Name: Der Nachweis von Inter-chromosomale Stable Abberationen durch Mehrfachfluoreszenz In Situ Hybridisierung (MFISH) und Spektrale Karyotypisierung (SKY) in Bestrahlte Mäuse (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 14 s
Description: Erfahren Sie den Nachweis interchromosomaler stabiler Aberrationen in bestrahlten Mäusen mittels mFISH und SKY. Diese Methode ermöglicht die visualisierte Analyse genetischer Schäden in Knochenmarkzellen.

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Diese Studie wurde von Arkansas Raum Grants Consortium und National Space Biomedical Research Institute durch National Aeronautics and Space Administration unterstützt wurde, gewährt NNX15AK32A (RP) und RE03701 (MH-J) und P20 GM109005 (MH-J) und die US Veterans Administration ( MH-J). Wir danken Christopher Fettes, Programm-Koordinator für die Abteilung für Umwelt- und Arbeitsmedizin an der University of Arkansas for Medical Sciences, für redaktionelle Unterstützung bei der Vorbereitung des Manuskripts.

Alle Tierversuche wurden in strikter Übereinstimmung mit den Empfehlungen im Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren der National Institutes of Health durchgeführt. Das Tier Protokoll wurde von der Institutional Animal Care und Use Committee der University of Arkansas for Medical Sciences genehmigt. 15 Stundentakt von frischer Luft und den freien Zugang zu Standard-Nagerfutter und Wasser - Alle Tiere wurden mit 10 bei 20 ± 2 ° C unter Standard klimatisierten Tieranlage untergebracht. Bei der Ankunft wurden die Mäuse für 1 Woche in Quarantäne gehalten und zertifiziertes Nagerfutter zur Verfügung gestellt. 1.Radiation Belichtung und In - vivo - Arrest von Metaphasezellen <ol><li> Expose un-narkotisierten Mäusen 2 Gy Ganzkörperbestrahlung in einer Bestrahlungskammer. Während der Bestrahlung statt Mäuse in einem gut belüfteten Aufnahmekammer sicherstellen, dass sie sich nicht frei bewegen und eine einheitliche Dosis erhalten. </li><li> Inject 100 ul von 0,05% Colchicin-Lösung (colchicine Pulver Calcium und Magnesium-freiem PBS gelöst in) intraperitoneal unter Verwendung einer 25 G Nadel befestigt mit 1 ml Einwegspritze. Vermeiden Sie direkte Injektion in jedem Organ. </li><li> Lassen Sie das Tier in den Käfig für 2 h vor Knochenmarkzellernte. Beobachten Sie das Tier auf Anzeichen von Schmerzen oder Leiden. </li></ol> 2. Knochenmarkzellernte und Isolierung von Knochenmark mononukleären Zellen durch Dichtegradientenzentrifugation <ol><li> Euthanize die Maus durch CO 2 Ersticken. </li><li> Spray 70% Ethanol auf der dorsalen und ventralen Seite. </li><li> Machen Sie eine 2 cm lange Inzision auf der Bauchhaut mit einer scharfen Schere. Fassen Sie die Haut auf beiden Seiten des Einschnitts mit stumpfen Pinzette und ziehen Sie vorsichtig die Bauchmuskeln zu öffnen. </li><li> Schneiden Sie sowohl die Hinterbeine mit einer Schere und sofort legen Sie sie in vorgekühlte PBS mit 4% FBS. </li><li> sorgfältig reinigen, alle an den hinteren Gliedmaßen mit einem scharfen Rasierklinge und Baumwolle Mullbinde ansetzenden Muskeln. </li><li> Trennen Sie die Tibia vom Femur. Schneiden Sie die beiden Spitzen jedes Knochen mit einer Rasierklinge. </li><li> Spülen des Inhalts des Knochenmarks mit 3 ml PBS (mit 4% FBS) unter Verwendung einer 23 G-Nadel an einer 3 ml Spritze und sammeln den Inhalt in ein 15 ml Zentrifugenröhrchen. Übergeben Sie die Zellsuspension mindestens 10 Mal durch die Nadel eine Einzelzellsuspension zu machen. </li><li> Overlay sorgfältig die Zellsuspension auf einem gleichen Volumen von Lymphozytentrennmedium (3 ml), ohne die Schnittstelle zwischen der Zellsuspension und Lymphozyten-Separationsmedium zu stören. Zentrifuge bei 400 × g für 30 min bei Raumtemperatur. </li><li> Sammeln Sie die Leukozytenmanschette vorsichtig, ohne zu stören die anderen Schichten und die Übertragung in einem neuen 15 ml Zentrifugenröhrchen. </li></ol> 3. Herstellung von Metaphase Zelle Aufstriche <ol><li> 10 mL PBS auf das Rohr die buffy coat enthält. </li><li> Zentrifuge bei 400 × g für 5 min bei Raumtemperatur. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig den Überstand. Dann brechen ter Pellet mit leichtes Klopfen Zelle und 10 ml PBS hinzufügen. </li><li> Zentrifuge bei 400 × g für 5 min bei Raumtemperatur. </li><li> Entfernen Sie den Überstand ohne das Zellpellet zu stören, brechen das Pellet auf, und 4 ml vorgewärmten hypotone 0,075 M Kaliumchloridlösung. In hypotone Lösung tropfenweise mit sanften konstantem Schütteln. </li><li> Inkubiere Zellen für 20 min bei 37 ° C in einem Wasserbad. </li><li> Nach dem hypotonischer Behandlung, ein gleiches Volumen (4 ml) Fixiermittel (Methanol: Eisessig, 3: 1 v / v) vorsichtig in den 15 ml-Röhrchen und mischen Sie den Schlauch durch Umkehren. </li><li> Zentrifuge bei 400 xg für 5 min bei Raumtemperatur und den Überstand verwerfen. </li><li> Brechen Sie das Zellpellet mit von sanften Wirbel für ein paar Sekunden, gefolgt tippen und 3 ml Fixierungslösung tropfenweise mit konstantem Schütteln. </li><li> Inkubieren für 30 min bei Raumtemperatur und dann bei 400 xg für 5 min zentrifugieren. </li><li> Entfernen Sie den Überstand, brechen die Zellpellet mit gent uple tippen und 3 ml frisches Fixiermittel. </li><li> Zentrifuge bei 400 xg für 5 min bei Raumtemperatur, und entfernen Sie den Überstand. Brechen Sie das Zellpellet mit leichtes Klopfen auf, und fügen Sie frische 3 ml Fixiermittel. </li><li> Wiederholen Sie Schritt 3.12 zweimal. </li><li> Zentrifuge bei 400 × g für 5 min bei Raumtemperatur und Entfernen von Überstand ohne das Zellpellet zu stören. Dann fügen Sie 400 bis 600 &amp; mgr; l Fixiermittel und gründlich mischen mit Pipettieren. </li><li> Drop-30 &amp; mgr; l fixierten Zellen auf vorgereinigte und nassen Rutschen bei einem Winkel von 45 ° geneigt und lassen Sie die Folien an der Luft trocknen über Nacht vollständig. </li></ol> 4. Maus Chromosome Painting von MFISH <ol><li> Chromosome Denaturierung <ol><li> Legen Sie die Folie mit der Metaphase Zelle Aufstriche in 2 × SSC für 2 Minuten bei Raumtemperatur. </li><li> Entwässern Sie die Folie durch serielle Ethanol Waschen für jeweils 2 Min in 70%, 80% und 100%. bei 65 ° C für 60 min inkubieren. </li><li> Vorheizen 40 ml Denaturierungslösung (70% Formamid / 2x SSC; pH 7,0) auf 70 ° C (± 2 ° C) in einem Glas Coplin jar für 30 min. Denaturieren Chromosomen durch die Folie in vorgewärmten