Bauches nach unten mit der Haut Schere (ca. 1 cm in der Länge). </li><li> Mit einer gebogenen Pinzette und Schere, wiederholen Sie den Vorgang mit dem Bauchfell. </li><li> Legen Sie steriler Gaze mit einer kleinen vertikalen Schlitz über Schnitt und dämpfen mit erwärmtem steriler Kochsalzlösung. </li><li> Slide Pinzette in den Einschnitt und suchen Sie die Gebärmutter. Halten offenen Einschnitt mit einer Pinzette beim Entfernen der Gebärmutter Hörner. </li><li> Vorsichtig greifen die Gebärmutter zwischen dem ersten und zweiten sichtbaren Embryonen und ziehen Sie die Embryonen auf die Gaze. Entfernen Sie beide Seiten des Uterushörner, indem auf die sterile Gaze und zählen die Anzahl der Embryonen ist auch jede Resorptionen oder "ungesund" (z. B. kleinere Körpergröße) Embryonen. Wet die Uterushörner mit Kochsalzlösung und vorsichtig wieder die Hälfte der Gebärmutter in den Bauch. </li></ol> 5. Die Injektion von DNA in Ventrikel <ol><li> Chirurgische Nadeln sind mit einem Sutter Flaming Micropipette Puller mit Borosilikat-Mikropipetten mit Kapillaren vorbereitet (Programm: Wärme = 750, Pull = 30, Vel = 90, Time = 150). Mit einem sterilen Skalpell, ist die Nadelspitze sanft aus in einem 45 Grad Winkel rasiert. </li><li> So laden Sie die Nadel, sind Pasteurpipetten zu einem schmalen Durchmesser unter einer Flamme gezogen. Ein Mundstück ist es, die Be-Pipette befestigt zu erarbeiten ~ 10 ul 3mg/ml Endotoxin-freie DNA mit 0,01% Methyl-grün gemischt (Anmerkung: Methyl-grünen Farbstoff ermöglicht DNA-Injektionen zu visualisieren). Der gefüllte Nadel wird dann auf einem Mikromanipulator Stativ montiert und an den FemtoJet Injektor. </li><li> Beginnend mit dem Embryo am nächsten an der Eierstöcke, Pinzetten kreisförmigenwerden verwendet, um sanft wiederum der Embryo innerhalb der Dezidua, so dass es positioniert ist "face-forward", so dass Injektionen in einem rostral kaudal auftreten. Eine Faseroptik-Lichtquelle für die Beleuchtung wird verwendet, um zu visualisieren der Mittellinie des embryonalen Gehirns, die durch die großen lateralen Ventrikel in rostralen Regionen (Abb. 1B, B ') flankiert wird. </li><li> Der Embryo wird in der Position mit kreisenden Zange gehalten. Die Nadel ist über der Gebärmutter so positioniert, dass der Winkel für die Einreise in das Gehirn ist etwa 45 Grad. Mit dem Mikromanipulator und eine schnelle und stetige Bewegung wird die Nadelspitze durch die Gebärmutterwand und in den lateralen Ventrikel des Embryos eingesetzt. Die Injektionen werden in Richtung der Seitenventrikel, 3. Ventrikel oder subretinalen Raum zum Telencephalon, Diencephalon und der Netzhaut, bzw. Ziel gerichtet. Beachten Sie, dass das embryonale Gehirn Bläschen offen sind, in einem frühen embryonalen Stadium, so dass DNA injiziert in die Seitenventrikel wird in der 3. Ventrikel fließen. </li><li> Drücken Sie das Fußpedal zur Endotoxin-freie DNA (1-3 mL) mit einer Eppendorf FemtoJet Mikroinjektor injizieren. Eine erfolgreiche Injektion ist einfach visualisiert durch die Verbreitung der Methyl-grünen Farbstoff in den embryonalen Ventrikel im Gehirn. Die Nadel wird dann langsam durch Zurückziehen bis zum Bruch zu vermeiden entfernt. </li></ol> 6. Elektroporation <ol><li> Die injizierten Embryonen (noch innerhalb der Gebärmutter) ist auf dem steriler Gaze darüber liegenden Bauch der Mutter und nass gründlich mit warmen Kochsalzlösung gelegt. Bitte beachten Sie ** Der Zusatz von Kochsalz auf die Membranfläche ist wesentlich für eine effiziente Durchgang eines elektrischen Stromes ermöglichen. </li><li> GenePaddle Elektroden werden verwendet, um die Gebärmutter nach der Injektion