Effiziente Gene Lieferung in mehrere ZNS Territories mit In Utero Elektroporation

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Genexpression im embryonalen Zentralnervensystem der Neuronen zu verändern. Dies wird erreicht, indem zunächst trächtige Weibchen zu einem bestimmten Zeitpunkt gewonnen und auf die Operation vorbereitet werden. Die Gebärmutterhörner werden dann durch einen Bauchschnitt freigelegt.

Sobald die Embryonen freigelegt sind, wird die DNA in den lateralen Ventrikel, den dritten Ventrikel oder den subretinalen Raum injiziert. Der letzte Schritt des Verfahrens besteht darin, einen elektrischen Strom durch die Gebärmutterwand an den Embryo anzulegen, wobei die Paddelelektroden so ausgerichtet werden, dass der positive Pol über der bevorzugten Transfektionsstelle platziert wird. Letztendlich können durch Immunfluoreszenzmikroskopie Ergebnisse erzielt werden, die die Proliferation, Migration und Differenzierung von Neurovorläuferzellen im tline kelon absterbenden Kelon und in der Netzhaut zeigen.

Der Hauptvorteil dieser Technik oder bestehender Methoden, wie z. B. der Degeneration transgener Mäuse, besteht darin, dass sie schnell ist, Studien mit höherem Durchsatz ermöglicht und geringere Kosten verursacht. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen auf dem Gebiet der neuronalen Entwicklung zu beantworten, z. B. welche Gene den neuronalen Vorläufer regulieren, die Zellproliferation, die Spezifikation des Zellschicksals, die neuronale Differenzierung und die Zellmigration. Die Implikationen dieser Technik können sich auf ein besseres Verständnis der genetischen Signalwege erstrecken, die Defekte in der ZNS-Entwicklung hervorheben, von denen viele zu kognitiven Beeinträchtigungen führen und Verhaltensstörungen beim Menschen sind.

Diese Technik kann auch auf andere Organsysteme wie das sich entwickelnde periphere Nervensystem, das Herz und die Plazenta angewendet werden. Es kann auch zur Untersuchung von Krankheitsmodellen bei Mäusen sowie anderen Modellorganismen wie Küken und Xip eingesetzt werden. Im Allgemeinen ist das Haupthindernis für den Erfolg von Personen, die neu in dieser Technik sind, das Überleben der Embryonen muss bei der Manipulation, Injektion und Porentore der Embryonen beachtet werden.

Wir hatten die Idee zu dieser Methode, als wir ein schnelles Mittel zur Manipulation der Genexpression im Embryonal, im Telencephalon und in der Netzhaut benötigten. Wir haben diese Technik in unserem Labor entwickelt, indem wir die ursprünglich von Sal beschriebene Technik modifiziert haben, die 2001 in der Zeitschrift Developmental Biology veröffentlicht wurde. Wir haben auch mit einem Crashlabor zusammengearbeitet, um dieses Protokoll auch in dem sich entwickelnden Dilon zu etablieren.

Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da die Injektions- und Elektroporationsschritte schwer zu erlernen sind, da sie eine sehr sorgfältige Manipulation der Embryonen erfordern und die Injektionsstellen manchmal sehr klein sein können. Beispiel, der subretinale Raum Rajiv, ein Postdoc aus dem Sherman's Laboratory, um mit der Reinigung und Sterilisation aller chirurgischen Instrumente zu beginnen. Füllen Sie anschließend die Spritzen mit Kochsalzlösung und Laktatlösung und legen Sie sie zum Erwärmen im Operationsbereich auf ein Heizkissen.

Sterilisieren Sie ein Heizkissen mit 70 % Ethanol und bedecken Sie es dann mit einem sterilisierten, schlaffen Mullkissen. Stellen Sie das Heizkissen auf 37 Grad Celsius ein. Legen Sie das Tier in eine kleine Narkosekammer und betäuben Sie esthesiert, indem Sie 5% Fluor mit Sauerstoff in einer Menge von einem Liter pro Minute durch einen Verdampfer abgeben.

Achten Sie darauf, die isof-Fluorabgase mit einem Spülsystem zu sammeln. Sobald das Tier tief und regelmäßig atmet, nehmen Sie es aus der Kammer. Verwenden Sie Zehenkneifen und Augenblinzelreflexe.

Um eine vollständige Anästhesie zu gewährleisten. Legen Sie das anästhesierte Tier auf den Bauch und verwenden Sie einen Beatmungsschlauch, um während der Operation 2,25 % Eis Fluor abzugeben. Injizieren Sie Buprenorphin in einer Konzentration von 0,1 Milligramm pro Kilogramm Körpergewicht subkutan in den Nacken.

