Name: Exosomalen miRNA-Analyse in nicht-kleinzelligem Lungenkrebs (NSCLC) der Patienten Plasma durch qPCR: ein gangbarer Flüssiges Biopsy-Tool (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 49 s
Description: Erfahren Sie die Isolierung von Exosomen aus Patientenplasma durch doppelte enzymatische Behandlung zur Analyse von microRNA-Biomarkern bei nicht-kleinzelligem Lungenkrebs. Diese Methode ermöglicht präzise flüssige Biopsien.

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Diese Studie wurde auch durch MOCA (Multidisciplinair Oncologisch Centrum Antwerpen) Stipendium 2014 finanziert.

1. exosome Isolation Anmerkung: Die Isolierung von Exosomen aus Plasmaproben, mit einem handelsüblichen Kit durchgeführt wurde, entsprechend dem Protokoll des Herstellers und durch Zugabe von RNAse-Behandlung: (alle diese Schritte müssen mit persönlichen und Umweltschutzausrüstungen und folgende spezifische Rechts Verfahren zur Manipulation von biologischen Proben durchgeführt werden, ). <ol><li> Nehmen Sie 1 ml Plasma jeder Probe bei -80 ° C gelagert, und legen Sie es auf Eis. </li><li> Zentrifugieren Sie die Probe bei 2000 × g für 20 min bei RT; Diese Passage ist zwingend erforderlich, um Zellen und Zelltrümmer zu entfernen. </li><li> Den Überstand der sauberen Plasma in ein neues 1,5-ml-Röhrchen enthält. </li><li> Zentrifugieren Sie die neue Röhre bei 10.000 × g für 20 min bei RT. </li><li> Den Überstand der sauberen Plasma in ein neues 1,5-ml-Röhrchen enthält. </li><li> Je 100 ng / ml RNAse zu dem Überstand und Inkubieren der Röhrchen bei 37 ° C für 10 min inUm RNAs zirkulierende abzubauen. </li><li> Übertragen Sie alle das behandelte Plasma in ein neues 2-ml-Röhrchen und fügen 0,5 Volumen 1x PBS. </li><li> Vortex, um die Probe, um die Lösungen zu mischen. </li><li> 0.05 Volumina von Proteinase K - Lösung (umschließen im Kit) zur Probe. </li><li> Vortex die Probe und dann 10 min bei 37 ° C inkubieren. </li><li> In 0,2 Volumen von exosome Fällungspuffer auf die Probe und mischen Sie die Lösungen durch Umdrehen. </li><li> Inkubieren der Probe bei 2 ° C bis 8 ° C für 30 min und dann die Probe bei 10000 × g für 5 min bei RT zentrifugiert. </li><li> Absaugen und den Überstand verwerfen. Das Pellet enthält die isolierten Exosomen. </li><li> In ausgewählten Puffer zur exosome Pellet, um die Exosomen zu suspendieren. Die Auswahl des Puffers hängt von der Downstream-Analyse geplant, in diesem Fall: <ol><li> 100 l 1x PBS, um die TEM-Analyse durchzuführen. </li><li> In 346,5 ul der spezifischen Lyse buffer für die RNA-Extraktion (von kommerziellen Kit) (ACHTUNG: chemische Gefahr). </li><li> Füge 100 &amp; mgr; l Lyse-Puffer für die Proteinextraktion (Tris-HCl 50 mM pH 7,6 - NaCl 300 mM - Triton X-100 0,5% - PMSF 1 mM - Leupeptin / Aprotinin 10 &amp; mgr; g / ml), um die Western Blotting-Analyse durchzuführen. (ACHTUNG: chemische Gefahren). </li></ol></li><li> Lagern Sie die resuspendierten Exosomen bei -20 ° C. </li></ol> 2. exosome Charakterisierung durch Western-Blot-Analyse Hinweis: Um die isolierten Nanovesikeln, Western-Blot mit Antikörpern gegen ALIX und TSG101 (bekannte exosomalen Marker) wird empfohlen, zu charakterisieren. <ol><li> Nach der Resuspension des exosome Pellet in Lysepuffer, legen Sie sie auf Eis für 1 Stunde, um die exosomalen Membran aufzulösen. </li><li> Zentrifugieren Sie das Lysat bei 12.000 g für 10 min und den Überstand in ein neues Röhrchen ohne das Pellet zu stören. </li><li> Quantifizieren der Gesamt exosomalen Protein content durch Bradford-Assay oder andere Methoden und Last 50 ug Proteine ​​pro Vertiefung in einem Tris / Glycine SDS - 8% Polyacrylamidgel. (ACHTUNG: chemische Gefahren). </li><li> Trennen Sie die Proteine ​​(und eine entsprechende Molekulargewichtsmarker) in 8% SDS-PAGE-Gel-Elektrophorese mit Laufpuffer (25 mM Tris, 192 mM Glycin, 0,1% SDS) für 1 Stunde und 30 Minuten bei 120 V (ACHTUNG: chemische Gefahren ). </li><li> Übertragen, um das Protein auf eine Nitrocellulosemembran durch Elektroblotting mit 4 ° C kalten Übertragungspuffer (25 mM Tris, 192 mM Glycin, 20% Methanol) für 1 h bei konstant 50 V. (Vorsicht: chemische Gefahren). </li><li> Blockieren Sie die Membran für 1 Stunde in langsamem Rühren mit 5% fettfreie Trockenmilch in 1x TBS -Tween 0,1%. </li><li> Waschen Sie die Membran 4 mal für 5 min in schneller Bewegung mit 1x TBS - Tween 0,1%. </li><li> Fügen Sie die primären Antikörper gegen ALIX und TSG101 (einer pro-Membran) in einem geeigneten Puffer (entsprechend dem Antikörper Datenblatt des Herstellers) und Inkubation der Membran O / N; In langsamer Bewegung. </li><li> Waschen Sie die Membran 5 mal 5 min in schneller Bewegung mit 1x TBS - Tween 0,1%, um eine übermäßige Antikörper zu entfernen. </li><li> Fügen Sie den entsprechenden sekundären Antikörper in geeigneten Puffer (entsprechend dem Antikörper Datenblatt des Herstellers) und Inkubation der Membran für 1 Stunde in langsamer Bewegung. </li><li> Waschen Sie die Membran 5 mal 5 min in schneller Bewegung mit 1x TBS - Tween 0,1%, um eine übermäßige Antikörper zu entfernen. </li><li> Ermitteln Sie die ausgewählten Protein durch Chemilumineszenz - Analyse 11. </li></ol> 3. exosome Charakterisierung mit TEM-Analyse Hinweis: Um zu visualisieren wurde die isolierten Exosomen, TEM (Transmissionselektronenmikroskopie) Analyse durchgeführt. <ol><li> Platz ~ 10 &amp; mgr; g (vorher quantifiziert durch Bradford-Test) der Probe von intakten Exosomen resuspendiert in 1x PBS auf einem Parafilm und auf die Probe fallen ein Formvar Kohlenstoff beschichteten Nickelgitter für 1 Stunde. </li> &lt;li&gt; Waschen Sie das Gitter 3 Mal wurde sie auf drei 40 ul Positionierung 1x PBS fällt. </li><li> das Gitter 5 mal waschen, indem es auf fünf 30 &amp; mgr; l Reinstwasser Tropfen zu positionieren. </li><li> Fixieren Sie die Probe durch einen Rückgang von 2,5% Glutaraldehyd Zugabe (ACHTUNG: chemische Gefahr) für 10 min. </li><li> Waschen Sie das Gitter 3 mal durch die Positionierung auf drei 40 ul 1x PBS fällt. </li><li> Fügen Sie einen Tropfen von 2% Uranylacetat (ACHTUNG: chemische Gefahren) und stellen Sie das Raster auf es für 15 Minuten, um die Probe zu kontrastieren. </li><li> Einbetten der Probe auf einem Tropfen 0,13% Methylcellulose (ACHTUNG: chemische Gefahren) und 0,4% Uranylacetat und Inkubation das Gitter auf der Oberseite des Tropfens für 10 min. </li><li> das Netz für 5 min mit der beschichteten Seite nach oben Entfernen Sie vorsichtig Flüssigkeit Überschuss mit einem absorbierenden Papier und trocknen. </li><li> Untersuche das Gitter durch Transmissionselektronenmikroskop 12. </li></ol> 4. exosomalen RNA-Extraktion und Quantifizierung Hinweis: Wir haben beschlossen, perform die Gesamt-RNA-Extraktion aus exosomalen Proben, die einen kommerziellen Kits, gemäß dem Protokoll des Herstellers: (ACHTUNG: chemische Gefahren, Protokoll des Herstellers und Richtlinien zu lesen). <ol><li> Nach der Resuspension des exosome Pellet in 346,5 ul Lysepuffer, fügen 3,5 ul β-Mercaptoethanol (ACHTUNG: chemische Gefahren) und Vortex kräftig; Diese Passage ist zwingend erforderlich, um die Lipidmembranen zu zerstören. </li><li> Fügen Sie das Lysat in die Waschsäule in einem Sammelröhrchen und Zentrifuge bei 11.000 × g für 1 min. Nach der Zentrifugation verwerfen die Säule und übertragen das Filtrat in ein neues 1,5 ml RNase-freie Röhre. </li><li> In 350 &amp; mgr; l 70% Ethanol (ACHTUNG: chemische Gefahren) und mischen durch Vortexen für 5 Sek. </li><li> Laden des Lysats in das Auflösungssäule und zentrifugieren für 30 Sekunden bei 8000 × g. Nach der Zentrifugation verwerfen die Durchflußleistung und übertragen Sie die Spalte an eine neue Sammelröhrchen. </li><li> Laden Sie 350 ul Entsalzung buffer und Zentrifuge bei 11.000 × g für 1 min. die Durchflußleistung und