Denaturierungslösung Inkubation mit 1 - 1,5 min. </li><li> Quench rutschen sofort in eiskaltem 70% Ethanol für 2 min die Denaturierung als auch zu stoppen, zu verhindern, dass die denaturierten Chromosomen wieder Glühen. Dann Dehydratisieren mit 80% Ethanol für 2 min durch Waschen. Wiederholen des Ethanols Wäsche mit 100% Ethanol für 2 min. vollständig trocknen die Folie bei Raumtemperatur. </li></ol></li><li> Denaturierung und Hybridisierung der Sonde Mischung <ol><li> Kurz die Sondenmischung vom Hersteller geliefert, Zentrifuge, übertragen 10 &amp; mgr; l Probenmischung in einen 500 &amp; mgr; l Kappe Zentrifugenröhrchen schnappen, und für 7 min bei 80 ° C (± 2 ° C) in einem Wasserbad durch Inkubation denaturieren. </li><li> Platzieren Sie die Zentrifugenröhrchen mit Probenmischung in einem Wasserbad bei 37 ° C für 10 min. </li><li> Tragen Sie die denaturierte Sonde Mischung auf den Objektträger mit denaturierten chromosomes. </li><li> Deckel vorsichtig den Bereich mit einem 18 mm x 18 mm Deckglas und beseitigen alle sichtbaren Luftblasen durch sehr sanft das Deckglas drücken gleiten. Dichten Sie alle vier Seiten des Deckglases mit Gummizement und Inkubation für 12 h bis 16 h im Dunkeln bei 37 ° C in einer befeuchteten Kammer für die Hybridisierung. </li></ol></li><li> Beitrag Hybridization Waschen und Nachweis <ol><li> Entfernen Sie vorsichtig den Gummizement und das Deckglas. </li><li> Ort Schieber in vorgewärmten 0,4x SSC bei 74 ° C (± 2 ° C) für 5 min. </li><li> Wasch slide in Waschlösung II (4x SSC / 0,1% Tween-20) für 2 min. </li><li> Legen Sie 20 &amp; mgr; l anti-fade Eindeckmedium mit DAPI counterstain (1,5 ug / ml) geben und mit einem Deckglas. Drücken Sie vorsichtig auf Deckglas mit Labor Gewebe, um Luftblasen und überschüssige Montagelösung zu entfernen. Seal die Ränder des Deckglases mit Nagellack. </li><li> Blick gleitet ein Fluoreszenzmikroskop mit geeigneten Filtern. </li></ol></li&gt; </ol> 5. Spektrale Karyotypisierung (SKY) von Maus-Chromosome <ol><li> Chromosome und Probe Denaturierung <ol><li> Äquilibrieren Folie in 2x SSC bei Raumtemperatur für 2 Minuten, ohne Schütteln. </li><li> Dehydratisieren Folie in einer Ethanolreihe (70%, 80% und 100% Ethanol) für 2 min jeweils bei Raumtemperatur. Der Luft trocknen die Folie, um das Ethanol vollständig zu entfernen. </li><li> Warme 40 ml Denaturierungslösung (70% Formamid / 2 × SSC, pH 7,0) in einem Glas Glasküvette 30 min. </li><li> Inkubiere Objektträger in vorgewärmten Denaturierungslösung für 1 bis 1,5 min. </li><li> Tauchen Sie sofort das Abgleiten in eiskaltem 70% Ethanol für 2 min die Denaturierung als auch zu stoppen, wie auf die denaturierten Chromosomen wieder Glühen verhindern. </li><li> Entwässern die Folie, indem sie in 80% Ethanol für 2 min und dann in 100% Ethanol für 2 min bei Raumtemperatur setzt. </li><li> Denaturieren die SKY-Sonde (Vial # 1 durch Hersteller mitgeliefert) in einem Wasserbad auf 80 ° C (± 2 ° C)7 min, und legen Sie dann sofort in ein anderes Wasserbad für 10 min auf 37 ° C eingestellt. </li></ol></li><li> Sondenhybridisierung <ol><li> Fügen Sie 10 ul der denaturierten SKY-Sonde auf die denaturierten Chromosomen. </li><li> eine 18 mm x 18 mm Deckglas auf den SKY-Sonde vorsichtig platzieren, so dass keine Luftblasen unter dem Deckglas gefangen sind. </li><li> Seal die Ränder des Deckglases mit Gummi-Zement. </li><li> Legen Sie die Folie in einer angefeuchteten lichtundurchlässigen Kammer und Inkubation im Dunkeln bei 37 ° C für 24 h bis 36 h. </li></ol></li><li> Post-Hybridisierung Waschen und Fluoreszenzdetektion <ol><li> Entfernen Sie Gummizement sehr vorsichtig, ohne das Deckglas zu stören. </li><li> Legen Sie die Folie in vorgewärmten schnelle Waschlösung (0,4x SSC) bei 72 ° C (± 2 ° C) für 5 min unter konstantem Schütteln. Tauchen Abgleiten in die Waschlösung III (4x SSC / 0,1% Tween 20) und Inkubation für 1 min unter Schütteln. </li><li> Optional: Fügen Sie 80 ul Blockingreagenz(Flasche # 2 durch Hersteller mitgeliefert) auf dem Gebiet der Hybridisierung, legen Sie eine 24 mm x 60 mm Kunststoff-Deckglas, und für 30 min in einer feuchten Kammer bei 37 ° C im Dunkeln inkubiert. </li><li> Sie vorsichtig die Kunststoffdeckglas entfernen und den Schlitten mit vorgewärmten (45 ° C) Waschlösung III 5 min waschen. </li><li> Bewerben 80 ul von Cy5 Färbungsreagens (Fläschchen # 3 durch Hersteller geliefert), legen Sie eine 24 mm x 60 mm Kunststoff-Deckglas, und bei 37 ° C im Dunkeln für 40 min in einer feuchten Kammer. </li><li> Tauchen Sie den Schlitten in ein Glas Coplin Gefäß mit vorgewärmten (45 ° C) Waschlösung III (4x SSC / 0,1% Tween 20) und Inkubation bei 45 ° C in einem Wasserbad für 2 Minuten unter Schütteln. Wiederholen Sie diesen Waschschritt 3 mal. </li><li> Bewerben 80 ul von Cy5.5 Färbungsreagens (Fläschchen # 4 durch Hersteller geliefert), legen Sie eine 24 mm x 60 mm Kunststoff-Deckglas, und bei 37 ° C im Dunkeln für 40 min in einer feuchten Kammer. </li><li> Waschen Sie die Schieber 3 mal mit vorgewärmten (45 ºC) Waschlösung III. </li><li> Halten Sie die Folie in einer gekippten Position gegen ein Papiertuch, um überschüssige Flüssigkeit abfließen kann. In 20 &amp; mgr; l anti-fade DAPI-Reagenz (Fläschchen # 5 vom Hersteller geliefert) und legen Sie vorsichtig mit einem 24 mm x 60 mm Deckglas ohne Luftblasen einzuführen. Seal die Ränder des Deckglases mit Nagellack und beobachten mit einem Epifluoreszenz-Mikroskop für die Erfassung von SKY Bilder ausgestattet. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Kodama, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+chromosome+aberrations+in+atomic+bomb+survivors%3A+results+from+25+years+of+investigation%5BTitle%5D)+AND+%22Radiat+Res%22%5BJournal%5D)">Stable chromosome aberrations in atomic bomb survivors: results from 25 years of investigation.</a> Radiat Res. 156, 337-346 (2001).</li>
<li>Lucas, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytogenetic+signature+for+ionizing+radiation%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Radiat+Biol%22%5BJournal%5D)">Cytogenetic signature for ionizing radiation.</a> Int J Radiat Biol. 73, 15-20 (1998).</li>
