Gold-Immunfärbung von exosomalen Schnitten: Eine Technik zur Visualisierung diagnostischer Marker im exosomalen Lumen

Exosomen sind kleine extrazelluläre Vesikel, die eine Vielzahl von Biomolekülen umschließen, die als Krebs-Biomarker dienen.

Um exosomale Biomarker sichtbar zu machen, beginnen Sie mit ultradünnen, in Harz eingebetteten exosomalen Schnitten, die auf geeigneten Metallgittern für die Elektronenmikroskopie gestützt sind. Inkubieren Sie die Gitter in Glycintropfen. Glycin bindet und neutralisiert reaktive Aldehydgruppen in den Schnitten, um deren Interferenz mit dem Assay zu überwinden.

Spülen Sie die Probe mit Wasser ab, um Reagenzienreste zu entfernen. Inkubieren Sie die Probe anschließend in einem Blockierungspuffer. Der Puffer enthält Serumproteine, die unspezifische Antikörperbindungsstellen in der Probe blockieren.

Inkubieren Sie anschließend die Probe in der gewünschten Primärantikörperlösung. Diese Antikörper erkennen und binden an ihre Ziel-Biomarker, die im exosomalen Lumen lokalisiert sind. Ungebundene Antikörper werden mit einem geeigneten Puffer abgewaschen.

Übertragen Sie nun die probentragenden Gitter in Tropfen mit goldkonjugierten Sekundärantikörpern, die an die Primärantikörper binden. Die Gold-Nanopartikel dienen als elektronendichte Marker, um die feine Lokalisierung von Zielmolekülen sichtbar zu machen. Ungebundene Sekundärantikörper werden mit einem geeigneten Puffer abgewaschen.

Zum Schluss werden die Gitter unter dunklen Bedingungen nacheinander in Uranylacetat- und Bleicitratlösungen inkubiert. Diese Schwermetallreagenzien färben und verstärken den Kontrast von organischen Molekülen wie Lipiden, Proteinen und Glykogenen in der Probe und heben sie vom Hintergrund ab.

Betrachten Sie die gefärbten Schnitte unter einem Transmissionselektronenmikroskop. Goldmarkierte Biomarker erscheinen als dunkle Partikel im Lumen von schwermetallgefärbten Exosomenstrukturen.

Inkubieren Sie zunächst Gitter mit 60 Nanometer dicken, ungefärbten Abschnitten in 50-Mikroliter-Tropfen mit 0,02 M Glycin für 10 Minuten, um die freien Aldehydgruppen zu löschen. Spülen Sie dann die Abschnitte dreimal für jeweils 10 Minuten in 100 Mikrolitern destilliertem Wasser ab. Nach dem letzten Spülen werden die Schnitte 1 Stunde lang bei Raumtemperatur in PBS mit 1 % BSA inkubiert. Inkubieren Sie dann die Gitter 1 Stunde lang in 50- bis 100-Mikroliter-Tropfen eines Anti-KRS-Antikörpers.

Waschen Sie anschließend die Gitter fünfmal für jeweils 10 Minuten in einem Tropfen PBS mit 0,1 % BSA. Übertragen Sie dann die Gitter auf einen Tropfen eines geeigneten Sekundärantikörpers und inkubieren Sie die Schnitte 1 Stunde lang bei Raumtemperatur. Waschen Sie nun die Gitter fünfmal für jeweils 10 Minuten mit einem separaten Tropfen PBS mit 0,1 % BSA. Färben Sie die Abschnitte 20 Minuten lang im Dunkeln doppelt mit 2% Uranylacetat, gefolgt von Reynolds Bleicitrat für 10 Minuten. Legen Sie den gefärbten Schnitt in ein Transmissionselektronenmikroskop und betrachten Sie die Probe mit 80 kV und bilden Sie sie mit der Mikroskopsoftware ab.

• Exosomes - Small extracellular vesicles enclosing cancer biomarkers.
• Glycine - A compound used to bind and neutralize reactive aldehyde groups.
• Blocking Buffer - A solution containing serum proteins that block non-specific antibody binding sites.
• Primary Antibody - A protein that recognizes and binds to target biomarkers in the exosomal lumen.
• Secondary Antibodies - Proteins tagged with gold-nanoparticles used to visualize primary antibodies.

• Introduce Exosomes - Definition and importance in cancer diagnosis (e.g., exosomes).
• Outline Glycine's Role - Its function in stabilizing exosomal structures (e.g., glycine).
• Explain Blocking Buffer - Serum proteins preventing unwanted reactions (e.g., blocking buffer).
• Educate on Antibody Tagging - Importance in visualizing exosomal biomarkers.

• What are exosomes and how do they serve as cancer biomarkers?
• What is the role of glycine in visualizing exosomal biomarkers?
• Why is a blocking buffer used in this process?

• Practical Application - Exosomes as diagnostic tools in cancer studies (e.g., exosome detection).
• Industry Impact - Enhancement of diagnostic accuracy in healthcare (e.g., cancer diagnostics).
• Societal Importance - Improving early detection and treatment strategies (e.g., personalized medicine).
• Scientific Advancements - Advancements in biomarker detection techniques.