gibt die Spalte in die gleiche Sammelröhrchen Nach der Zentrifugation verwerfen. </li><li> Hinzufügen, 95 &amp; mgr; l DNase I-Reaktionsgemisch (10 &amp; mgr; l rekonstituiert DNase I + 90 ul DNase-Puffer für jede Probe) auf der Silica-Membran der Säule und Inkubation bei RT für 15 min bei RT. (ACHTUNG: chemische Gefahr) </li><li> In 200 ul Waschpuffer (ACHTUNG: chemische Gefahr) an die Säule und Zentrifuge bei 11.000 × g für 1 min. Platzieren Sie die Säule in ein neues Sammelröhrchen. </li><li> Hinzufügen, 600 &amp; mgr; l Waschpuffer auf die Säule und Zentrifugieren bei 11.000 × g für 1 min. Durchflußleistung und legen Sie die Spalte in die gleiche Sammelröhrchen Nach der Zentrifugation verwerfen. </li><li> Nach Eintragen von 250 &amp; mgr; l Waschpuffer auf die Säule und Zentrifugieren bei 11.000 × g für 2 min. Die Säule in ein 1,5 ml RNAse-freies Röhrchen. </li><li> Eluieren der RNA in 40 ul RNAse-freies Wasser und Zentrifuge bei 11.000<html> 5; g für 1 min, um eine hohe RNA-Konzentration in diesem kleinen Volumen zu haben. </li><li> Unmittelbar eluiert RNA auf Eis legen, um potenzielle Abbau oder bei -80 ° C zu verhindern. </li><li> Quantifizierung der RNA-Gehalt. Anmerkung: Hier wurde die RNA-Quantisierung unter Verwendung von 1 &amp; mgr; l der Probe durch Spektrophotometer durchgeführt. </li></ol> 5. Retrotrascription von exosomalen miRNAs Hinweis: Durch die beschriebene begrenzte Menge miRNAs Gehalt in Exosomen, wurde beschlossen, die reverse Transkription von ausgewählten miRNAs durch einen kommerziellen Kit unter Verwendung eines einzelnen Assays für jede miRNA auszuführen, gemäß dem Protokoll des Herstellers. Für jede Probe 8 bis NSCLC Status korreliert miRNAs wurden ausgewählt (miR-30b; miR-30c; miR-103; miR-122, miR-195, miR-203; miR-221, miR-222 und miR-1228- 3p als endogene Kontrolle). <ol><li> Bereiten Sie die reverse Transkription Master-Mix (RT-Mix). Für jede Reaktion 7 &amp; mgr; l RT Mischung herzustellen, wie beschrieben inhttps://www.jove.com/files/ftp_upload/53900/Table1.xlsx&quot;&gt;Table 1 (hier klicken zum Download) (ACHTUNG: chemische Gefahr). Anmerkung: In diesem Experiment wurden 9 verschiedene RT-Mix für jede Probe hergestellt. </li><li> Vorsichtig mischen und speichern Sie die RT-Mix auf Eis. In 7 ul RT-Mix pro Reaktionsrohr. </li><li> Zugabe von 5 &amp; mgr; l Proben-RNA (10 ug Gesamt-RNA) pro Reaktionsrohr und vorsichtig mischen. </li><li> In 3 ul der 5-fach Reverse Transkription-Primer (ACHTUNG: chemische Gefahr) von jedem Test in die entsprechende Reaktionsrohr gesetzt. </li><li> Mischen Sie langsam, schließen Sie das Rohr und Inkubation auf Eis für 5 min. </li><li> Legen Sie das Reaktionsrohr in den Thermocycler und starten Sie die reverse Transkriptionsreaktion unter Verwendung der folgenden Parameterwerte (HOLD bei 16 ° C für 30 min; HOLD bei 42 ° C für 30 min; HOLD bei 85 ° C für 5 min; HOLD ∞ 4 ° C). </li></ol> 6. Real Time PCR Analyse von exosomalen miRNAs Hinweis: Diese Analyse wareiner handelsüblichen Kit für Real Time PCR (qPCR), mit drei biologischen und technischen Replikate pro Probe verwendet. <ol><li> Für jede Reaktion, bereiten 17.67 ul von Real-Time-PCR-Mix (10 &amp; mgr; l PCR Master Mix + 7,67 ul Nuklease-freies Wasser), es mischen und auf Eis gelegt. (ACHTUNG: chemische Gefahr) </li><li> 1 &amp; mgr; l für jedes PCR-Röhrchen, von 20x qPCR-Primer (ACHTUNG: chemische Gefahr). </li><li> Legen 18.67 ul der qPCR-Mix in jedem Well-Platte. </li><li> In 1,33 ul der reversen Transkription Produkt in der Korrespondent Well-Platte. </li><li> Schließen Sie die Platte und drehen Sie es (300 gx 5 sec). </li><li> Legen Sie die Platte in einer Echtzeit-PCR-System und starten Sie den Lauf der folgenden PCR-Bedingungen: Halten bei 95 ° C für 10 min; 40 Zyklen von 15 sec bei 95 ° C und 60 sec bei 60 ° C. Verfahren und Normalisieren von Daten gemäß der Formel 2 - ΔΔct 13. </li></ol>