<li>Zaccaria, A., Barbieri, E., Mantovani, W., Tura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome+radiation-induced+aberrations+in+patients+with+Hodgkin%27s+disease.+Possible+correlation+with+second+malignancy%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Boll.+Ist.+Sieroter.+Milan%22%5BJournal%5D)">Chromosome radiation-induced aberrations in patients with Hodgkin's disease. Possible correlation with second malignancy?</a> Boll. Ist. Sieroter. Milan. 57, 76-83 (1978).</li>
<li>Fisher, N. L., Starr, E. D., Greene, T., Hoehn, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utility+and+limitations+of+chromosome+banding+in+pre-+and+postnatal+service+cytogenetics%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Med+Genet%22%5BJournal%5D)">Utility and limitations of chromosome banding in pre- and postnatal service cytogenetics.</a> Am J Med Genet. 5, 285-294 (1980).</li>
<li>Hande, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complex+chromosome+aberrations+persist+in+individuals+many+years+after+occupational+exposure+to+densely+ionizing+radiation%3A+an+mFISH+study%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Chromosomes.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Complex chromosome aberrations persist in individuals many years after occupational exposure to densely ionizing radiation: an mFISH study.</a> Genes Chromosomes. Cancer. 44, 1-9 (2005).</li>
<li>Gall, J. G., Pardue, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+and+detection+of+RNA-DNA+hybrid+molecules+in+cytological+preparations%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Formation and detection of RNA-DNA hybrid molecules in cytological preparations.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 63, 378-383 (1969).</li>
<li>Bauman, J. G., Wiegant, J., Borst, P., van, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+method+for+fluorescence+microscopical+localization+of+specific+DNA+sequences+by+in+situ+hybridization+of+fluorochromelabelled+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">A new method for fluorescence microscopical localization of specific DNA sequences by in situ hybridization of fluorochromelabelled RNA.</a> Exp Cell Res. 128, 485-490 (1980).</li>
<li>Hopman, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bi-color+detection+of+two+target+DNAs+by+non-radioactive+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry%22%5BJournal%5D)">Bi-color detection of two target DNAs by non-radioactive in situ hybridization.</a> Histochemistry. 85, 1-4 (1986).</li>
<li>Nederlof, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-color+fluorescence+in+situ+hybridization+for+the+simultaneous+detection+of+multiple+nucleic+acid+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Three-color fluorescence in situ hybridization for the simultaneous detection of multiple nucleic acid sequences.</a> Cytometry. 10, 20-27 (1989).</li>
<li>Nederlof, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+fluorescence+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Multiple fluorescence in situ hybridization.</a> Cytometry. 11, 126-131 (1990).</li>
<li>Szeles, A., Joussineau, S., Lewensohn, R., Lagercrantz, S., Larsson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+spectral+karyotyping+%28SKY%29+in+biodosimetry+for+the+triage+situation+following+gamma+irradiation%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Radiat+Biol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of spectral karyotyping (SKY) in biodosimetry for the triage situation following gamma irradiation.</a> Int J Radiat Biol. 82, 87-96 (2006).</li>
<li>Camparoto, M. L., Ramalho, A. T., Natarajan, A. T., Curado, M. P., Sakamoto-Hojo, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translocation+analysis+by+the+FISH-painting+method+for+retrospective+dose+reconstruction+in+individuals+exposed+to+ionizing+radiation+10+years+after+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat.+Res%22%5BJournal%5D)">Translocation analysis by the FISH-painting method for retrospective dose reconstruction in individuals exposed to ionizing radiation 10 years after exposure.</a> Mutat. Res. 530, 1-7 (2003).</li>
<li>Edwards, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+critique+of+%27Collaborative+exercise+on+the+use+of+FISH+chromosome+painting+for+retrospective+biodosimetry+of+Mayak+nuclear-industrial+personnel%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Radiat+Biol%22%5BJournal%5D)">A critique of 'Collaborative exercise on the use of FISH chromosome painting for retrospective biodosimetry of Mayak nuclear-industrial personnel.</a> Int J Radiat Biol. 78, 867-871 (2002).</li>
<li>Bauchinger, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collaborative+exercise+on+the+use+of+FISH+chromosome+painting+for+retrospective+biodosimetry+of+Mayak+nuclear-industrial+personnel%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Radiat+Biol%22%5BJournal%5D)">Collaborative exercise on the use of FISH chromosome painting for retrospective biodosimetry of Mayak nuclear-industrial personnel.</a> Int J Radiat Biol. 77, 259-267 (2001).</li>
<li>Hieber, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosomal+rearrangements+in+post-Chernobyl+papillary+thyroid+carcinomas%3A+evaluation+by+spectral+karyotyping+and+automated+interphase+FISH%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Chromosomal rearrangements in post-Chernobyl papillary thyroid carcinomas: evaluation by spectral karyotyping and automated interphase FISH.</a> J Biomed. Biotechnol. 2011, 693691(2011).</li>
<li>Cohen, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((detection+of+chromosome+rearrangements+in+two+cases+of+tMDS+with+a+complex+karyotype%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Genet+Cytogenet%22%5BJournal%5D)">detection of chromosome rearrangements in two cases of tMDS with a complex karyotype.</a> Cancer Genet Cytogenet. 138, 128-132 (2002).</li>
<li>Pathak, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Vitamin+E+Analog+Gamma-Tocotrienol+%28GT3%29+Suppresses+Radiation-Induced+Cytogenetic+Damage%5BTitle%5D)+AND+%22Pharm+Res%22%5BJournal%5D)">The Vitamin E Analog Gamma-Tocotrienol (GT3) Suppresses Radiation-Induced Cytogenetic Damage.</a> Pharm Res. , (2016).</li>
<li>Spurbeck, J. L., Zinsmeister, A. R., Meyer, K. J., Jalal, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+chromosome+spreading%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Med+Genet%22%5BJournal%5D)">Dynamics of chromosome spreading.</a> Am J Med Genet. 61, 387-393 (1996).</li>