von DNA Griff. Fünf quadratische elektrische Impulse von 40-50V und 50 ms sind bei einer Rate von einem Impuls pro Sekunde mit einer ECM8300 BTX Elektroporation System (Abb. 1C, C ') geliefert. </li><li> Decken Sie die injizierten / elektroporiert Embryo mit Schutzfolie nass Gaze und fahren bis zur nächsten Embryo. </li><li> Nach Abschluss der Injektion / Elektroporation von allen gewünschten Embryonen, spitzen Gegenstand auf das Uterushörner zurück in den Bauchraum (Abb. 1D). </li><li> Entfernen Sie vorsichtig das andere Uterushorn und beginnen wieder mit dem Embryo am nächsten an der Eierstöcke. </li></ol> 7. Suture und Heften <ol><li> Sobald alle Embryonen sind zurück in der Gebärmutter, in die Bauchhöhle ~ 2-3 ml warme Kochsalzlösung hinzuzufügen. </li><li> Zum Schließen der Wunde, durch das Entfernen der Gaze auf den Bauch und die Identifizierung der Seiten des Peritoneum zu beginnen. Begin Naht des Bauchfells mit schwarzem geflochtenen Seidenschnur. Es wird nicht empfohlen, resorbierbares Nahtmaterial für dieses Verfahren verwenden, da es in der Regel schwächer und kann zu postoperativen Blutungen und Infektionen führen. Verankern Sie die Leitung auf dem Bauchfell am nächsten zum Brustbein und fahren Sie mit Stich vom Anker. Sicherstellen, dass alle Nähte dicht sind, und dass keine zugrunde liegende Organe oder der Haut wurde versehentlich in das Peritoneum angenäht. Clip der restlichen Naht und entsorgen. </li><li> Pull Haut geschlossen über die Naht mit einer Pinzette. Mit 9 mm Reflex ™ Hautverschluss Klammern, Clip die Haut über der Wunde, dabei nicht zu heften Sie die Naht unterhalb oder auf der Haut zu eng zu ziehen. Die bevorzugte Methode ist, um die Haut zu halten und vom Körper weg mit einer Pinzette, und kommen in einem 90 Grad Winkel mit der Klammer-Tool. Fahren Sie bis Wunde geschlossen ist (etwa drei Heftklammern). Sobald Sie fertig sind, sicherzustellen, Heftklammern dicht sind durch leichtes Drücken mit der Naht-Werkzeug (Abb. 1D). </li></ol> 8. Post-OP-Pflege <ol><li> Zur Überwachung Aufwachraum, schalten weiblichen auf ihren Bauch, und schalten Sie Isofluran. Keeping das Tier das Gesicht in der Atemschutzgeräte, wiederum Sauerstoff bis zu 3% auf aus der Narkose zu helfen. Das Tier sollte auf einem sauberen, trockenen Gaze auf dem Heizkissen, um eine Unterkühlung zu verhindern platziert werden. </li><li> Während das Tier groggy, spritzen 2 ml Ringer-Lösung subkutan unter den Hals des Tieres Haut. </li><li> Halten Sie das Tier unter Sauerstoffzufuhr für einige Minuten und Erwärmung Gazekompressen um wecken das Tier. Kurze Spurts der Bewegung des Tieres zu beachten, da es zu einer normalen Atmung zurückkehrt. Beachten Sie für einige Minuten, bis Tier scheint bewusst und wach. </li><li> Spray des Weibchens Bauch mit Gentamicin-Spray und wickeln Sie das Tier in eine sterile Gaze. </li><li> Übertragen Sie die Tiere in einen sterilen Käfig mit autoklaviert Betten und Karton Gehäuse. </li><li> Wasserflaschen sollten gründlich gereinigt werden, sterilisiert und befüllt mit sterilem Wasser. Zu 500 ml Wasser hinzufügen, 2 ml Sulfamethazin Antibiotika (25% Aktien). </li><li> Verwalten 0,05 mg / kg subkutan Buprenorphin am Morgen nach der Operation. </li><li> Überwachen Sie den weiblichen eng für die ersten 24 Stunden nach der Operation. Wenn die Tiere länger als 24 Stunden aufbewahrt werden, sind Frauen, neue ster verschobenile Käfigen am Tag 2. </li></ol> 9. Repräsentative Ergebnisse Neocortex Der Neocortex ist die Region des ZNS, die für die visuelle und sensomotorische Verarbeitung und höheren kognitiven Funktionen ist. Es ist der glutamatergen