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</ol>

Alle Autoren erklären, dass keine konkurrierenden finanziellen Interessen bestehen.

Mit diesem kombinierten Protokoll war es möglich, eine exosomalen miRNA-Analyse von Plasma von NSCLC-Patienten durchzuführen. Diese Daten können den Krankheitszustand widerspiegeln, aber dies muss durch weitere Untersuchungen bestätigt werden. Das Protokoll in diesem Artikel verwendet wurde, auf einem kommerziellen Kit für exosome Isolation basiert. Der Grund war , dass die anderen bekannten Isolierungsverfahren (z. B. Dichtegradient Ultrazentrifugation) erfordern manuelle Verfahren...

Die geringe Überlebensrate bei NSCLC (nicht-kleinzelligem Lungenkrebs) Patienten ist vor allem aufgrund der begrenzten Wirksamkeit von Behandlungen in fortgeschrittener Krankheit und schlechte Früherkennung 1. Aktivierende Mutationen in dem EGFR - Gen, das in einer Subpopulation von NSCLC - Patienten gefunden wurden, sind dafür bekannt , die Empfindlichkeit zu verleihen Kinaseinhibitoren zu Tyrosin (TKI). Leider entwickeln die Mehrheit der EGFR - mutierten NSCLC - Patienten TKI Widerstand 2. Gerade in diesem Zusammenhang ist eine korrekte Diagnose ist obligatorisch. In der Regel aufgrund Lokalisation von Tumoren, Biopsiegewebe bei NSCLC erhalten, ist nicht immer möglich. Daher sind mehrere Studien laufen, die nicht-invasive Methoden verwenden diese biologischen Daten zu erhalten. Exosomen sind als flüssige Biopsie Komponenten beschrieben , die untersucht werden , könnten drei diagnostische und prognostische Werte mit nicht-invasiven Techniken zu erhalten. Exosomen sind Nanovesikeln (40-100 nm Durchmesser) von endocytic Ursprungs , die von 4 verschiedenen Zelltypen sowohl in physiologischen und pathologischen Bedingungen freigesetzt werden. Sie können Protein, Lipide, mRNA und microRNA tragen. Außerdem lassen sich mehrere Studien eine pleiotrope Rolle von Tumor abgeleitet Exosomen, das Wachstum und das Überleben von Tumorzellen beeinflussen können, Angiogenese, Stroma- und extrazelluläre Matrix Remodeling und drug resistance 5. MicroRNAs (miRNAs) sind kurze nicht-codierende RNA , die in post-transkriptionalen Regulation beteiligt sind, die Bindung des 3&#39;-UTR der Ziel - mRNAs und führt die mRNA zu einem Abbau oder zu einer nicht-Übersetzung 6. Selektive Sortierung von miRNAs in Exosomen beschrieben wurde. In diesem Zusammenhang wurde kürzlich gezeigt, in vitro und in vivo eine selektive Verpackung von miR-21 (einem bekannten miRNA mit onkogenen Effekte) in Exosomen von chronischer myeloischer Leukämie - Zelllinien nach Curcumin Behandlung 7 freigegeben. Dasexosomalen miRNA Profil ist ähnlich dem miRNA - Profil des Primärtumors und dieses Merkmal kann 3 in frühen Diagnose und Prognose ausgenutzt werden. Genauer gesagt, besteht eine Möglichkeit , zu charakterisieren, durch Echtzeit - PCR, ausgewählt miRNAs mit dem molekularen Profil der Krankheit korreliert, z. B., EGFR - Mutationen unter anderem 8. Hier ist die Analyse einer ausgewählten Gruppe von