Zelltod-Screening mittels DAPI-Färbung: Eine Methode zum schnellen Screening des IR-induzierten klonogenen Zelltods in krebsartigen Zelllinien

Die Exposition gegenüber ionisierender Strahlung wie Röntgenstrahlen kann DNA-Schäden verursachen, die schließlich zum Zelltod führen. Um die Wirkung ionisierender Strahlung auf das Zelltodprofil zu untersuchen, nehmen Sie zunächst eine Kulturschale mit adhärenten Krebszellen, die über die Oberfläche eines Deckglases gelegt wird.

Bestrahlen Sie die Kulturschale für die gewünschte Dauer mit Röntgenstrahlen. Diese Behandlung verursacht DNA-Schäden im Inneren der Zellen. Aspirieren Sie anschließend das verbrauchte Medium aus der Kulturschale und fügen Sie ein geeignetes Fixiermittel hinzu. Diese Lösung durchdringt die Zellen und fixiert die zellulären Komponenten während der nachfolgenden Färbeschritte.

Entsorgen Sie die Fixierlösung. Entfernen Sie das Deckglas mit röntgenbehandelten Zellen aus der Kulturschale. Drehen Sie das Deckglas um und legen Sie es auf die Oberfläche eines Objektträgers, über dem sich ein Tropfen DAPI-Fleck befindet, so dass die Zellen in direktem Kontakt mit DAPI stehen.

Die DAPI-Moleküle dringen in die Zellkerne ein und binden an die A-T-reichen Stellen der DNA. Visualisieren Sie nun die Zellen unter einem Fluoreszenzmikroskop. Die Kerne erscheinen blau und weisen unterschiedliche Morphologien auf.

Die Zellen mit kondensierten und fragmentierten Zellkernen sind ein Hinweis auf Apoptose, den programmierten Zelltod. Andere, die mehrlappige Kerne aufweisen, deuten darauf hin, dass die Zellen eine mitotische Katastrophe erleben. Diejenigen mit abgeflachten Kernen, die mehrere helle Flecken aufweisen, deuten auf Zellen hin, die sich in einer Seneszenz befinden.

Entnehmen Sie die Zellen aus dem Inkubator und aspirieren Sie das Kulturmedium aus der Kulturschale. Schneiden Sie die Spitze einer 1.000-Mikroliter-Mikropipettenspitze mit einer Schere etwa 5 Millimeter vom Ende entfernt ab und geben Sie damit 1 Milliliter Fixierlösung in die Kulturschale.

Tragen Sie die Fixierlösung entlang der Wände der Kulturschale auf, um die Schädigung der Zellen zu minimieren. Füllen Sie dann diese Kulturschale in eine quadratische Kulturschale und schütteln Sie sie vorsichtig, um die Fixierlösung gleichmäßig auf dem Deckglas zu verteilen. Danach das Gericht 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.

Aspirieren Sie die Fixierlösung aus der Schale. Fügen Sie nun 2 Milliliter PBS entlang der Wände der Schale hinzu und aspirieren Sie dann das PBS. Zur Vorbereitung der DAPI-Färbung geben Sie 5 Mikroliter DAPI-Färbereagenz auf einen Objektträger. Entfernen Sie dann das Deckglas mit einem Skalpell von der Schale und lassen Sie überschüssiges PBS auf dem Deckglas abtropfen, indem Sie den Rand des Deckglases mit einem Papiertuch berühren.

Montieren Sie nun das Deckglas kopfüber auf den Tropfen des DAPI-Färbereagenzes auf dem Objektträger, so dass die Zellen dem DAPI-Färbereagenz ausgesetzt sind. Untersuchen Sie abschließend die gefärbten Zellen unter einem Fluoreszenzmikroskop, das mit einem DAPI-Filter ausgestattet ist.