Projektion Neuronen und GABAergen Interneuronen, die aus der dorsalen und ventralen Telencephalon abgeleitet werden, bzw. besteht. Um die Rolle verschiedener Gene in neokortikalen Entwicklung, verwenden wir in utero Elektroporation entweder misexpress oder Sperrung der Ausdruck (dh durch die Verwendung von shRNA Konstrukte) verschiedener Gene in der dorsalen oder ventralen Telencephalon 1,3,4. Um misexpress Gene in der embryonalen Telencephalon, verwenden wir eine bicistronische Expressionsvektor (pCIG2), mit einer CMV-Promotor-Enhancer βactin und eine interne Ribosomen-Eintrittsstelle (IRES)-Enhanced Green Fluorescent Protein (EGFP; in pCIG2) Kassette, so dass transfizierten Zellen, die durch Epifluoreszenz (Abb. 2A-C) nachgewiesen werden. Wir nutzten diese Technik, um die Expression-Konstrukten in das Telencephalon Einführung von E11.5 bis E15.5 (angezeigten Daten an E12.5;. Abb. 2). Dadurch, dass Embryonen zu entwickeln mehrere Tage nach der Elektroporation, sind wir in der Lage, die Differenzierung und Migration von GFP-markierten Vorläufern zu verfolgen. Als Differenzierung erfolgt, 3 Tage nach der Elektroporation GFP +-Zellen differenzieren und wandern aus der ventrikulären Zone (vz), subventrikulären Zone (SVZ) und Zwischenzone (iz) und in der kortikalen Platte (cp;. Abb. 2C). , Basalen Vorläuferzellen (dh Tbr2; Wenn Gehirne bei E12.5 elektroporiert nach 24 Stunden analysiert werden, können wir frühere Ereignisse in Vorläuferzellen der Reifung und der neuronalen Migration durch Co-Kennzeichnung mit Markern der apikale Vorläuferzellen (. Abb. 2A dh Pax6) zu überwachen; . Abb. 2B) und postmitotischen neokortikalen Neuronen (dh Tbr1;. Abb. 2C). Diencephalon Der Hypothalamus liegt an der ventralen Basis des ZNS und fungiert als Gateway zwischen den endokrinen und vegetativen Nervensystems. Bei der Entwicklung der mehrere Kerne, aus denen sich die reifen Hypothalamus von einer gemeinsamen Stammform Zone unterscheiden, die Linien der ventral-äußerste Region des embryonalen Zwischenhirns. Derzeit sind die molekularen Mechanismen, die Vorläuferzellen der Zellproliferation, der neuronalen Differenzierung und die Bildung von Hypothalamus Kerne regulieren wenig verstanden. Wir haben in utero Elektroporation Reportergenexpression der embryonalen Zwischenhirns Ziel durch die Injektion von DNA in der 3. Ventrikel des E12 embryos.We folgte dann die Verteilung der GFP bei der Differenzierung von Neuronen bei E14. Mit dieser Methodik haben wir erfolgreich die GFP-Expression auf den Thalamus, pre-Thalamus und Hypothalamus (Abb. 3A) ausgerichtet. Die Analyse der koronalen Abschnitte zeigt, dass es uns gelungen, die GFP-Expression zu Vorläuferzellen gezielt diese Linie der ventrikulären Zone des 3. Ventrikels und Neuronen, die aus dem Erdmantel Zone migrieren, um Kerne zu bilden (Abb. 3B) Retina Die Netzhaut ist die neuronale Schicht des Auges, verantwortlich für die Umwandlung von Licht Photonen in elektrische Impulse an das Gehirn weitergeleitet. Es entwickelt sich als Ausstülpung des embryonalen Zwischenhirns, und damit wird aus dem Neuralrohr abgeleitet. Das neuronale Netzhaut entwickelt sich aus einer apikalen Vorläuferzellen Fach, dass neben den subretinalen Raum, einen Hohlraum, der das Auge trennt den Kopf Mesenchym liegt. Targeting DNA-Konstrukte zu retinalen Vorläuferzellen erfordert daher, dass Injektionen in ein kleines Zielgebiet vorgenommen werden. Mit Mikromanipulatoren, haben wir es geschafft, erfolgreich Ziel dieser kleinen Fläche in Embryonen von E13.5 bis E15.5 (gezeigt wird E15.5 electroporations der PCIC mit mCherry Reporter; Abb. 4).. Wenn elektroporiert