NSCLC-korrelierten miRNAs 8-9 beschrieben , die von Exosomen isoliert wurden im Blut von NSCLC - Patienten veröffentlicht. Nach Erhalt der Zustimmung Bericht von den Patienten, Plasma von 12 NSCLC-Patienten und 6 gesunden Kontrollen wurden analysiert informieren. Die exosome Isolierung wurde mit kommerziellen Kits durchgeführt nach dem Protokoll des Herstellers. Bevor exosome Isolierung Plasmaproben wurden mit RNAse behandelt, um miRNAs Verunreinigung zirkulierende abzubauen. Wir entschieden uns, diese Analyse mit einem kommerziellen Kit zur Durchführung aufgrund der begrenzten Standardisierung der anderen techniques (z. B. Ultrazentrifugieren) was besonders wichtig ist , wenn es mit klinischen Proben arbeiten. Dieses Kit enthält eine Proteinase K-Behandlung, die die RNAse abgebaut wird, und verringert somit das Risiko exosomalen miRNAs nach exosome Lyse abzubauen. MicroRNA-Analyse wurde durch sensitive und spezifische Real-Time PCR-Analyse durchgeführt; mir-1228-3p wurde als endogene Kontrolle verwendet und die Daten wurden normalisiert , gemäß der Formel 2 - ΔΔct. Die Kontrollwerte werden als Basislinie verwendet und die Ergebnisse werden in einer logarithmischen Skala dargestellt.

<table><tbody><tr><td>Vollständiges Exosomen-Isolationskit (aus Plasma)</td><td> Invitrogen</td><td>4484450</td><td>Anwendung Proteinase K-Behandlung</td></tr><tr><td>Ribonuklease A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R4875-100MG</td><td></td></tr><tr><td>ALIX Antikörper (3A9)</td><td>Cell Signaling</td><td>2171S</td><td></td></tr><tr><td>TSG-101 Antikörper (C-2)</td><td>SantaCruz Biotecnology</td><td>SC-7964&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Maus HRP 1 ml&nbsp; &nbsp;</td><td>Cell Signaling</td><td>7076P2</td><td></td></tr><tr><td>RNAspin Illustra Mini-Kit 50</td><td>GE HealthCare</td><td>25-0500-71</td><td></td></tr><tr><td>Taqman MicroRNA Reverse Transkriptionskit</td><td>Life Technologies</td><td>4366596</td><td></td></tr><tr><td>has-miR-1228-3p TaqMan MicroRNA-Assay</td><td>Life Technologies</td><td>002919</td><td></td></tr><tr><td>has-miR-30b TaqMan MicroRNA-Assay</td><td>Life Technologies</td><td>000602</td><td></td></tr><tr><td>has-miR-30c TaqMan MicroRNA-Assay</td><td>Life Technologies</td><td>000419</td><td></td></tr><tr><td>has-miR-122 TaqMan MicroRNA-Assay</td><td>Life Technologies</td><td>002245</td><td></td></tr><tr><td>has-miR-195 TaqMan MicroRNA-Assay</td><td>Life Technologies</td><td>000494</td><td></td></tr><tr><td>has-miR-203 TaqMan MicroRNA-Assay</td><td>Life Technologies</td><td>000507</td><td></td></tr><tr><td>has-miR-103 TaqMan MicroRNA-Assay</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td>000439</tr><tr><td>has-miR-221 TaqMan MicroRNA Assay</td><td>Life Technologies</td><td>000524</td><td></td></tr><tr><td>has-miR-222 TaqMan MicroRNA Assay</td><td>Life Technologies</td><td>002276</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Universal Master Mix II, ohne UNG</td><td>Life Technologies</td><td>4440043</td><td></td></tr></tbody></table>