Überwachen Sie weiterhin die Atmung des Tieres und passen Sie den Fluorfluss bei Bedarf an. Kleben Sie dann mit Klebeband über die Brust des anästhesierten Tieres und prüfen Sie erneut, ob es zu einer Retraktionsreaktion kommt, indem Sie den Hinterfuß mit einer stumpfen Pinzette einklemmen. Tragen Sie mit einem sterilen Wattestäbchen eine dicke Schicht Creme auf den Bauch auf und achten Sie darauf, dass das Unterfell vollständig bedeckt ist.

Lassen Sie die Creme etwa drei Minuten einwirken und prüfen Sie mit Unterbrechungen, ob die Haare entfernt werden. Befeuchten Sie mit einem sterilen Tupfer ein steriles Mullkissen mit sterilem Wasser und wischen Sie die Haare vom Bauch ab. Als nächstes sterilisieren Sie die Inzisionsstelle mit Chlorhexidin und mehr Wasser.

Trocknen Sie den Bauch mit sauberer, steriler Gaze ab. Wiederholen Sie diesen Schritt mit 70% Ethanol unter Verwendung von frischer, sterilisierter Baumwollgaze. Bereiten Sie sich auf die Operation vor, indem Sie ein OP-Gewand anziehen, um die Gebärmutterhörner freizulegen.

Lokalisieren Sie zunächst die lineare Alba als schwache Linie unter der Haut an der Mittellinie. Ziehen Sie die Haut mit einer Pinzette von der Bauchdecke weg und schneiden Sie mit einer Hautschere mit einer gebogenen Pinzette und Schere einen kleinen geraden Schnitt vom Mittelbauch nach unten. Wiederholen Sie den Vorgang mit dem Bauchfell. Fassen Sie das Bauchfell mit der Pinzette.

Ziehen Sie sich zurück und schneiden Sie dann einen Schnitt, der gerade groß genug ist, um die Gebärmutter durchzuziehen. Legen Sie sterile Gaze mit einem kleinen vertikalen Schlitz über den Schnitt und befeuchten Sie sie mit warmer, steriler Kochsalzlösung. Schieben Sie dann die Pinzette in den Schnitt und lokalisieren Sie die Gebärmutter, die den Schnitt mit der Pinzette offen hält.

Fassen Sie die Gebärmutter zwischen dem ersten und zweiten sichtbaren Embryo an und ziehen Sie beide Seiten der Gebärmutterhörner auf die Gaze. Zählen Sie die Anzahl der Embryonen unter Angabe einer eventuellen Resorption oder Embryonen mit geringer Körpergröße. Um die richtige Anzahl von DNA-Injektionen vorzubereiten, befeuchten Sie die Gebärmutterhörner mit Kochsalzlösung und führen Sie vorsichtig ein Gebärmutterhorn in den Bauch zurück.

Um die chirurgischen Nadeln zu verabscheuen, verwenden Sie eine nach oben gezogene Pipette mit aufgesetztem Mundstück, um 10 Mikroliter von drei Milligramm pro Milliliter aufzusaugen. Endotoxinfreie DNA-Lösung, die Methylgrün-Farbstoff enthält und die DNA in eine chirurgische Nadel ausstößt. Montieren Sie die erste gefüllte Nadel auf den Mikromanipulator.

Befestigen Sie sich am Injektor, beginnend mit dem Embryo, der dem Eierstock am nächsten liegt. Verwenden Sie eine kreisförmige Pinzette, um den Embryo innerhalb der Dezidua vorsichtig so zu drehen, dass er mit dem Gesicht nach vorne positioniert ist, so dass die Injektionen in einer ROS-Rolle in cordaler Richtung erfolgen können. Verwendung einer faseroptischen Lichtquelle zur Identifizierung der Mittellinie des embryonalen Gehirns.

Man beachte die flankierten großen Seitenventrikel in den rostralen Regionen. Halten Sie den Embryo mit einer gebogenen Pinzette an Ort und Stelle und positionieren Sie die gefüllte chirurgische Nadel so über der Gebärmutter, dass der Eintrittswinkel in das Gehirn etwa 45 Grad beträgt. Drehen Sie mit einer schnellen und gleichmäßigen Bewegung den Drehknopf am Mikromanipulator, um die Nadelspitze durch die Gebärmutterwand in den lateralen Ventrikel des embryonalen Gehirns einzuführen.

Drücken Sie anschließend auf das Fußpolster des Mikroinjektors. Um die DNA-Lösung zu injizieren, wird eine erfolgreiche Injektion leicht visualisiert, indem der Methylgrün-Farbstoff in den embryonalen Hirnventrikeln verteilt wird. Nachdem die DNA injiziert wurde, ziehen Sie die Nadel langsam wieder nach oben, um sie zu entfernen, ohne einen Bruch zu verursachen.

Legen Sie den injizierten Embryo auf die sterile Gaze und befeuchten Sie ihn gründlich mit warmer Kochsalzlösung. Fassen Sie die Gebärmutter mit dem Pluspol der Paddelelektrode an, der über der gewünschten Transfektionsstelle platziert ist. Geben Sie dann fünf quadratische elektrische Impulse von 40 bis 50 Volt und 50 Millisekunden mit einer Geschwindigkeit von einem Impuls pro Sekunde ab.