retinae 24 Stunden nach der Transfektion untersucht werden, beobachten wir, dass die meisten mCherry +-Zellen sind in der äußeren Schicht Neuroblasten (onbl), wo Teilung Vorläuferzellen befinden, und nicht in den retinalen Ganglienzellen (gcl; Einschub) befindet, wo postmitotischen Zellen zu lokalisieren. <img src="/files/ftp_upload/2957/2957fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Einführung in die in utero Elektroporation Set-up und Methodik. (A) Die wichtigsten Komponenten des OP-Set-up gehören ein Eppendorf FemtoJet Mikroinjektor (1), Narishige Mikromanipulator mit Nadelhalter (2), Leica steromicroscope (3), faseroptische Beleuchtungssysteme System (4), ECM 830 Square Wave Elektroporation System mit Elektroden (5) und Heizkissen (6). (A ') Das Tier ist betäubt mit einem Verdampfer für Isofluran Narkose. (B, B ') Kurz nach der Narkose sind die Uterushörner ausgesetzt und DNA mit schnellen Grün gemischt wird in den embryonalen Gehirn Bläschen injiziert. Eine erfolgreiche Injektion wird visualisiert durch die Verfolgung der schnellen grünen Farbstoff (B '). (C, C ') Nach der DNA erfolgreich injiziert wird, sind die Paddle-Elektroden auf beiden Seiten der Gebärmutter, Positi platziertenantrieb oniersystem der Embryo, so dass die DNA wird nach dem positiven Pol in die Region des Gehirns der Wahl gezogen werden. (D, D ') Nachdem alle gewünschten Embryonen injiziert werden, die Gebärmutter ist zurück in den Bauchraum (D) gedrückt wird, wird das Bauchfell vernäht, und die Haut wird geheftet (D'). Die schwangere Frau ist dann erlaubt sich zu erholen und die Elektroporation Welpen sind an der gewünschten Zeitpunkten gesammelt. <img src="/files/ftp_upload/2957/2957fig2.jpg" alt="Abbildung 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2. Repräsentatives Beispiel für dorsal telencephalic Elektroporation. (AC): Mikroskopische Aufnahme eines koronalen Schnitt durch eine E13.5 dorsalen Telencephalon bei E12.5 mit pCIG2 elektroporiert. Elektroporiertem GFP +-Zellen sind bekannt für ihre Expression von Markern der apikalen Vorfahren analysiert (Pax6 +, rot, A), basale Vorläuferzellen (Tbr2 +, rot, B) und postmitotischen Neuronen (Tbr1 +, rot, C). cp, kortikalen Platte; SVZ, Subventrikularzone, vz; ventrikuläre Zone. <img src="/files/ftp_upload/2957/2957fig3.jpg" alt="Abbildung 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 3"> Abbildung 3. Repräsentatives Beispiel für Zwischenhirn Elektroporation. (A) A ventrale Ansicht eines E14 Gehirns, die bei E12 wurde mit pCIG2 elektroporiert. GFP Epifluoreszenz sichtbar in den Thalamus, demonstrieren vor Thalamus und Hypothalamus, die Ausbreitung der mikroinjiziert pCIG2 Plasmid während der 3 rd Ventrikels. (B) Mikroskopische Aufnahme Frontalschnitt durch Elektroporation Gehirn, welche die Migration von GFP +-Zellen aus der ventrikulären Zone und in den Mantel-Zone, wo hypothalamischen Kerne bilden. 3V, dritten Ventrikel; T, Thalamus, Hy, Hypothalamus, mz, Mantel-Zone; Tel, Telencephalon; PreT, prethalamus; vz, ventrikuläre Zone. <img src="/files/ftp_upload/2957/2957fig4.jpg" alt="Abbildung 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 4"> Abbildung 4. Repräsentatives Beispiel für Netzhaut-Elektroporation. Frontalschnitt durch eine E16.5 Auge mit PCIC bei E15.5 elektroporiert zeigt die Akkumulation von mCherry + Zellen in der äußeren Schicht Neuroblasten und nicht in Brn3b + retinalen Ganglienzellen in den Ganglienzellen. Der Einschub ist ein höherer Vergrößerung Bild von dem eingerahmten Bereich. gcl, retinalen Ganglienzellen Schicht; le, Linse; onbl, äußere Schicht Neuroblasten; re, Netzhaut.