exosomalen mirna-analyse in nicht-kleinzelligem lungenkrebs (nsclc) der patienten plasma durch qpcr: ein gangbarer flüssiges biopsy-tool

Exosomal miRNA Analysis in Non-small Cell Lung Cancer (NSCLC) Patients' Plasma Through qPCR: A Feasible Liquid Biopsy Tool

Die Entdeckung von Veränderungen in den EGFR- und ALK-Genen, unter anderem, bei NSCLC hat die Entwicklung einer zielgerichteten medikamentösen Therapie mit selektiven Tyrosinkinase-Inhibitoren (TKIs) vorangetrieben. Um den Einsatz dieser TKIs zu optimieren, ist die Entdeckung neuer Biomarker für die Früherkennung und den Krankheitsverlauf zwingend erforderlich. Diese plasmaisolierten Exosomen können als nicht-invasive und wiederholbare Methode zum Nachweis und zur Nachverfolgung dieser Biomarker verwendet werden. Als Exosomenquelle wurde ein ml Plasma von 12 NSCLC-Patienten mit unterschiedlichen Mutationen und Behandlungen (und 6 gesunden Spendern als Kontrollen) verwendet. Nach der RNASE-Behandlung wurden die Exosomen zum Abbau zirkulierender miRNAs mit einem kommerziellen Kit isoliert und zur weiteren Analyse in spezifischen Puffern resuspendiert. Die Exosomen wurden durch Western-Blotting für ALIX und TSG101 und durch Transmissionselektronenmikroskopie (TEM)-Analyse charakterisiert, die Standardtechniken zur Gewinnung biochemischer und dimensionaler Daten dieser Nanovesikeln. Die Gesamt-RNA-Extraktion wurde mit einem kommerziellen Kit mit hoher Ausbeute durchgeführt. Aufgrund des begrenzten miRNA-Gehalts in den Exosomen haben wir uns entschieden, eine Retrotranskriptions-PCR mit einem individuellen Assay für jede ausgewählte miRNA durchzuführen. Eine Reihe von miRNAs (30b, 30c, 103, 122, 195, 203, 221, 222), die alle mit der NSCLC-Erkrankung korrelierten, wurden unter Ausnutzung der bemerkenswerten Sensitivität und Spezifität der Real-Time-PCR-Analyse analysiert; Als endogene Kontrolle wurde mir-1228-3p verwendet und die Daten wurden nach der Formel 2-ΔΔct 13 verarbeitet. Die Kontrollwerte wurden als Ausgangswert verwendet, und die Ergebnisse sind in logarithmischer Skala dargestellt.

Insgesamt 12 Plasma von NSCLC-Patienten und 6 gesunden Kontrollen wurden mit im Handel erhältlichen Kits für exosome Isolierung von Plasma verarbeitet. Jede Probe wurde durch Western-Blot-Analyse verarbeitet, um die exosomalen Marker ALIX (96 kDa) und TSG101 (43 kDa) zu bewerten. Ein Beispiel dieser Ergebnisse ist für 3 Proben in 1 gezeigt , die anzeigt , dass exosome Isolierung von Plasmaproben , die mit diesem Protokoll möglich ist. <p class="jove_content" fo:keep-...

Dieses Protokoll beschreibt die Machbarkeit, miRNA-Profiling in Exosomen, die im Plasma von NSCLC-Patienten freigesetzt werden, durch ein kommerzielles Exosomen-Isolationskit mit Proteinase K- und RNAse-Behandlungen durchzuführen, um eine Kontamination mit zirkulierenden miRNAs zu vermeiden und ihre Biomarker-Eigenschaften bei NSCLC zu bewerten.