<li>Deng, W., Tsao, S. W., Lucas, J. N., Leung, C. S., Cheung, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+method+for+improving+metaphase+chromosome+spreading%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">A new method for improving metaphase chromosome spreading.</a> Cytometry A. 51, 46-51 (2003).</li>
<li>Hande, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Past+exposure+to+densely+ionizing+radiation+leaves+a+unique+permanent+signature+in+the+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">Past exposure to densely ionizing radiation leaves a unique permanent signature in the genome.</a> Am J Hum Genet. 72, 1162-1170 (2003).</li>
<li>Tug, E., Kayhan, G., Kan, D., Guntekin, S., Ergun, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evaluation+of+long-term+effects+of+ionizing+radiation+through+measurement+of+current+sister+chromatid+exchange+%28SCE%29+rates+in+radiology+technologists%2C+compared+with+previous+SCE+values%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat.+Res%22%5BJournal%5D)">The evaluation of long-term effects of ionizing radiation through measurement of current sister chromatid exchange (SCE) rates in radiology technologists, compared with previous SCE values.</a> Mutat. Res. 757, 28-30 (2013).</li>
<li>Kanda, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-fluorescent+chromosome+painting+using+the+peroxidase%2Fdiaminobenzidine+%28DAB%29+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Radiat+Biol%22%5BJournal%5D)">Non-fluorescent chromosome painting using the peroxidase/diaminobenzidine (DAB) reaction.</a> Int J Radiat Biol. 73, 529-533 (1998).</li>
<li>Kakazu, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+spectral+colour+banding+in+cytogenetic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Development of spectral colour banding in cytogenetic analysis.</a> Lancet. 357, 529-530 (2001).</li>
<li>Rithidech, K. N., Honikel, L., Whorton, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mFISH+analysis+of+chromosomal+damage+in+bone+marrow+cells+collected+from+CBA%2FCaJ+mice+following+whole+body+exposure+to+heavy+ions+%2856Fe+ions%29%5BTitle%5D)+AND+%22Radiat+Environ+Biophys%22%5BJournal%5D)">mFISH analysis of chromosomal damage in bone marrow cells collected from CBA/CaJ mice following whole body exposure to heavy ions (56Fe ions).</a> Radiat Environ Biophys. 46, 137-145 (2007).</li>
<li>Abrahams, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metaphase+FISHing+of+transgenic+mice+recommended%3A+FISH+and+SKY+define+BAC-mediated+balanced+translocation%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Metaphase FISHing of transgenic mice recommended: FISH and SKY define BAC-mediated balanced translocation.</a> Genesis. 36, 134-141 (2003).</li>
<li>Savage, J. R., Simpson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+scoring+of+FISH-%26%2334%3Bpainted%26%2334%3B+chromosome-type+exchange+aberrations%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat.+Res%22%5BJournal%5D)">On the scoring of FISH-&#34;painted&#34; chromosome-type exchange aberrations.</a> Mutat. Res. 307, 345-353 (1994).</li>
<li>Savage, J. R., Simpson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FISH+%22painting%22+patterns+resulting+from+complex+exchanges%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat.+Res%22%5BJournal%5D)">FISH "painting" patterns resulting from complex exchanges.</a> Mutat. Res. 312, 51-60 (1994).</li>
<li>Tucker, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PAINT%3A+a+proposed+nomenclature+for+structural+aberrations+detected+by+whole+chromosome+painting%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat.+Res%22%5BJournal%5D)">PAINT: a proposed nomenclature for structural aberrations detected by whole chromosome painting.</a> Mutat. Res. 347, 21-24 (1995).</li>
<li>Knehr, S., Zitzelsberger, H., Bauchinger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FISH-based+analysis+of+radiation-induced+chromosomal+aberrations+using+different+nomenclature+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Radiat+Biol%22%5BJournal%5D)">FISH-based analysis of radiation-induced chromosomal aberrations using different nomenclature systems.</a> Int J Radiat Biol. 73, 135-141 (1998).</li>
<li>Lucas, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+translocation+frequency+analysis+in+humans+decades+after+exposure+to+ionizing+radiation%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Radiat+Biol%22%5BJournal%5D)">Rapid translocation frequency analysis in humans decades after exposure to ionizing radiation.</a> Int J Radiat Biol. 62, 53-63 (1992).</li>
<li>Braselmann, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SKY+and+FISH+analysis+of+radiation-induced+chromosome+aberrations%3A+a+comparison+of+whole+and+partial+genome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat.+Res%22%5BJournal%5D)">SKY and FISH analysis of radiation-induced chromosome aberrations: a comparison of whole and partial genome analysis.</a> Mutat. Res. 578, 124-133 (2005).</li>
<li>Sokolova, I. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+a+multitarget%2C+multicolor+fluorescence+in+situ+hybridization+assay+for+the+detection+of+urothelial+carcinoma+in+urine%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Diagn%22%5BJournal%5D)">The development of a multitarget, multicolor fluorescence in situ hybridization assay for the detection of urothelial carcinoma in urine.</a> J Mol Diagn. 2, 116-123 (2000).</li>
<li>Lindholm, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biodosimetry+after+accidental+radiation+exposure+by+conventional+chromosome+analysis+and+FISH%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Radiat+Biol%22%5BJournal%5D)">Biodosimetry after accidental radiation exposure by conventional chromosome analysis and FISH.</a> Int J Radiat Biol. 70, 647-656 (1996).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Mehrere wichtige Schritte bestimmen den Erfolg von MFISH und SKY. Der erste und wichtigste Schritt ist es, die Colchicin - Behandlung für in vivo mitotischen Arrest der Knochenmark mononukleäre Zellen zu optimieren. Die Colchicin Konzentration und die Behandlungszeit der mitotischen Index sowie Chromosomenkondensation-zwei wichtige Voraussetzungen für eine effektive chromosome painting einzeln oder gemeinsam bestimmen. Eine hohe Konzentration Colchicin oder längere Behandlungszeit führt zu hoch kondensierter Ch...