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In utero Elektroporation kann verwendet werden, um eine Vielzahl von Entwicklungs-Prozesse analysiert werden. Zum Beispiel kann die Transfektion von Reportergen wie GFP, mCherry oder alkalische Phosphatase verwendet werden, um Abstammung Tracing und neuronalen Migration Experimente durchzuführen. Alternativ kann die Rekombinase Cre transient exprimiert werden, um selektiv beseitigen eine floxed Allel in einem räumlich-und / oder zeitlich gesteuert. Darüber hinaus können shRNA oder dominant negative Konstrukte k...

<table border="1"><tbody><tr><th> Name des Reagenz </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nummer </th><th> Kategorie </th></tr><tr><td> Feine Schere </td><td> Feine Science Tools Inc. </td><td> 14078-10 </td><td> Chirurgische Werkzeuge </td></tr><tr><td> Iris Schere, gebogen </td><td> Feine Science Tools Inc. </td><td> 14061-10 </td><td> Chirurgische Werkzeuge </td></tr><tr><td> Olsen-Hegar Ex-Delicate Nadelhalter </td><td> Feine Science Tools Inc. </td><td> 12002-12 </td><td> Chirurgische Werkzeuge </td></tr><tr><td> Ring Pinzette, 9mm </td><td> Feine Science Tools Inc. </td><td> 11103-09 </td><td> Chirurgische Werkzeuge </td></tr><tr><td> Eye dressing Pinzette </td><td> Feine Science Tools Inc. </td><td> 11051-10 </td><td> Chirurgische Werkzeuge </td></tr><tr><td> Dumont Nr. 7 DMX Pinzette </td><td> Feine Science Tools Inc. </td><td> 11271-30 </td><td> Chirurgische Werkzeuge </td></tr><tr><td> Dumont Nr. 5 DMX Pinzette </td><td> Feine Science Tools Inc. </td><td> 11251-30 </td><td> Chirurgische Werkzeuge </td></tr><tr><td> Tissue ForceP-Adson </td><td> Feine Science Tools Inc. </td><td> 11027-12 </td><td> Chirurgische Werkzeuge </td></tr><tr><td> Reflex Clip-Applikator </td><td> World Precision Instruments </td><td> 500343 </td><td> Chirurgische Werkzeuge </td></tr><tr><td> Perforierte Löffel, 15 mm Durchmesser </td><td> Feine Science Tools Inc. </td><td> 10370-18 </td><td> Chirurgische Werkzeuge </td></tr><tr><td> Autoclip Remover </td><td> Mikron </td><td> 427637 </td><td> Chirurgische Werkzeuge </td></tr><tr><td> Silk schwarz Geflochtener </td><td> Ethicon Inc. </td><td> K871 </td><td> Chirurgische Werkzeuge </td></tr><tr><td> Reflex Hautverschluss Stainless Steel Wound Clips </td><td> World Precision Instruments </td><td> 500346 </td><td> Chirurgische Werkzeuge </td></tr><tr><td> ECM 830 Square Wave Elektroporationssystem </td><td> VWR-CanLab </td><td> 58018-004 </td><td> Instruments </td></tr><tr><td> Pinzette w / Variable Gap 2 Round 5mm Platinum Plattenelektrode </td><td> Protech International Inc. </td><td> CUY650P5 </td><td> Instruments </td></tr><tr><td> Pinzette w / Variable Gap 2 Round 7mm Platinum Plattenelektrode </td><td> Protech International Inc. </td><td> CUY650P7 </td><td> Instruments </td></tr><tr><td> Eppendorf FemtoJet Mikroinjektor </td><td> VWR CanLab </td><td> CA62111-488 </td><td> Instruments </td></tr><tr><td> Fußschalter für Eppendorf FemtoJet Mikroinjektor </td><td> VWR CanLab </td><td> CAACCESS (Sonstiges) </td><td> Instruments </td></tr><tr><td> Bransonic Ultraschallreiniger Modell 1510R-DTH </td><td> VWR CanLab </td><td> CA33995-534 CPN-952 bis 118 </td><td> Instruments </td></tr><tr><td> Sutter P97 Mikropipette Puller </td><td> Sutter Instrument, Carsen Group Inc. </td><td> P-97 </td><td> Instruments </td></tr><tr><td> Mikropipetten - Borosilikatglas mit Filament OD: 1 mm, ID: 0,78 mm, Länge 10 cm </td><td> Sutter Instrument </td><td> BF100-78 bis 10 </td><td> Instruments </td></tr><tr><td> 3-Achsen-Manipulator Coarse </td><td> Carl Zeiss Canada Inc. </td><td> M-152 </td><td> Instruments </td></tr><tr><td> Magnetic Haltevorrichtung für Mikromanipulator </td><td> World Precision Instruments </td><td> M1 </td><td> Instruments </td></tr><tr><td> Grundplatte aus Stahl für Mikromanipulator </td><td> World Precision Instruments </td><td> 5052 </td><td> Instruments </td></tr><tr><td> Micropipette Halter </td><td> World PrNTSCHEIDUNG Instruments </td><td> MPH3 </td><td> Instruments </td></tr><tr><td> Micropipette Griff </td><td> World Precision Instruments </td><td> 5444 </td><td> Instruments </td></tr><tr><td> Stereomikroskop </td><td> Leica </td><td> MZ6 </td><td> Instruments </td></tr><tr><td> Vaporizer für Isofluran Narkose </td><td> Porter Instruments Company </td><td> MODELL 100-F </td><td> Instruments </td></tr><tr><td> Metriclean2 Schaumarmes Lösung für Beschallung chirurgische Instrumente </td><td> Metrex Research Corporation </td><td> 10-8100 </td><td> Chirurgische Reagenzien </td></tr><tr><td> Gentamicin 40mg/ml in 0,2 g Methylenblau Antibiotikum Spray nach dem Vernähen </td><td> Sigma Aldrich </td><td> G1264 </td><td> Chirurgische Reagenzien </td></tr><tr><td> Germex zur Sterilisation chirurgischer Instrumente </td><td> Vétoquinol </td><td> DIN # 00141569 </td><td> Chirurgische Reagenzien </td></tr><tr><td> BNP Augensalbe </td><td> Vétoquinol </td><td> DIN # 00516414 </td><td> Chirurgische Reagenzien </td></tr><tr><td> Nair ® </td><td> Distributed by Church &amp; Dwight Co., Inc. </td><td> im Handel erhältlich </td><td> Chirurgische Reagenzien </td></tr><tr><td> Stanhexidine 4% w / v Haut Reiniger </td><td> Omega Laboratories Inc. </td><td> 01938983 </td><td> Chirurgische Reagenzien </td></tr><tr><td> Buprenorphin (Temgesic) analgetische </td><td> Schering-Plough </td><td> 531-535 </td><td> Chirurgische Reagenzien </td></tr><tr><td> Sulfa &quot;25&quot; Sulfamethazin Antibiotikum </td><td> Professional Veterinary Laboratories </td><td> DIN # 00308218 </td><td> Chirurgische Reagenzien </td></tr><tr><td> Ringer-Laktat-Lösung </td><td> Baxter Corporation </td><td> DIN # 0061085 </td><td> Chirurgische Reagenzien </td></tr><tr><td> Saline - 0,9% Natriumchlorid </td><td> B-Braun Medical Inc. </td><td> DIN # 01924303 </td><td> Chirurgische Reagenzien </td></tr><tr><td> Inhalationsnarkose - Isofluran USP </td><td> Pharmaceutical Partners of Canada Inc. </td><td> DIN # 02237518 </td><td> Chirurgische Reagenzien </td></tr><tr><td> Fast Green FCF </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> F7252 </td><td> Chirurgische Reagenzien </td></tr></tbody></table>

