Exosomalen miRNA-Analyse in nicht-kleinzelligem Lungenkrebs (NSCLC) der Patienten Plasma durch qPCR: ein gangbarer Flüssiges Biopsy-Tool

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, Exosomen im Plasma von NSCLC-Patienten zu isolieren, die frei von nicht-exosomalen Mikro-RNA-Quellen wie frei zirkulierenden Mikro-RNAs sind, und zwar durch eine doppelte enzymatische Behandlung vor der Exosomenisolierung. Diese Methode kann bei der Analyse von Mikro-RNA-Lipidbiopsien im Exosomenkompartiment helfen, was dazu beitragen wird, ihre Verwendung als Biomarker aufzuklären. Der Hauptvorteil dieses Verfahrens ist die enzymatische Vorbehandlung, die nicht-exosomale Quellen von microRNA eliminiert, die die Analyse beeinträchtigen könnten.

Um mit dem Auftauen zu beginnen, wird eine Plasmaprobe von einem ml auf Eis aufgetaut. Nach dem Auftauen das Röhrchen mehrmals umdrehen, um eventuell gebildete Kryopräzipitate zu disaggregieren. Dann zentrifugieren Sie das Plasma bei 2.000 g für 20 Minuten bei Raumtemperatur, um Zellen und Ablagerungen zu entfernen.

Sammeln Sie den Überstand und zentrifugieren Sie das Plasma erneut, jetzt bei 10.000 G für 20 Minuten. Sammeln Sie erneut den Plasmaüberstand und fügen Sie nun 10 Mikroliter RNase hinzu. Inkubieren Sie das Plasma bei 37 Grad Celsius für 10 Minuten in einer Thermoblockheizung.

Wir haben den RNase-Behandlungsschritt zum Standardschlüsselprotokoll hinzugefügt, um freie microRNAse abzubauen. Später wurde der Proteinase-Schlüsselbehandlungsschritt einschließlich des Schlüsselprotokolls genutzt, um RNA-Assays abzubauen und die Integrität der exosomalen Mikro-RNAse zu schützen. Übertragen Sie dann das Plasma in ein neues Röhrchen, fügen Sie ein halbes Volumen 1x PBS hinzu und wirbeln Sie es vortexen.

Geben Sie dann 0,05 Volumen Proteinase-Gehäuselösung hinzu, wirbeln Sie die Probe erneut vor und inkubieren Sie sie 10 Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Fügen Sie nun 0,2 Volumen Exosomen-Fällungspuffer hinzu und mischen Sie die Probe durch Inversion. Anschließend wird die Probe 30 Minuten lang bei vier Grad Celsius inkubiert.

Nach der Kaltinkubation wird die Probe bei 10.000 g fünf Minuten lang bei Raumtemperatur zentrifugiert. Entnehmen Sie ein Aliquot von 20 bis 50 Mikrolitern des Überstands und lagern Sie es zu Kontrollzwecken. Aspirieren Sie dann den restlichen Überstand und verwerfen Sie ihn.

Resuspendieren Sie das Exosom-Pellet in einem Puffer Ihrer Wahl in einem Volumen, das von der nachgeschalteten Analyse abhängt. Für die RNA-Analyse fügen Sie einen spezifischen Lysepuffer für die RNA-Extraktion hinzu. Reinigen Sie vor Beginn des Beginns den Arbeitsbereich und die zugehörigen Elemente mit den richtigen Reagenzien, um eine RNAse-freie Umgebung zu gewährleisten.

Bereiten Sie Ihren Reverse-Transkriptions-Mastermix gemäß den Anweisungen des Lieferanten vor. In diesem Beispiel werden zwei Beispiele verarbeitet. Für jede Probe werden neun Mastermix-Aliquots von sieben Mikrolitern hergestellt, eines für jede ausgewählte Mikro-RNA

Lagern Sie die Reaktionsgefäße auf Eis. Geben Sie nun fünf Mikroliter exosomale RNA-Lösung in jedes Reaktionsröhrchen mit einer Gesamt-RNA-Konzentration von 10 Mikrogramm. Mischen Sie die Proben durch vorsichtiges Pipettieren.

Geben Sie dann drei Mikroliter des entsprechenden Reverse-Transkriptions-Primers in jedes Reaktionsröhrchen und mischen Sie die Proben vorsichtig durch Pipettieren. Lassen Sie sie fünf Minuten lang auf Eis inkubieren, bevor Sie fortfahren. Nun können die Reaktionsgefäße in den Thermocycler geladen werden.