Exosomalen miRNA-Analyse in nicht-kleinzelligem Lungenkrebs (NSCLC) der Patienten Plasma durch qPCR: ein gangbarer Flüssiges Biopsy-Tool

The discovery of alterations in the EGFR and ALK genes, amongst others, in NSCLC has driven the development of targeted-drug therapy using selective ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Exosome aus dem Plasma von NSCLC-Patienten zu isolieren, die frei von nicht-exosomalen mikro-RNA-Quellen wie frei zirkulierender mikro-RNase sind, indem vor der Exosomisolierung eine doppelte enzymatische Behandlung durchgeführt wird. Diese Methode kann die Analyse von mikro-RNA-Liquid Biopsies im Exosomkompartiment unterstützen und somit zur Klärung ihres Einsatzes als Biomarker beitragen. Der Hauptvorteil dieses Verfahrens liegt in der enzymatischen Vorbehandlung, die nicht-exosomale Quellen von mikro-RNA beseitigt, die die Analyse stören könnten.Um zu beginnen, tauen Sie eine 1 mL große Plasma probe auf Eis auf. Nach dem Auftauen invertieren Sie das Röhrchen mehrmals, um eventuell gebildete Kryopräzipitate aufzulösen. Anschließend zentrifugieren Sie das Plasma 20 Minuten lang bei Raumtemperatur mit 2.000 G, um Zellen und Zelltrümmer zu entfernen.Sammeln Sie den Überstand und zentrifugieren Sie das Plasma erneut, diesmal 20 Minuten bei 10.000 G. Sammeln Sie erneut den plasmatischen Überstand und geben Sie nun 10 Mikroliter RNase hinzu. Inkubieren Sie das Plasma 10 Minuten bei 37 Grad Celsius in einem Thermoblock-Heizgerät.Wir fügten dem Standard-Schlüsselprotokoll den RNase-Behandlungsschritt hinzu, um freie mikro-RNasen abzubauen. Anschließend wurde der Proteinase-K-Schritt, der im Schlüsselprotokoll enthalten ist, genutzt, um RNA-Assays abzubauen und die Integrität der exosomalen mikro-RNasen zu schützen. Danach das Plasma in ein neues Röhrchen überführen, die halbe Menge von 1x PBS hinzufügen und kurz vortexen.Dann 0,05 Volumina Proteinase-K-Lösung hinzufügen, die Probe erneut verwirbeln und 10 Minuten bei 37 Grad Celsius inkubieren. Nun 0,2 Volumina Exosomen-Fällungspuffer hinzufügen und die Probe durch Umstülpen mischen. Anschließend die Probe 30 Minuten bei vier Grad Celsius inkubieren.Nach der kalten Inkubation die Probe bei Raumtemperatur fünf Minuten lang bei 10.000 G zentrifugieren. Einen 20 bis 50 Mikroliter großen Aliquot des Überstandes entnehmen und zu Kontrollzwecken aufbewahren. Anschließend den restlichen Überstand abpipettieren und verwerfen.Suspendieren Sie das Exosomen-Pellet in einem Puffer Ihrer Wahl in einem Volumen, das von der geplanten nachgeschalteten Analyse abhängt. Für die RNA-Analyse geben Sie einen spezifischen Lysepuffer zur RNA-Extraktion hinzu. Bevor Sie beginnen, reinigen Sie den Arbeitsbereich und die dazugehörigen Gegenstände mit geeigneten Reagenzien, um eine RNase-freie Umgebung sicherzustellen.Bereiten Sie Ihre Reverse-Transkriptions-Master-Mix gemäß den Anweisungen des Herstellers vor. In diesem Beispiel werden zwei Proben verarbeitet. Für jede Probe werden neun Aliquots des Master-Mix mit je sieben Mikrolitern hergestellt, jeweils einer für jedes ausgewählte mikro-RNA.Die Reaktionsgefäße auf Eis lagern. Nun fünf Mikroliter Exosomen-RNA-Lösung mit einer Gesamt-RNA-Konzentration von 10 Mikrogramm zu jedem Reaktionsgefäß hinzufügen. Die Proben durch vorsichtiges Pipettieren mischen.Fügen Sie dann drei Mikroliter des entsprechenden Reverse-Transkriptionsprimers zu jedem Reaktionsröhrchen hinzu und mischen Sie die Proben vorsichtig durch Pipettieren. Lassen Sie sie fünf Minuten auf Eis inkubieren, bevor Sie fortfahren. Nun können die Reaktionsröhrchen in den Thermocycler gegeben werden.Führen