effiziente gene lieferung in mehrere zns territories mit in utero elektroporation

Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In Utero Electroporation

Die Fähigkeit, die Genexpression zu manipulieren ist der Grundstein der modernen experimentellen Embryologie, was zur Aufklärung von mehreren Entwicklungspfaden. Verschiedene leistungsfähige und gut etablierten transgenen Technologien zur Verfügung, um Genexpression in der Maus zu manipulieren, so dass für die Erzeugung sowohl Verlust-und Gain-of-function-Modelle. Allerdings ist die Erzeugung von Maus Transgenik sowohl kosten-und zeitaufwendig. Alternative Methoden der Gen-Manipulation wurden daher häufig gesucht. In utero Elektroporation eine Methode der Gentransfer in die Live-Maus-Embryonen 1,2, dass es uns gelungen, 3,4 angepasst ist. Er basiert weitgehend auf den Erfolg der in ovo Elektroporation Technologien, die häufig in Küken 5 zum Einsatz kommen. Kurz gesagt, ist die DNA in die offenen Kammern des sich entwickelnden Gehirns und die Anwendung eines elektrischen Stromes bewirkt die Bildung von transienten Poren in Zellmembranen injiziert, so dass für die Aufnahme von DNA in die Zelle. In unseren Händen, können Embryonen effizient so früh wie embryonale Tag (E) 11,5 elektroporiert werden, während die Ausrichtung der jüngeren Embryonen eine Ultraschall-geführte Mikroinjektion Protokoll, wie zuvor 6 beschrieben erfordern würde. Umgekehrt ist E15.5 dem neuesten Stand wir leicht elektroporieren kann, aufgrund der Beginn der parietalen und frontalen Knochen Differenzierung, die Mikroinjektion behindert in das Gehirn. Im Gegensatz dazu ist die Netzhaut zugänglich über das Ende der Embryogenese. Embryonen können zu jedem Zeitpunkt während der embryonalen oder frühen postnatalen Phase gesammelt werden. Die Injektion eines Reporter-Konstrukt ermöglicht die Identifizierung von transfizierten Zellen. Bis heute hat in utero Elektroporation wurde am häufigsten für die Analyse der Neokortex Entwicklung 1,2,3,4 verwendet. Neuere Studien haben die embryonalen Netzhaut 7,8,9 und Thalamus 10,11,12 ausgerichtet. Hier präsentieren wir eine in utero Elektroporation Protokoll, das leicht angepasst werden kann, um verschiedene Bereiche des embryonalen ZNS Ziel geändert. Wir beweisen, dass mit Hilfe dieser Technik können wir die embryonalen Telencephalon, Diencephalon und Netzhaut Ziel. Repräsentative Ergebnisse vorgestellt werden, erste, welche die Anwendung dieser Technik, um DNA-Expressionskonstrukte in den Seitenventrikel eingeführt, so dass wir Vorläuferzellen Reifung, Differenzierung und Migration in der embryonalen Telencephalon überwachen. Wir zeigen auch, dass diese Technik verwendet werden, um DNA, die Zwischenhirn Gebiete rund um den 3. Ventrikel Ziel sein, so dass die Flugrouten der differenzierenden Neuronen in Zwischenhirn Kerne überwacht werden. Schließlich zeigen wir, dass die Verwendung von Mikromanipulatoren uns genau vorstellen DNA-Konstrukte in kleine Zielgebiete, einschließlich der subretinalen Raum ermöglicht, so dass wir den Einfluss der Manipulation der Genexpression auf der Netzhaut Entwicklung zu analysieren.

In utero Elektroporation ermöglicht eine schnelle Gentransfer in eine räumlich-und zeitlich kontrollierten Art und Weise in den Entwicklungsländern das zentrale Nervensystem (ZNS). Hier beschreiben wir eine sehr anpassungsfähig in utero Elektroporation Protokoll, mit dem Ausdruck Konstrukte in mehreren embryonalen ZNS-Domänen, einschließlich der Telencephalon, Diencephalon und der Netzhaut liefern können.

Effiziente Gene Lieferung in mehrere ZNS Territories mit In Utero Elektroporation

Die Fähigkeit, die Genexpression zu manipulieren, ist der Grundstein der modernen experimentellen Embryologie und hat zur Aufklärung zahlreicher entwicklungsbedingter ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Genexpression in den neuronalen Vorläuferzellen des embryonalen zentralen Nervensystems zu verändern. Dies wird erreicht, indem zunächst zeitlich befruchtete Weibchen beschafft und auf eine Operation vorbereitet werden. Anschließend werden die Uterushörner durch einen Bauchschnitt freigelegt.Nachdem die Embryonen freigelegt sind, wird DNA in das Seitenventrikel, den dritten Ventrikel oder den subretinalen Raum injiziert. Der letzte Schritt des Verfahrens besteht darin, über die Uteruswand hindurch einen elektrischen Strom durch den Embryo zu leiten, wobei die Elektrodenpaddel so ausgerichtet werden, dass die positive Elektrode über der bevorzugten Transfektionsstelle platziert ist. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die mittels Immunfluoreszenzmikroskopie die Proliferation, Migration und Differenzierung von neuronalen Vorläuferzellen in der tline kelon dying kelon und der Retina zeigen.Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden, wie der Degeneration transgener Mäuse, liegt in ihrer Schnelligkeit, der Möglichkeit, Hochdurchsatz-Studien durchzuführen, und ihren geringeren Kosten. Diese Methode

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Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Ein Gentransfer-Methode in den Entwicklungsländern Gehirn der Maus ist mit einer einzigartigen chirurgischen Verfahren und spezielle Form der Elektroden beschrieben. Diese einzigartige Technik erlaubt die Transfektion von Plasmid-DNA zeitlich und räumlich, was viele Neurowissenschaftler in das Studium der Entwicklung des Gehirns wird die Beihilfe.

