Vorbereitung der Cell-Linien für Conditional Knockdown der Genexpression und Messung der Knockdown Auswirkungen auf E4orf4-induzierten Zelltod

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, den Effekt des ACF 1 oder SNF zwei H Knockdowns auf den durch E vier oder vier induzierten Zelltod zu beobachten. Dies wird durch die Erzeugung von Zelllinien erreicht, in denen die Expression von ACF 1 oder SNF zwei H srna bedingt durch Zugabe von Doxycyclin aktiviert wird, was in einem zweiten Schritt zu reduzierten Spiegeln des ACF eins oder SNF zwei H-Proteins führt. Zellen der gewonnenen Zelllinien werden mit Doxycyclin behandelt, um die ACF 1- oder SNF 2 H-Expression zu reduzieren, oder sie bleiben unbehandelt.

Als nächstes wird E, vier oder vier in den Zellen mit oder ohne S-H-R-N-A-resistentes ACF eins oder SNF zwei exprimiert, H.In um die Wirkung von ACF eins oder SNF zwei H auf E vier oder vier induzierten Zelltod zu untersuchen, erhalten wir Ergebnisse, die den Einfluss von ACF eins oder SNF zwei H-Spiegeln auf die Toxizität von E vier oder vier zeigen, basierend auf der Zählung von Nukleos mit apoptotischer Morphologie unter Verwendung des JY-Assays. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber anderen Methoden, wie z.B. der transienten Transfektion von RNAs, besteht darin, dass alle Zellen das S-H-R-N-A exprimieren und der Prozentsatz der Zellen, die zusammen mit dem traditionellen Plasmid exprimieren, höher ist. Diese Methode gibt Aufschluss über die Mechanismen, die dem Zelltod zugrunde liegen, wenn 4 0 4 den Zelltod induziert, kann aber auch auf die Untersuchung anderer protischer Proteine angewendet werden.

Neben Ana Lafe wird ein Forscher aus meinem Labor Teile dieses Verfahrens demonstrieren: Um das Verfahren zur Erzeugung induzierbarer Zelllinien zu beginnen, wird eine Platte T-Rex 2 9 3 Zellen mit einer Dichte von etwa fünfmal 10 auf die sechs Zellen pro 10 Zentimeter Platte in acht Milliliter DMEM enthaltendes Serum ohne Tetracyclin und mit fünf Mikrogramm Milliliter Blaster beiseite in die Platten über Nacht bei 37 Grad Celsius inkubieren und 5% Kohlendioxid am nächsten Tag. Ersetzen Sie das Medium vor der Transfektion durch acht Milliliter frisches Medium. Das Plasmid für die Transfektion ist das P superior neo plus GFP-Plasmid in kodierendem ACF eins oder SNF zwei H-S-H-R-N-A, angetrieben von einem Tetracyclin-induzierbaren H-1-Promotor, sowie das Neomycin-Resistenzgen, das mit dem GFP fusioniert und von einem konstitutiven PGK-Promotor angetrieben wird.

Fügen Sie 10 Mikrogramm Plasmid-DNA zu 500 Mikrolitern 150 millimolarem Natriumchlorid hinzu und wirbeln Sie es auf. Geben Sie dann das Jet-PY-Reagenz mit zwei Mikrolitern pro Mikrogramm DNA in ein anderes Röhrchen mit 500 Mikrolitern 150 millimolarem Natriumchlorid und Vortex. Fügen Sie die Jet-Pie-Lösung zur DNA hinzu und mischen Sie sie gut durch Vortexen.

Inkubieren Sie es 15 Minuten lang bei Raumtemperatur. Pipettieren Sie die DNA-Komplexe nach 15 Minuten vorsichtig auf die 10 Zentimeter großen Platten mit 70 bis 80 % Konfluenz. T-Rex 2 9 3 Zellen pro Mix am nächsten Tag.

Ersetzen Sie das Medium in diesem Beispiel wie zuvor durch ein selektives Medium, DMEM, das 500 Mikrogramm pro Milliliter G vier 18 enthält. Überwachen Sie die Zellen in den nächsten zwei Wochen. Ersetzen Sie das selektive Medium alle drei bis vier Tage durch ein ähnliches frisches Medium, bis die Bienenvölker erscheinen.