Die beiden zuverlässigsten Methoden zur Identifizierung strahleninduzierter interchromosomaler stabiler Aberrationen sind die multiple Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (mFISH), die die gleichzeitige Bemalung von zwei oder mehr Chromosomen ermöglicht, und die spektrale Karyotypisierung (SKY), die jedem homologen Chromosomenpaar im Genom eine eindeutige Farbe verleiht. Im Gegensatz zu instabilen Aberrationen sind stabile Aberrationen von Natur aus persistent und können sich über mehrere Generationen in bestrahlten Populationen vermehren1 und gelten als kritische molekulare "Signaturen" für strahleninduzierte zytogenetische Läsionen2. Studien verschiedener Gruppen haben gezeigt, dass stabile Aberrationen mit der Pathogenese und Entwicklung einer Reihe von Krankheiten, einschließlich Krebs, verbunden sind3. Vor der Ära der Chromosomenmalerei (auch als molekulare Zytogenetik bezeichnet) war die konventionelle G-Banding-Technik die einzige Methode, um stabile Chromosomenaberrationen nachzuweisen. Die Chromosomenbandierung ist jedoch eine Herausforderung für Zytogenetiker, da die Auflösung begrenzt ist, die Reproduzierbarkeit unsicher ist, es sich um ein arbeitsintensives Verfahren handelt und für eine zuverlässige Dateninterpretation hochqualifizierte und erfahrene Zytogenetiker erforderlich sind4. Darüber hinaus ermöglicht die klassische Banding-Technik nicht den Nachweis komplexer chromosomaler Umlagerungen, bei denen drei oder mehr Brüche aufeinander verteilt sind, was eine häufige Folge von Strahlenschäden ist. Komplexe Aberrationen können bei Individuen viele Jahre nach der Strahlenexposition bestehen bleiben, was sie für die retrospektive Biodosimetrie nützlich macht5. Daher war ein alternativer Ansatz erforderlich, um die Einschränkungen herkömmlicher Banding-Techniken zum Nachweis stabiler chromosomaler Umlagerungen zu überwinden. 
In den späten 1960er Jahren leitete die Pionierarbeit von Gall und Pardue (1969) zur molekularen Hybridisierung mit Nukleinsäuresonden, die mit radioaktivem Material markiert wurden, eine neue Ära auf dem Gebiet der Zytogenetik ein, die den Nachweis einer spezifischen DNA-Sequenz auf den Chromosomen6 ermöglichte. Die Verwendung von radioaktiven Sonden für die molekulare Hybridisierung hatte jedoch mehrere Nachteile: Radioaktive Sonden sind relativ instabil, die Sondenaktivität hängt vom radioaktiven Zerfall des verwendeten Isotops ab, die Hybridisierung dauert länger, die Auflösung ist begrenzt, die Sonden sind relativ kostspielig und die radioaktiven Materialien sind gesundheitsgefährdend. Daher wurde es notwendig, nicht-radioaktive Sonden zu entwickeln und zu konstruieren. Die Einführung von fluoreszenzmarkierten Nukleinsäuresonden in den 1980er und 1990er Jahren überwand die Einschränkungen radioaktiver Sonden und verbesserte die Sicherheit, Empfindlichkeit und Spezifität der Hybridisierungstechnik7-10 erheblich. Fluoreszierende Sonden erzeugen extrem helle Signale, wenn sie unter Fluoreszenzmikroskopen betrachtet werden, die mit den entsprechenden Anregungs- und Emissionsfiltern ausgestattet sind. Jeder Verlust, Gewinn oder jede Neuanordnung von fluoreszierend markierten Chromosomen oder einem Teil des Chromosoms ist mit dieser FISH-Technik leicht identifizierbar.
Die Analyse von Chromosomenaberrationen durch FISH-Malerei hat im Laufe der Jahre zu deutlichen Fortschritten in der zytogenetischen Forschung geführt. Die Entwicklung von fluoreszenzmarkierten Sonden für spezifische Anwendungen, die von locusspezifischen Sonden bis hin zu Ganzchromosomen-Malsonden reichen, hat das Feld erheblich vorangebracht. Dies hat auch den Nachweis von submikroskopischen ("kryptischen") Umlagerungen erleichtert, die mit herkömmlicher Chromosomenbandierung nicht möglich waren. Die Chromosomenmalerei mit mFISH und SKY hat sich als wertvolles Werkzeug für die Identifizierung einfacher und komplexer interchromosomaler Umlagerungen erwiesen. Die Grundprinzipien für beide Techniken sind ähnlich, aber die Methode zur Detektion und Unterscheidung des Fluoreszenzsignals nach in situ-Hybridisierung und der Prozess der Bildaufnahme sind unterschiedlich. In mFISH werden separate Bilder von jedem der vier Fluorochrome mit Hilfe von Schmalbandpassmikroskopfiltern aufgenommen; Anschließend wird eine spezielle Software verwendet, um die Bilder zu kombinieren. Bei SKY basiert die Bildaufnahme auf einer Kombination aus Epifluoreszenzmikroskopie, ladungsgekoppelter Bildgebung und Fourierspektroskopie, die die Messung des gesamten Emissionsspektrums mit einer einzigen Belichtung an allen Bildpunkten ermöglicht. Sowohl in mFISH als auch in SKY werden monochrome Bilder unabhängig voneinander aufgenommen, dann zusammengeführt und schließlich den Chromosomen in monochromatischen Bildern einzigartige Pseudofarben zugewiesen, die auf dem spezifischen Farbstoff basieren, der an jede Fluorochromsonde gebunden ist.
Der Beitrag der mFISH- und SKY-Analyse auf dem Gebiet der Strahlenbiologie ist bemerkenswert, insbesondere für die retrospektive Dosisabschätzung der Exposition des Menschen gegenüber IR (Strahlenbiodosimetrie)11-14, die Risikobewertung von Strahlenkarzinogenese15 sowie die Erkennung und Risikoabschätzung von strahlentherapiebedingten Sekundärkrebserkrankungen16. Eine kürzlich durchgeführte Studie an Mäusen hat gezeigt, dass eine FISH-basierte Chromosomenmaltechnik auch ein wichtiges Instrument zur Bewertung der Wirksamkeit von Strahlungsgegenmaßnahmen ist17. In der vorliegenden Studie wurde der Einfluss der Strahlenexposition des gesamten Körpers auf die Induktion stabiler Chromosomenaberrationen in den Knochenmarkzellen von Mäusen mit Hilfe von mFISH- und SKY-Techniken nachgewiesen.

