One-Step-Protokoll für die Bewertung des strahleninduzierten klonogenen Zelltod durch Fluoreszenz-Mikroskopie-Modus

Das übergeordnete Ziel dieses Assays ist es, die wichtigsten Arten des klonogenen Zelltodes, der durch ionisierende Strahlung induziert wird, auf der Grundlage der charakteristischen Morphologien der mit DAPI gefärbten Zellkerne zu bewerten. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Strahlenbiologie zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser schnellen und kosteneffizienten Technik besteht darin, dass die wichtigsten Arten des klonogenen Zelltods, die durch ionisierende Strahlung induziert werden, gleichzeitig bewertet werden können.

Im Allgemeinen werden Personen, die neu in der Strahlenbiologie sind, Schwierigkeiten haben, den strahleninduzierten klonogenen Zelltod zu bewerten, da unterschiedliche Assays erforderlich sind, um jede Art des Zelltods zu bewerten. Wir hatten die Idee zu dieser Methode, als wir ein groß angelegtes Screening des strahleninduzierten klonogenen Zelltods unter Verwendung mehrerer Zelllinien und Strahlendosen durchführten. Diese Methode kann zwar Einblicke in die Strahlenbiologie geben, kann aber auch auf andere Systeme wie die Chemotherapie bei Krebs angewendet werden.

Das Verfahren wird von unserem Mitarbeiter Atsushi Shibata demonstriert. Beginnen Sie damit, ein Skalpell mit Papiertüchern zu sterilisieren, die mit 70% Ethanol angefeuchtet sind. Anschließend legen Sie mit dem Skalpell ein Deckglas in eine 35 Millimeter große Zellkulturschale.

In die Kulturschale mit dem Deckglas einen Milliliter Nährmedium geben. Halten Sie nun die Mitte des Deckglases vorsichtig mit einer sterilen Pinzette fest und saugen Sie das Nährmedium vollständig aus der Schale ab. Bereiten Sie als Nächstes eine drei Milliliter Zellsuspension in Kulturmedium in einem 15-Milliliter-Röhrchen vor.

Geben Sie die Zellsuspension in die Kulturschale. Und inkubieren Sie es über Nacht bei 37 Grad Celsius und 5 % CO2. Stellen Sie sicher, dass die Zellen am Deckglas befestigt und lebendig sind, indem Sie sie unter einem inversen Phasenkontrastmikroskop untersuchen.

Bestrahlen Sie nun die Schale mit sechs grauer Röntgenstrahlung. Nach der Bestrahlung inkubieren Sie die Zellen 72 Stunden lang in einem Inkubator bei 37 Grad Celsius und 5 % CO2. Entnehmen Sie nun die Zellen aus dem Inkubator und aspirieren Sie das Nährmedium aus der Kulturschale.

Schneiden Sie die Spitze einer 1.000-Mikroliter-Mikropipettenspitze mit einer Schere etwa fünf Millimeter vom Ende entfernt ab. Und geben Sie damit einen Milliliter Fixierlösung in die Kulturschale. Tragen Sie die Fixierlösung entlang der Wände der Kulturschale auf, um die Schädigung der Zellen zu minimieren.

Füllen Sie diese Kulturschale dann in eine quadratische Kulturschale und schütteln Sie sie vorsichtig, um die Fixierlösung gleichmäßig auf dem Deckglas zu verteilen. Danach das Gericht 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Aspirieren Sie die Fixierlösung aus der Schale.

Geben Sie nun zwei Milliliter PBS entlang der Wände der Schüssel hinzu. Und dann aspirieren Sie das PBS. Zur Vorbereitung der DAPI-Färbung geben Sie fünf Mikroliter DAPI-Färbereagenz auf einen Objektträger.

Entfernen Sie dann mit einem Skalpell das Deckglas von der Schale. Und lassen Sie überschüssiges PBS auf dem Deckglas abtropfen, indem Sie den Rand des Deckglases mit einem Papiertuch berühren. Montieren Sie nun den Deckglas kopfüber auf den Tropfen des DAPI-Färbereagenzes auf dem Objektträger, so dass die Zellen dem DAPI-Färbereagenz ausgesetzt sind.

Untersuchen Sie abschließend die gefärbten Zellen unter einem Fluoreszenzmikroskop, das mit einem DAPI-Filter ausgestattet ist. Die Kernmorphologien in jeder der drei Arten des Zelltods werden gezeigt. Apoptotische Zellen sind mit kondensierten Zellkernen zu sehen.

Mehrere Lappen werden in Zellkernen von Zellen beobachtet, die eine mitotische Katastrophe durchmachen. Zellen, die sich einer Seneszenz unterziehen, weisen charakteristische Seneszenz-assoziierte Heterochromatin-Foki auf. Es wird eine vergleichende Beobachtung von scheinbestrahlten Kernen und Kernen, die mit sechs grauen Röntgenstrahlen bestrahlt wurden, gezeigt.

Kreise zeigen Kerne an, die sich in der Apoptose befinden, und Pfeile zeigen Kerne, die eine mitotische Katastrophe durchmachen. Es wird die Auswertung von etwa 300 Kernen, die einer Bestrahlung unterzogen wurden, im Vergleich zum Mock gezeigt. Es wird beobachtet, dass die Röntgenbestrahlung mit sechs Grautönen häufiger eine mitotische Katastrophe mit etwa 25 % verursacht, gefolgt von Apoptose mit etwa 5 % und sehr seltenen Seneszenzereignissen.

Einmal gemeistert, kann diese Technik in einer Stunde durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, die Zellen nicht zu beschädigen, indem Sie Lösungen direkt auf die Deckgläser auftragen. Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Methoden, wie z. B. die durchflusszytometrische Analyse oder Zelltod-Markerproteine, sowie die Seneszenz-assoziierte Beta-Galactosidase-Färbung zur Beurteilung der Seneszenz durchgeführt werden, um jede Art des klonogenen Zelltods besser zu verstehen.