Sie die Reaktionszyklen gemäß den Anforderungen des Herstellers durch. In diesem Verfahren muss jede mikro-RNase für jeden Patienten dreifach getestet werden. Dies beinhaltet die Durchführung von Triplikaten für die negativen Kontrollen.Stellen Sie sicher, dass mindestens eine Referenz-Mikro-RNA zur ordnungsgemäßen Normalisierung der Daten einbezogen wird, da kein Konsens hinsichtlich stabil exprimierter zirkulierender Mikro-RNAsen besteht. Zuvor erhaltene kandidatenbasierte Mikro-RNAsen können als Referenz verwendet werden. Beginnen Sie mit der Herstellung des PCR-Gemischs.Stellen Sie eine Mischung für jede Mikro-RNA her, die analysiert werden soll. Lagern Sie die Reagenzien und Primer geschützt vor Licht auf Eis, bis sie verwendet werden. Für jedes PCR-Loch bereiten Sie 10 Mikroliter PCR-Mastermix zum Auffüllen vor.Mit 7,67 mL nukleasefreiem Wasser und einem Mikroliter PCR-Primer die Volumina entsprechend der Anzahl der benötigten Vertiefungen auf der Platte sowie etwas Überschuss anreichern. Geben Sie nun 18,67 Mikroliter der vorbereiteten Mischungen in die entsprechenden Plattenvertiefungen. Fügen Sie anschließend 1,33 Mikroliter des geeigneten reversen Transkriptionsreaktionsprodukts in die entsprechende Plattenvertiefung hinzu, sodass jede Vertiefung 20 Mikroliter enthält.Fügen Sie für die Negativkontrollgefäße 1,33 µL Wasser hinzu. Schließen Sie nun die Platte und zentrifugieren Sie sie einige Sekunden lang in einem Plattenspinner bei 300 × g. Weisen Sie mithilfe der Echtzeit-PCR-Software in der Vorlage die Reporter zu, weisen Sie die Zielgene zu, definieren Sie die Reaktionsvolumina und legen Sie die Experimentgefäße fest.Beladen Sie nun die Platte in einen Thermocycler und definieren Sie die Reaktionsparameter gemäß den Angaben des Herstellers. Nach Abschluss des Laufs exportieren Sie die Daten einschließlich der CT-Werte in eine Tabellenkalkulation zur Analyse. Zwölf Plasma-Proben von NSCLC-Patienten und sechs gesunde Kontrollen wurden wie beschrieben verarbeitet.Exosomenmarker wurden mittels Western Blot analysiert. Die mit Exosomen assoziierten Marker ALIX und TSG101 waren in den Proben nachweisbar. Zur biophysikalischen Charakterisierung der Proben wurde eine TEM-Analyse durchgeführt.Runde Vesikel wurden im Bereich von 40 bis 100 Nanometern gefunden. Acht Mikro-RNAs, die in verschiedenen Modellen als bei NSCLC dereguliert beschrieben wurden, wurden mittels RT-PCR analysiert. Die innere Kontrolle mir-1228 wurde als stabile endogene Kontrolle in einem anderen Probenkollektiv validiert.Es wurde festgestellt, dass die analysierten mikro-RNAs in den klinischen Proben von Lungenkrebspatienten im Vergleich zu Kontrollen dereguliert sind. Dieses Protokoll ermöglicht die Analyse exosomal assoziierter mikro-RNasen aus Plasma­proben, wobei andere Kompartimente vermieden werden, die die Analyse stören könnten. Wir empfehlen Ihnen, das aufbewahrte Überstandsaliquot als Kontrolle zu verwenden, um die Effizienz der enzymatischen Behandlung zu überwachen.Flüssigbiopsien sind bei Krebserkrankungen, insbesondere beim Lungenkrebs, sehr wichtig, da mehrere ihrer Bestandteile wie zirkulierende Tumorzellen (CTC) oder freie DNA nicht nur derzeit, sondern auch zur Nachbetreuung von Patienten verwendet werden. Exosomen stellen eine neue Komponente dieser Flüssigbiopsien dar und weisen wichtige pleiotrope Aktivitäten auf. Eine davon ist beispielsweise die direkte Resistenz.Ich lade Sie ein, sich dieses Video anzusehen, um Ihre Exosome in Ihrem eigenen Labor auszuwählen und zu charakterisieren. Vielen Dank fürs Zuschauen.

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