<table><tbody><tr><td>Formamid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221198-100ML</td><td></td></tr><tr><td>SSC Puffer 20 x Konzentrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6639-1L</td><td></td></tr><tr><td>SKY Laborreagenz für</td><td>Maus Applied Spectral Imaging</td><td>FPRPR0030/M40</td><td></td></tr><tr><td>CAD - Konzentriertes Antikörper-Detektionskit</td><td>für angewandte spektrale Bildgebung</td><td>FPRPR0033</td><td></td></tr><tr><td>einzelnen Farben kundenspezifisch - 3 Farben; Maus-Chromosom 1: Rot, Maus-Chromosom 2: Grün, Maus-Chromosom 3: Aqua</td><td>Applied Spectral Imaging</td><td>FPRPR0182/10</td><td></td></tr><tr><td>Glas-Deckgläser</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545B</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP337-100</td><td></td></tr><tr><td>Salzsäure, 37%, Acros Organics</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC45055-0025&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Glasfärbeschalen&nbsp; mit Schraubverschluss</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-816</td><td></td></tr><tr><td>KaryoMAX Kaliumchlorid-Lösung&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>10575-090</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Superfrost Plus Objektträger</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Colcemid Pulver</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-464-757&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Histopaque-1083&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10831</td><td></td></tr><tr><td>Shepherd Mark I, Modell 25 137Cs Bestrahlungsgerät</td><td>J. L. Shepherd & Associates</td><td>Model 484B</td><td></td></tr><tr><td>Spritze 1 mL</td><td>BD Biosciences</td><td>647911</td><td></td></tr><tr><td>Ethylalkohol, 200 Proof</td><td>Fisher Scientific</td><td>MEX02761</td><td></td></tr><tr><td>PBS, (1x PBS Liq.), ohne Calcium und Magnesium</td><td>Fisher Scientific</td><td>ICN1860454</td><td></td></tr><tr><td>fötales Rinderserum</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-437-010</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A454SK-4</td><td></td></tr><tr><td>Eisessig</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC295320010</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Mikroskop</td><td>Zeiss</td><td>AXIO Imager.Z2</td><td></td></tr></tbody></table>