Maus in Utero Elektroporation: Kontrollierte Spatiotemporal Gene Transefection

Diese Studie beschreibt die Entwicklung...

In-vitro-Elektroporation von der Unteren Rhombischer Lip von der Schwangerschaft ab muriner Embryonen

Steuern der Expansion von somatischen Stammzellen ist ein Hauptfaktor, was ihrer Studie und therapeutischen Verwendung. Hier beschreiben wir ein System zur zeitlich steuern Nervenstammzellen Expansion während der Entwicklung und im Erwachsenenalter, die verwendet werden, um die Zahl der Neuronen im Gehirn der Maus erzeugt erhöhen kann.

Erweiterung der embryonalen und adulten neuralen Stammzellen<em&gt; In Utero</em&gt; Elektroporation oder Viral stereotaktische Injektion

Dieses Video zeigt die Abgabe von Plasmid-DNA in zerebelläre neuronale Zellen von Mausembryonen mittels in utero-Elektroporation. Diese Methode ist nützlich, um die in vivo Funktion von Genen bei der normalen Gehirnentwicklung und die Veränderungen in der Genexpression von Neuronenzellen während der Tumorprogression zu verstehen.

In utero Elektroporation basierte Genabgabe: Eine Technik zur Injektion von Plasmid-DNA in embryonale Kleinhirnzellen von Mausembryonen

Trotz der funktionalen und medizinische Bedeutung des...

Genetische Manipulation der Maus entwickeln Hypothalamus durch<em&gt; In utero</em&gt; Elektroporation

Die Pia-Oberfläche ist eine einzigartige Vorläuferzone im ZNS, die Aufnahme wird immer mehr Aufmerksamkeit. Hier erläutern wir ein Verfahren für schnelle genetische Manipulation dieser Vorläuferzone unter Verwendung einer modifizierten Methode der Elektroporation. Dieses Verfahren kann für zelluläre und molekulare Untersuchungen der Zelllinien und Signalwegen in der Zelldifferenzierung beteiligt sind, verwendet werden, um das Schicksal und die Eigenschaften von Tochterzellen zu erklären.

Neonatal Pial Oberflächen Elektroporation

Dieses Protokoll beschreibt im Detail, wie verschiedene Regionen im Zentralnervensystem C57BL/6 mittels in utero-Elektroporation spezifisch transfiziert werden. In diesem Protokoll sind detaillierte Anweisungen für Transfektionen von Regionen enthalten, die sich zum Kortex, Hippocampus, Thalamus, Hypothalamus, Nucleus lateralis septum lateralis und Striatum entwickeln.

Cortex, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus, Lateral Septal Nucleus- und Striatum spezifische<em&gt; In Utero</em&gt; Electroporation in der C57BL / 6-Maus,

Wir beschreiben eine neue Methode für die Lieferung von Plasmid DNA in die important-Zellen der Maus Blase in Vivo durch Katheterisierung der Harnröhre und Elektroporation. Freuen Sie sich auf eine schnelle und bequeme Möglichkeit zur Erzeugung von autochthonen Mausmodelle der Blase Krankheiten.

Neuartige Methode der Transport der Plasmid-DNA zu Maus Blase Urothel durch Elektroporation

Die doppelte Utero-Elektroporation ermöglicht die Ausrichtung auf Zellpopulationen, die räumlich und zeitlich getrennt sind. Diese Technik ist nützlich, um Wechselwirkungen zwischen diesen Zellpopulationen mit fluoreszierenden Proteinen unter normalen Bedingungen, aber auch nach funktionellen Experimenten zu visualisieren, um Gene von Interesse zu stören.

Double In Utero Elektroporation, um zeitlich und räumlich getrennte Zellpopulationen anzuvisieren

In diesem Protokoll beschreiben wir, wie die Amnionhöhle der Maus bei E7.5 mit Lentivirus injiziert wird, was zu einer gleichmäßigen Transduktion der gesamten Neuralplatte führt, mit minimalen nachteiligen Auswirkungen auf das Überleben oder die Embryonalentwicklung.

Murine Neural Plate Targeting by In Utero Nano-Injection (NEPTUNE) at Embryonic Day 7.5

Lernen Sie die In-Utero-Elektroporation zur präzisen Gendelivery in embryonale ZNS-Regionen wie Telencephalon und Retina. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Genfunktionen während der Neuroentwicklung.

Effiziente Gene Lieferung in mehrere ZNS Territories mit In Utero Elektroporation

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