Führen Sie die Reaktionszyklen entsprechend den Anforderungen der Lieferanten durch. Bei diesem Verfahren müssen alle microRNAse für jeden Patienten in dreifacher Ausfertigung getestet werden. Dazu gehört auch das Ausführen von Triple-Plikaten für die Negativkontrollen.

Stellen Sie sicher, dass Sie mindestens eine Referenz-microRNA einbeziehen, um die Daten richtig zu normalisieren, da es keinen Konsens für stabil exprimierte zirkulierende microRNAse gibt. Zuvor erhaltene Kandidaten-microRNAse können als Referenz verwendet werden. Beginnen Sie mit der Vorbereitung des PCR-Mixes.

Stellen Sie eine Mischung für jede Mikro-RNA her, die bewertet werden soll. Lagern Sie die Reagenzien und Primer bis zu ihrer Verwendung lichtgeschützt auf Eis. Bereiten Sie für jede PCR-Vertiefung die Beladung von 10 Mikrolitern PCR-Mastermix vor.

Mit 7,67 ml nukleasefreiem Wasser und einem Mikroliter PCR-Primer eskalieren Sie diese Volumina auf die Anzahl der Vertiefungen, die zum Befüllen der Platte mit etwas mehr benötigt werden. Laden Sie nun 18,67 Mikroliter der vorbereiteten Mischungen in die entsprechenden Plattenvertiefungen. Geben Sie dann 1,33 Mikroliter des entsprechenden Produkts der reversen Transkriptionsreaktion in die entsprechende Plattenvertiefung und füllen Sie jede Vertiefung auf 20 Mikroliter.

Für die Negativkontrollvertiefungen werden 1,33 Mikroliter Wasser zugegeben. Nun verschließen Sie die Platte und zentrifugieren Sie sie in einem Plattenschleuder für einige Sekunden bei 300 G. Weisen Sie mit der Echtzeit-PCR-Software in der Vorlage die Reporter zu, weisen Sie die Zielgene zu, definieren Sie die Reaktionsvolumina und setzen Sie die Experimentvertiefungen.

Laden Sie nun die Platte in einen Thermocycler und definieren Sie die Reaktionsparameter nach den Vorgaben der Lieferanten. Sobald der Lauf abgeschlossen ist, exportieren Sie die Daten einschließlich der CT-Werte zur Analyse in eine Tabelle. Zwölf Plasmaproben von NSCLC-Patienten und sechs gesunden Kontrollen wurden wie beschrieben verarbeitet.

Die Exosomenmarker wurden mittels Western Blot analysiert. Die mit den Exosomen verknüpften Marker ALIX und TSG101 waren in den Proben vorhanden. Zur biophysikalischen Charakterisierung der Proben wurde eine TEM-Analyse durchgeführt.

Es wurden runde Vesikel mit einer Größe von 40 bis 100 Nanometern gefunden. Acht Mikro-RNAs, die in verschiedenen Modellen als dereguliert bei NSCLC beschrieben wurden, wurden mittels RTPCR analysiert. Die interne Kontrolle mir 1228 wurde in einem anderen Stichprobensatz als stabile endogene Kontrolle validiert.

Es zeigte sich, dass die analysierten microRNAs in den klinischen Proben der Lungenkrebspatienten im Vergleich zu den Kontrollen dereguliert sind. Dieses Protokoll ermöglicht die Analyse exosomaler verwandter microRNAse aus Plasmaproben, wodurch andere Kompartimente vermieden werden, die Ihre Analyse beeinträchtigen könnten. Wir empfehlen Ihnen, den gelagerten Überstand aliquot als Kontrolle zu verwenden, um die Wirksamkeit der enzymatischen Behandlung zu überwachen.

Flüssigbiopsien sind bei Krebs sehr wichtig, insbesondere bei Lungenkrebs, da einige der Komponenten wie CTC oder freie DNA nicht nur heute, sondern auch für die Nachsorge bei Patienten verwendet werden. Exosomen sind die neue Komponente dieser Flüssigbiopsien mit wichtigen pleotropen Aktivitäten. Eine davon ist zum Beispiel der direkte Widerstand.

Ich lade Sie ein, sich dieses Video anzusehen, um Ihre Exosomen in Ihrem eigenen Labor auszuwählen und zu charakterisieren. Danke für das Aufpassen.