der nachweis von inter-chromosomale stable abberationen durch mehrfachfluoreszenz<em&gt; in situ</em&gt; hybridisierung (mfish) und spektrale karyotypisierung (sky) in bestrahlte mäuse

Detection of Inter-chromosomal Stable Aberrations by Multiple Fluorescence In Situ Hybridization (mFISH) and Spectral Karyotyping (SKY) in Irradiated Mice

Ionisierende Strahlung (IR) induziert zahlreiche stabile und instabile Chromosomenaberrationen. Instabile Aberrationen, bei denen die Chromosomenmorphologie erheblich beeinträchtigt ist, können mit herkömmlichen Chromosomenfärbetechniken leicht identifiziert werden. Der Nachweis stabiler Aberrationen, bei denen genetisches Material ausgetauscht oder translokiert wird, ohne dass die Chromosomenmorphologie wesentlich verändert wird, erfordert jedoch ausgeklügelte Chromosomenmaltechniken, die auf der In-situ-Hybridisierung von fluoreszenzmarkierten DNA-Sonden beruhen, einer Chromosomenmaltechnik, die im Volksmund als Fluoreszenz in situ bekannt ist Hybridisierung (FISH). FISH-Sonden können spezifisch für ganze(s) Chromosom(en) oder für präzise Unterregionen auf Chromosom(en) sein. Die Methode ermöglicht nicht nur die Visualisierung stabiler Aberrationen, sondern auch den Nachweis des Chromosoms bzw. der spezifischen DNA-Sequenzen, die an einer bestimmten Aberrationsbildung beteiligt sind. In der Zytogenetik steht eine Vielzahl von Chromosomenmaltechniken zur Verfügung; hier werden zwei hochempfindliche Methoden, die multiple Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (mFISH) und die spektrale Karyotypisierung (SKY), diskutiert, um interchromosomale stabile Aberrationen zu identifizieren, die sich in den Knochenmarkzellen von Mäusen nach Ganzkörperbestrahlung bilden. Obwohl beide Techniken auf fluoreszenzmarkierten DNA-Sonden beruhen, unterscheiden sich die Detektionsmethode und der Prozess der Bildaufnahme der Fluoreszenzsignale. Diese beiden Techniken wurden in verschiedenen Forschungsbereichen eingesetzt, wie z.B. in der Strahlenbiologie, der Krebszytogenetik, der retrospektiven Strahlenbiodosimetrie, der klinischen Zytogenetik, der evolutionären Zytogenetik und der vergleichenden Zytogenetik.

