Der Nachweis von Inter-chromosomale Stable Abberationen durch Mehrfachfluoreszenz In Situ Hybridisierung (MFISH) und Spektrale Karyotypisierung (SKY) in Bestrahlte Mäuse

Das übergeordnete Ziel dieser molekularzytogenen Methode ist es, interchromosomale stabile Aberrationen in den Knochenmarkzellen von Mäusen zu beobachten, die einer Ganzkörperbestrahlung ausgesetzt sind. Diese Methode kann helfen, die Schlüsselfrage im Bereich der Strahlenbiologie zu beantworten, wie z.B. das Risiko, stabile Chromosomenaberrationen in den Knochenmarkzellen von Mäusen zu induzieren, die der Ganzkörperstrahlung ausgesetzt sind. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie eine geführte Visualisierung von strahleninduzierten stabilen genetischen Schäden in den Knochenmarkzellen von Mäusen ermöglicht, die über viele Zellgenerationen hinweg vermehrt werden können.

Nach der Isolierung des Knochenmarks aus dem Femur der Maus und den Tibiaknochen und der Herstellung einer Einzelzellsuspension gemäß dem Textprotokoll wird die Zellsuspension vorsichtig auf ein gleiches Volumen des mononukleären Zelltrennmediums des Knochenmarks aufgebracht. Zentrifugieren Sie den Gradienten bei 400 mal G bei Raumtemperatur für 30 Minuten. Sammeln Sie dann vorsichtig den Buffy Coat, ohne die verbleibenden Schichten zu stören, und geben Sie die Lösung in ein neues 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen.

Um Metaphase-Zellausbreitungen vorzubereiten, geben Sie 10 Milliliter PBS in das Röhrchen mit dem Buffy Coat. Dann zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 400 mal G bei Raumtemperatur fünf Minuten lang. Entfernen Sie anschließend vorsichtig den Überstand und klopfen Sie vorsichtig auf das Röhrchen, um das Zellpellet aufzubrechen.

Fügen Sie dann 10 Milliliter PBS hinzu und zentrifugieren Sie die Suspension erneut. Entfernen Sie den Überstand, ohne das Zellpellet zu stören. Brechen Sie das Pellet auf und fügen Sie Tropfen für Tropfen vier Milliliter vorgewärmte hypotone 0,075 molare Kaliumchloridlösung unter leichtem, ständigem Schütteln hinzu.

Inkubieren Sie die Zellsuspension bei 37 Grad Celsius für 20 Minuten in einem Wasserbad. Geben Sie dann die gleiche Menge Fixiermittel in die Tube und mischen Sie vorsichtig, indem Sie die Tube umdrehen. Zentrifugieren Sie das Röhrchen und entfernen Sie den Überstand.

Brechen Sie dann das Zellpellet auf und fügen Sie frisches Fixiermittel hinzu. Wiederholen Sie das Schleudern und die Zugabe von Fixiermittel noch fünf Mal. Nachdem Sie die Zellen in 400 bis 600 Mikrolitern Fixiermittel resuspendiert haben, lassen Sie 30 Mikroliter fixierte Zellen auf vorgereinigte und nasse Objektträger fallen, die in einem 45-Grad-Winkel geneigt sind, und lassen Sie die Objektträger über Nacht vollständig an der Luft trocknen.

Um die Maus-Chromosomenbemalung mit mFISH durchzuführen, legen Sie den Objektträger mit den Metaphasen-Zellausbreitungen für zwei Minuten bei Raumtemperatur in 2X SSC. Dehydrieren Sie dann die Folie durch serielles Waschen von Ethanol in 70 %, 80 % und 100 % Ethanol für zwei Minuten bei jeder Wäsche. 40 Milliliter Denaturierungslösung in einem Coplinglas aus Glas 30 Minuten lang auf 70 Grad Celsius erhitzen.

Übertragen Sie dann den Objektträger in die vorgewärmte Lösung und inkubieren Sie die Probe für ein bis 1 1/2 Minuten, um die Chromosomen zu denaturieren. Verwenden Sie sofort eiskaltes 70%iges Ethanol, um den Objektträger zwei Minuten lang abzuschrecken, um den Denaturierungsprozess zu stoppen und zu verhindern, dass denaturierte Chromosomen wieder geglüht werden. Entwässern Sie dann den Objektträger zwei Minuten lang mit einer Ethanolreihe, beginnend mit 80 % Ethanol.

Legen Sie die Folie anschließend zwei Minuten lang in 100%iges Ethanol. Anschließend trocknen Sie den Objektträger vollständig bei Raumtemperatur. Um die Sonde zu denaturieren, zentrifugieren Sie die vom Hersteller gelieferte Sondenmischung kurz, geben Sie dann 10 Mikroliter in ein 500-Mikroliter-Zentrifugenröhrchen mit Schnappverschluss und inkubieren Sie das Röhrchen in einem Wasserbad bei 80 Grad Celsius für sieben Minuten.

