Robuste Generierung von Leber-ähnlichen Zellen aus humanen embryonalen Stammzell-Populationen

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, homogene Mengen an menschlichen Hepatozyten zu erzeugen, um die Biologie der menschlichen Leber in vitro zu untersuchen. Dies wird initiiert, indem humane embryonale Stammzellen oder humane ES-Zellen unter Verwendung physiologischer Reize, die in A und WINT aktiv sind, zum endgültigen Endoderm getrieben werden A.As in einem zweiten Schritt wird das definitive Endoderm hocheffizient zum hepatischen Endoderm getrieben. Als nächstes wird das humane ESC-abgeleitete hepatische Endoderm in vitro gereift, um funktionsfähige humane Hepatozyten herzustellen.

Ergebnisse von PCR-Western-Blotting, Immunfluoreszenz, Eliza-Metabolismus und Arzneimittelmetabolismus deuten darauf hin, dass bei dieser Methode Hepatozyten mit einer Effizienz von etwa 90 % aus menschlichen ES-Zellen gewonnen werden. Mit dieser Technik können wir theoretisch unerschöpfliche Vorräte an primären menschlichen Hepatozyten erzeugen, die ein beträchtliches Maß an menschlicher Leberfunktion aufweisen. In Zukunft wird dies die genaue Vorhersage der Toxizität von Arzneimitteln erleichtern und die menschliche Leber unterstützen. Der Trick besteht darin, die solare Differenzierung und die Kerndichte menschlicher Zellen zu steuern.

visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da die Kernzelldichte für die Erzeugung einer homogenen Zellpopulation unerlässlich ist. Wir haben über 15 Personen an vier Standorten international geschult, um diese Technik erfolgreich durchzuführen. Beginnen Sie mit einer Kultur menschlicher embryonaler Stammzellen und vermehren Sie sich auf Matrigel-beschichteten Platten mit embryonalen Fibroblasten der Maus, konditionierten Medien ORM cm, ergänzt mit basischem FGF.

Es ist wichtig, die humanen ESCs, die vor der hepatischen Differenzierung aufrechterhalten werden, sorgfältig zu charakterisieren. Diese Zellen weisen zum Beispiel die menschliche ESC-Morphologie auf. Sie exprimieren auch die pluripotenten Stammzellmarker, OCT 4 und Nano in Konzentrationen, die mit der positiven Kontrolllinie H 7 der menschlichen ESC-Linie vergleichbar sind.

Darüber hinaus sind die humanen ESCs positiv für SS EEA 4. Wenn die humanen E-Regler eine Co-Flüssigkeit von 30 bis 60 % erreichen, ersetzen Sie das ME CM durch ein frisch zubereitetes Differenzierungsmedium. Um die hepatische Differenzierung einzuleiten, sollte das Medium drei Tage lang alle 24 Stunden ausgetauscht werden.

Nach drei Tagen nehmen die Zellen ein dreieckiges Aussehen an, da sie beginnen, sich in Richtung eines endodermalen Phänotyps zu differenzieren. Schalten Sie das Medium auf SR DMSO-Differenzierung um. Mittlere Kultur für vier bis fünf Tage.

Wechseln Sie das Medium alle 48 Stunden. Nach diesem Zeitraum von fünf Tagen begannen die Zellen, ein polygonales Aussehen anzunehmen, das für Leberzellen charakteristisch ist. Die Differenzierung von humanem ESC zu hepatischem Endoderm spiegelt sich in einer Reihe tiefgreifender morphologischer Veränderungen bis zum neunten Tag wider.

Darüber hinaus nimmt die Expression von Octa vier über den Zeitraum von neun Tagen allmählich ab. Im Gegensatz dazu nehmen die Lebertranskripte eines FP und des Albumins ab dem siebten Tag zu. Fahren Sie fort, indem Sie die Zellen reifen lassen und den Leberphänotyp neun Tage lang im Endmedium mit frischem Medium alle 48 Stunden aufrechterhalten.

Überwachen Sie schließlich die kultivierten Zellen mittels Phasenkontrastmikroskopie auf allmähliche morphologische Veränderungen von einer stacheligen dreieckigen Form zu einer charakteristischen Lebermorphologie, die ein polygonales Erscheinungsbild aufweist, um den Leberendodermfunktionsassay quantitativ zu bewerten. Für Cytochrom P vier 50 enzymatische Aktivität, spezifisch SIP drei A vier oder SIP eins A zwei. Erste Brutzeit Tag 17.

Humane ESC-abgeleitete hepatische Endodermzellen mit dem spezifischen Substrat, das Reaktionen in dreifachen Präparaten durchführt. Denken Sie daran, Gewebekulturmedien als Negativkontrolle zu verwenden und fünf Stunden lang bei 37 Grad Celsius zu inkubieren. Sammeln Sie die Überstände und messen Sie die relativen Werte der basalen enzymatischen Aktivität, wie in den Anweisungen des Herstellers beschrieben.

Berechnen Sie nun für jede Probe die enzymatische Aktivität pro Milligramm Protein, wie sie durch A-B-C-A-S bestimmt wird. Eine Immunfärbung typischer Kulturen, die mit dieser Methode der In-vitro-Reifung des hepatischen Endoderms gewonnen werden. Zeigen Sie die homogene Expression von drei humanen Lebermarkern, Albumin, a FP und ein.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man menschliche und lernende Stammzellen effizient von Hepatozyten unterscheidet. Sobald diese Technik gemeistert ist, kann sie täglich mit einem Einsatz von etwa zweieinhalb Minuten pro Million Zellen durchgeführt werden. Es ist sehr wichtig, die morphologischen Veränderungen während des Differenzierungsprozesses täglich zu überprüfen.