Gesamtkörperbestrahlung induziert zahlreiche Chromosomenaberrationen in den Knochenmarkzellen von bestrahlten Mäusen. Das aktuelle Protokoll wird für die in - vivo - mitotischen Arrest von Knochenmarkzellen nach Strahlenexposition optimiert, Ernte von Knochenmarkszellen von den Hinterbeinen von bestrahlten Mäusen, die Isolierung von Knochenmark mononukleären Zellen durch Dichtegradientenzentrifugation, die Vorbereitung der Metaphase Zelle ausbreitet, und die anschließen...

Das vorliegende Protokoll beschreibt die Nützlichkeit der multiplen Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (mFISH) und der spektralen Karyotypisierung (SKY) bei der Identifizierung interchromosomaler stabiler Aberrationen in den Knochenmarkzellen von Mäusen nach Exposition gegenüber Ganzkörperbestrahlung.

Der Nachweis von Inter-chromosomale Stable Abberationen durch Mehrfachfluoreszenz<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisierung (MFISH) und Spektrale Karyotypisierung (SKY) in Bestrahlte Mäuse

Ionizing radiation (IR) induces numerous stable and unstable chromosomal aberrations. Unstable aberrations, where chromosome morphology is substantially ...

Das übergeordnete Ziel dieser molekularen zytogenetischen Methode besteht darin, interchromosomale stabile Aberrationen in Knochenmarkzellen von Mäusen zu beobachten, die einer Ganzkörperbestrahlung ausgesetzt wurden. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Strahlenbiologie zu beantworten, beispielsweise das Risiko, stabile chromosomale Aberrationen in Knochenmarkzellen bestrahlter Mäuse zu induzieren. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie eine gezielte Visualisierung strahleninduzierter stabiler genetischer Schäden in Knochenmarkzellen von Mäusen ermöglicht, die über viele Zellgenerationen hinweg weitergegeben werden können.Nach der Isolierung des Knochenmarks aus den Femur- und Tibiaknochen der Maus und der Herstellung einer Einzelzell-Suspension gemäß dem Textprotokoll vorsichtig die Zellsuspension auf ein gleiches Volumen des Trennmediums für mononukleäre Knochenmarkzellen aufschichten. Den Gradienten bei 400 × g für 30 Minuten bei Raumtemperatur zentrifugieren. Anschließend die Bürstchenphase vorsichtig sammeln, ohne die verbleibenden Schichten zu stören, und die Lösung in ein neues 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen überführen.Um Metaphase-Zellpräparationen herzustellen, 10 Milliliter PBS in das Röhrchen mit dem Buffy Coat geben. Anschließend das Röhrchen bei Raumtemperatur fünf Minuten lang mit 400 × g zentrifugieren. Danach vorsichtig den Überstand entfernen und das Röhrchen sanft antippen, um den Zellpellet aufzulösen.Anschließend 10 Milliliter PBS hinzufügen und die Suspension erneut zentrifugieren. Das Überstandsvolumen entfernen, ohne das Zellpellet zu stören. Das Pellet aufbrechen und unter vorsichtigem, gleichmäßigem Schütteln tropfenweise vier Milliliter vorgewärmte hypotonische Kaliumchloridlösung mit einer Konzentration von 0,075 mol/L hinzufügen.Inkubieren Sie die Zellsuspension 20 Minuten lang bei 37 Grad Celsius in einem Wasserbad. Geben Sie anschließend ein gleiches Volumen Fixierungslösung in das Röhrchen und mischen Sie vorsichtig durch mehrmaliges Umstülpen des Röhrchens. Zentrifugieren Sie das Röhrchen und entfernen Sie den Überstand.Dann lösen Sie das Zellpellet auf und geben frisches Fixansmittel hinzu. Wiederholen Sie das Zentrifugieren und die Zugabe des Fixansmittels noch fünfmal. Nachdem Sie die Zellen in 400 bis 600 Mikrolitern Fixansmittel resuspendiert haben, geben Sie 30 Mikroliter fixierter Zellen auf vorher gereinigte und angefeuchtete Objektträger, die in einem Winkel von 45 Grad geneigt sind, und lassen Sie die Objektträger über Nacht vollständig an der Luft trocknen.Um eine Maus-Chromosomen-Färbung mittels mFISH durchzuführen, legen Sie den Objektträger mit den Metaphasezellpräparaten zwei Minuten lang bei Raumtemperatur in 2X SSC. Anschließend dehydrieren Sie den Objektträger durch eine serielle Ethanolbehandlung mit 70 %, 80 % und 100 %igem Ethanol, jeweils zwei Minuten pro Schritt. Erwärmen Sie 40 Milliliter Denaturierungslösung in einem Glas-Coplin-Behälter 30 Minuten lang auf 70 Grad Celsius.Überführen Sie dann den Objektträger in die vorgewärmte Lösung und inkubieren Sie die Probe für eine bis eineinhalb Minuten, um die Chromosomen zu denaturieren. Verwenden Sie sofort eiskalte 70 %ige Ethanol-Lösung, um den Objektträger für zwei Minuten abzuschrecken, um den Denaturierungsprozess zu stoppen und eine Reannealing-denaturierter Chromosomen zu verhindern. Anschließend dehydrieren Sie den Objektträger mittels einer Ethanol-Serie, beginnend mit 80 %igem Ethanol für zwei Minuten.Als Nächstes das Objektträger in 100 % Ethanol für zwei Minuten geben. Anschließend das Objektträger vollständig bei Raumtemperatur trocknen lassen. Um die Sonde zu denaturieren, kurz die vom Hersteller bereitgestellte Sondenmischung zentrifugieren, dann 10 Mikroliter in ein 500-Mikroliter-Schnappdeckel-Zentrifugenröhrchen überführen und das Röhrchen sieben Minuten lang in einem Wasserbad bei 80 Grad Celsius inkubieren.Stellen Sie nun das Röhrchen mit der denaturierten Sonde für 10 Minuten in ein Wasserbad bei 37 Grad Celsius. Anschließend wird die Sondenmischung auf einen Objektträger mit denaturierten Chromosomen aufgetragen. Bedecken Sie den Bereich vorsichtig mit einem 18 Millimeter mal 18 Millimeter großen Glasdeckglas und entfernen Sie sichtbare Luftblasen, indem Sie das Deckglas sehr vorsichtig auf den Objektträger andrücken.Verwenden Sie Gummizement, um alle vier Seiten des Deckgläschens abzudichten. Inkubieren Sie den Objektträger anschließend 12 bis 16 Stunden im Dunkeln in einer befeuchteten Kammer bei 37 Grad Celsius. Nach der Hybridisierung entfernen Sie vorsichtig das Gummizement und das Deckgläschen und legen den Objektträger für fünf Minuten in vorerwärmte 0,4X SSC bei 74 Grad Celsius.Anschließend die Objektträger zwei Minuten lang in Waschlösung drei überführen. 20 Mikroliter Antifade-Montagemedium mit DAPI-Gegenfärbung auf den Objektträger geben und mit einer Glasdeckfolie abdecken. Vorsichtig mit Labor-Handschuhpapier auf die Deckfolie drücken, um Luftblasen und überschüssiges Montagemedium zu entfernen.Verwenden Sie anschließend Nagellack, um die Ränder der Deckgläser abzudichten. Betrachten Sie die Präparate mit einem Fluoreszenzmikroskop, das mit den entsprechenden Filtern ausgestattet ist. Für die spektrale Karyotypisierung von Mauschromosomen geben Sie nach der Hybridisierung der Sonden auf die denaturierten Chromosomen und dem Waschen der Proben gemäß dem schriftlichen Protokoll 80 Mikroliter des Färbeagens SY5 auf das Objektträgerpräparat.Legen Sie eine 24 mal 60 Millimeter große Plastik-Deckglas auf die Probe und inkubieren Sie sie 40 Minuten lang im Dunkeln in einer befeuchteten Kammer bei 37 Grad Celsius. Tauchen Sie den Objektträger dreimal in ein Glas-Coplin-Gefäß mit vorgewärmter Waschlösung ein und inkubieren Sie ihn unter Schütteln zwei Minuten lang in einem Wasserbad bei 45 Grad Celsius. Wiederholen Sie den Waschschritt dreimal.Tragen Sie 80 Mikroliter SY5.5-Färbelösung auf die Probe auf, bedecken Sie sie mit einem 24 mal 60 Millimeter großen Kunststoff-Deckglas und inkubieren Sie sie 40 Minuten im Dunkeln in einer befeuchteten Kammer bei 37 Grad Celsius. Verwenden Sie vorgewärmte Waschlösung drei, um den Objektträger dreimal zu waschen, und halten Sie den Objektträger anschließend schräg gegen ein Papiertuch, um die überschüssige Flüssigkeit ablaufen zu lassen. Geben Sie 20 Mikroliter Antifade-DAPI-Reagenz auf die Probe und platzieren Sie vorsichtig ein Glas-Deckglas darauf, wobei Sie sicherstellen, dass keine Luftblasen eingeschlossen werden.Verwenden Sie Nagellack, um die Ränder abzudichten, und beobachten Sie die Probe mit einem Auflicht-Fluoreszenzmikroskop, das für die Aufnahme von Himmelsbildern ausgerüstet ist. Diese Abbildung zeigt repräsentative Metaphase-Zellpräparationen mit normalen und aberranten Maus-Chromosomenpaaren eins, zwei und drei. Hier liegt eine stabile Aberration vor, die Chromosom eins betrifft, wobei ein Teil von Chromosom eins in ein nicht angefärbtes DAPI-Chromosom integriert wurde, während ein anderer Teil ein azentrisches Fragment gebildet hat.In diesem Beispiel wurde ein Teil des Chromosoms zwei in ein nicht angefärbtes Chromosom integriert. Diese stabile Aberration betrifft Chromosom drei. Stabile Aberrationen, an denen alle drei angefärbten Chromosomen beteiligt sind, sind in dieser Metaphaseausstrahlung zu sehen.Hier ist ein Beispiel der Spektralkaryotypisierung einer normalen weiblichen Maus zu sehen. Dieses Panel zeigt eine stabile Aberration, die die Chromosomen vier und 12 betrifft. Schließlich betrifft die stabile chromosomale Aberration in diesem Panel die Chromosomen sieben und 10.Wenn die Technik einmal beherrscht ist, kann sie innerhalb von 48 bis 72 Stunden durchgeführt werden, sofern sie ordnungsgemäß ausgeführt wird. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig zu beachten, dass nur proliferierende Zellen verwendet werden sollten. Mit dieser Methode und anderen Verfahren wie der Bandenanalyse können zusätzliche Fragen beantwortet werden, beispielsweise, ob interchromosomale stabile Aberrationen in bestrahlten Zellen vorhanden sind.Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Forschern auf dem Gebiet der molekularen Zytogenetik den Weg, um die Zusammenhänge zwischen genetischen Aberrationen und verschiedenen Erkrankungen zu untersuchen. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein besseres Verständnis dafür haben, wie interchromosomale stabile Aberrationen bestimmt werden können. Vergessen Sie nicht, dass das Arbeiten mit Colchicin äußerst gefährlich sein kann, da es krebserregend ist, und dass stets Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen von Handschuhen getroffen werden sollten, wenn dieses Experiment durchgeführt wird.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Genetics

Genetik

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Der Nachweis von Inter-chromosomale Stable Abberationen durch Mehrfachfluoreszenz In Situ Hybridisierung (MFISH) und Spektrale Karyotypisierung (SKY) in Bestrahlte Mäuse (Video) | JoVE Journal

Der Nachweis von Inter-chromosomale Stable Abberationen durch Mehrfachfluoreszenz

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