Decken Sie den injizierten und elektrobewerteten Embryo mit einer schützenden Feuchtgaze ab und fahren Sie dann mit der Injektion des nächsten Embryos fort. Nach Abschluss der Injektion und Elektroimplantation aller gewünschten Embryonen in das Gebärmutterhorn schieben Sie es vorsichtig zurück in die Körperhöhle. Entfernen Sie das zweite Gebärmutterhorn, um mit der Injektion und Elektroporation der verbleibenden Embryonen zu beginnen.

Sobald sich alle Embryonen wieder in der Gebärmutter befinden, geben Sie zwei bis drei Milliliter warme Kochsalzlösung in die Bauchhöhle und entfernen Sie dann die Gaze vom Bauch, um die Seiten des Bauchfells freizulegen. Verwenden Sie eine schwarze, geflochtene Seidenschnur, um das Bauchfell zu nähen, indem Sie die Linie auf dem Bauchfell verankern, das dem Brustbein am nächsten liegt, und dann mit dem Nähen vom Anker fortfahren. Stellen Sie sicher, dass alle Nähte fest sind und dass keine darunter liegenden Organe oder Haut in das Bauchfell eingenäht sind.

Schneiden Sie die verbleibende Nahtlinie ab und verwerfen Sie sie. Ziehen Sie die Haut mit einer Pinzette mit Hautverschlussklammern über die Nahtlinie. Schneiden Sie die Haut ab und achten Sie darauf, die Nahtlinie nicht darunter zu heften oder zu fest an der Haut zu ziehen.

Wenn Sie fertig sind, stellen Sie sicher, dass die Klammern fest sind, indem Sie sie vorsichtig mit dem Nahtwerkzeug hier zusammendrücken, wobei A-P-C-I-G zwei Expressionsvektoren, die die Expression von GFP steuern, in den sich entwickelnden Neokortex bei E 12 elektroporiert wurden. Im Laufe der neokortikalen Entwicklung differenzieren sich die apikalen Vorläuferzellen entweder in sekundäre basale Vorläuferzellen oder postmitotische Neuronen und exprimieren weiterhin GFP. Diese Nervenzellen können dann auf die Expression typischer Marker des neuronalen Subtyps analysiert werden, die in rot dargestellt sind.

In dieser käuflichen Ansicht des Vorderhirns eines Embryos, der bei E 12 elektroporiert und bei E 14 seziert wurde, ist die elektroporierte Stelle durch die grüne Epifluoreszenz bei E 14 gekennzeichnet. Die GFP-Expression ist im Thalamus, Präthalamus und Hypothalamus zu beobachten, was darauf hindeutet, dass sterbende Lic-Territorien erfolgreich transfiziert wurden. Das Strichfeld markiert die Position des Schnitts durch eine ventrikuläre Zone.

Ein genauerer Blick auf die ventrikuläre Zone zeigt die Wanderung von GFP-Zellen aus der ventrikulären Zone in die Mantelzone. Dort, wo sich hypothalamische Kerne bilden, wird die embryonale Netzhaut ebenfalls leicht elektroporiert, wie in diesem koronalen Schnitt gezeigt, durch ein E 16,5 I, das bei E 15,5 mit PCIC elektroporiert wurde. Hier ist die Akkumulation von m kirschpositiven Zellen spezifisch für die äußere Neuroblastenschicht und wird bei drei B-positiven retinalen Ganglienzellen in der Ganglienzellschicht nicht beobachtet. Einmal gemeistert, kann diese Technik in 30 Minuten durchgeführt werden, wenn keine unerwarteten Komplikationen auftreten.

Bei diesem Eingriff ist es wichtig, die richtigen sterilen Techniken zu verwenden, eine ruhige Hand bei der Manipulation der Embryonen zu haben und alle notwendigen Materialien bereit zu haben, bevor die schwangere Frau unter Narkose gesetzt wird. Nach diesem Verfahren können elektrogeflochtene Embryonen bis zum Erwachsenenalter leben gelassen werden, woraufhin andere Methoden wie Verhaltens- und Funktionstests durchgeführt werden können, um zusätzliche Fragen zu beantworten, wie sich die Manipulation bestimmter Gene im Embryo auf die neuronale Funktion beim Erwachsenen auswirkt. Seit ihrer Entwicklung hat diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der ZNS-Entwicklung geebnet, um die Genfunktion in vivo bei Mäusen zu erforschen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man fremde DNA in das embryonale Neuralrohr einführt. Konkret zeigen wir Ihnen, wie Sie eine schwangere Frau auf die Operation vorbereiten können. Legen Sie die Gebärmutter frei, injizieren Sie DNA und elektrolytieren Sie den Embryo.

Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit isof-Fluor gefährlich sein kann und bei der Durchführung dieses Verfahrens Vorsichtsmaßnahmen wie ein Spülsystem getroffen werden sollten.