Legen Sie nun das Röhrchen mit der vergällten Sonde für 10 Minuten in ein Wasserbad bei 37 Grad Celsius. Tragen Sie dann die Sondenmischung auf einen Objektträger mit denaturierten Chromosomen auf. Decken Sie den Bereich vorsichtig mit einem 18 Millimeter x 18 Millimeter großen Glasdeckglas ab und beseitigen Sie sichtbare Luftblasen, indem Sie das Deckglas sehr vorsichtig auf den Objektträger drücken.

Verwenden Sie Gummizement, um alle vier Seiten des Deckglases abzudichten. Und inkubieren Sie den Objektträger im Dunkeln in einer befeuchteten Kammer bei 37 Grad Celsius für 12 bis 16 Stunden. Entfernen Sie nach der Hybridisierung vorsichtig den Gummizement und das Deckglas und legen Sie den Objektträger fünf Minuten lang in vorgewärmtes 0,4-faches SSC bei 74 Grad Celsius.

Übertragen Sie dann den Objektträger für zwei Minuten in die Waschlösung drei. Geben Sie 20 Mikroliter Antifading-Einbettmittel mit DAPI-Gegenfärbung auf den Objektträger und decken Sie ihn mit einem Glasdeckglas ab. Verwenden Sie Laborseidenpapier, um vorsichtig auf das Deckglas zu drücken, um Luftblasen und überschüssige Befestigungslösung zu entfernen.

Verwenden Sie dann Nagellack, um die Ränder des Deckglases zu versiegeln. Betrachten Sie die Objektträger mit einem Fluoreszenzmikroskop, das mit den entsprechenden Filtern ausgestattet ist. Für die spektrale Karyotypisierung von Mauschromosomen werden nach der Hybridisierung der Sonden mit den denaturierten Chromosomen und dem Waschen der Proben gemäß dem Textprotokoll 80 Mikroliter SY5-Färbereagenz auf den Objektträger aufgetragen.

Legen Sie ein 24 x 60 Millimeter großes Deckglas aus Kunststoff auf die Probe und inkubieren Sie sie im Dunkeln in einer befeuchteten Kammer bei 37 Grad Celsius für 40 Minuten. Tauchen Sie den Objektträger in ein Coplinglas mit vorgewärmter Waschlösung drei und inkubieren Sie ihn in einem Wasserbad bei 45 Grad Celsius unter zweiminütigem Schütteln. Wiederholen Sie den Waschgang dreimal.

Tragen Sie 80 Mikroliter SY5.5 Färbereagenz auf die Probe auf, decken Sie sie mit einem 24 x 60 Millimeter großen Kunststoffdeckglas ab und inkubieren Sie sie im Dunkeln in einer befeuchteten Kammer bei 37 Grad Celsius für 40 Minuten. Verwenden Sie vorgewärmte Waschlösung dreimal, um die Rutsche dreimal zu waschen, und halten Sie die Rutsche dann in einer gekippten Position gegen ein Papiertuch, um die überschüssige Flüssigkeit abzulassen. Geben Sie 20 Mikroliter Antifading-DAPI-Reagenz in die Probe und legen Sie vorsichtig ein Glasdeckglas darauf, ohne Luftblasen einzuführen.

Verwenden Sie Nagellack, um die Ränder zu versiegeln, und betrachten Sie die Probe mit einem Epifluoreszenzmikroskop, das für die Aufnahme von Himmelsbildern ausgestattet ist. Diese Abbildung zeigt repräsentative Metaphasen-Zellausbreitungen mit normalen und abweichenden Mauschromosomenpaaren eins, zwei und drei. Hier handelt es sich um eine stabile Aberration des ersten Chromosoms, bei der ein Teil des ersten Chromosoms in ein nicht bemaltes DAPI-Chromosom integriert wurde, während ein anderer Teil ein azentrisches Fragment gebildet hat.

In diesem Beispiel wurde ein Teil des zweiten Chromosoms in ein nicht bemaltes Chromosom integriert. An dieser stabilen Aberration ist Chromosom drei beteiligt. Stabile Aberrationen, die alle drei bemalten Chromosomen betreffen, sind in dieser Metaphasenausbreitung zu beobachten.

Hier sehen Sie ein Beispiel für die spektrospektive Karyotypisierung einer normalen weiblichen Maus. Dieses Panel stellt eine stabile Aberration dar, an der die Chromosomen vier und 12 beteiligt sind. Schließlich betrifft die stabile Chromosomenaberration in diesem Panel die Chromosomen sieben und 10.

Einmal gemeistert, kann diese Technik innerhalb von 48 bis 72 Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Bei diesem Verfahren ist zu beachten, dass nur proliferierende Zellen verwendet werden sollten. Nach diesem Verfahren und anderen Methoden wie z.B. in band können zusätzliche Fragen beantwortet werden, z.B. ob interchromosomale stabile Aberrationen in den bestrahlten Zellen vorhanden sind.

Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Forschern auf dem Gebiet der molekularen Zytogenetik den Weg, um den Zusammenhang zwischen genetischen Aberrationen und den verschiedenen Krankheiten zu erforschen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie eine klarere Vorstellung davon haben, wie man interchromosomale stabile Aberrationen bestimmen kann. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Colchicin äußerst gefährlich sein kann, da es krebserregend ist und bei der Durchführung dieses Experiments immer Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen von Handschuhen getroffen werden sollten.