Identifizieren Sie die Kolonien mit dem Auge und markieren Sie ihre Position am unteren Rand der Platte mit einem farbigen Marker. Überprüfen Sie unter dem Mikroskop, ob die Kolonien gut getrennt sind. Kolonien können isoliert werden, sobald sie groß genug sind, um ohne Mikroskop sichtbar gemacht zu werden.

Für den Erfolg dieses Verfahrens ist es wichtig, während der Isolierung der Völker gut getrennte Völker zu wählen. Saugen Sie in einer sterilen Haube das Medium aus der Platte ab. Spülen Sie vorsichtig mit PBS und saugen Sie die restliche Flüssigkeit gut an.

Fügen Sie drei Mikroliter EDTA von 0,25 % zu einer Kolonie auf dem Teller hinzu, indem Sie die Trips wiederholt einatmen, bis sich die Zellen von der Platte lösen. Übertragen Sie die Zellen in ein selektives Medium in einer Vertiefung in einer 24-Well-Platte. Wiederholen Sie dies für mehrere andere Völker auf dem Teller.

Züchten Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius, 5% Kohlendioxid, bis sie die Vertiefung füllen. Teilen Sie dann die Zellen aus jeder ursprünglichen Kolonie in drei Vertiefungen in einer separaten 12-Well-Platte auf und inkubieren Sie sie über Nacht am nächsten Tag. Das Medium in einer Platte wird durch ein Medium ersetzt, das ein Mikrogramm pro Milliliter Doxycyclin aus einer in doppelt destilliertem Wasser zubereiteten Stammlösung enthält.

Ersetzen Sie das Medium in einer Kontrollplatte durch ein Medium ohne Doxycyclin. Inkubieren Sie die Zellen 72 Stunden lang bei 37 Grad Celsius, 5% Kohlendioxid. Zellen aus einer behandelten und einer unbehandelten Vertiefung werden dann für die Western-Blot-Analyse geerntet, um die Effizienz von ACF eins oder SNF zwei H zu bestimmen. Ein repräsentatives Ergebnis ist hier dargestellt.

Dieser Blot wurde mit Antikörpern gegen SNF 2 H und Alpha-Tubulin gefärbt. Letzterer dient als Ladekontrolle für zwei der Klone. Nummer vier und Nummer fünf zeigten eine starke Reduktion von SNF zwei H nach Doxycyclin-Induktion und wurden daher für den Einsatz im Knockdown-Experiment ausgewählt, das im nächsten Abschnitt demonstriert wird.

Die unbehandelten Zellen in der dritten Platte werden verwendet, um die selektierte Zelllinie zu erweitern, und die Aliquots dieser Zellen werden anschließend eingefroren. Zur weiteren Verwendung zur Induktion des Knockdowns von ACF-Eins- oder SNF-Zwei-H-Plattenzellen in selektivem Medium in 10-Zentimeter-Platten geben Sie Doxycyclin in einer Menge von einem Mikrogramm pro Milliliter in die Hälfte der Platten und inkubieren Sie 48 bis 72 Stunden lang bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid. Jede Gruppe von Platten muss die Zellen für 12 Sechs-Zentimeter-Platten enthalten, einschließlich zwei Duplikate für den DPI-Assay für jeden Punkt sowie eine Platte für die Western-Blot-Analyse jeder Probe.

48 bis 72 Stunden nach der Induktion Trypsin nasen die Zellen aus jeder Zellgruppe und nach ihrer Zählung Platte 1,5 mal 10 auf die sechs Zellen pro sechs Zentimeter Platte im selben Medium mit oder ohne Doxycyclin. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius, 5% Kohlendioxid über Nacht am Folgetag, transfizieren Sie die Zellen. Wie angegeben.

Sowohl die unbehandelten als auch die mit Doxycyclin behandelten Zellen werden auf vier Arten in dreifacher Ausfertigung transfiziert. Eines mit einem leeren Plasmid und einem Plasmid, das GFP exprimiert, zwei mit dem leeren Plasmid sowie ein Vektor, der SHRA-resistentes ACF exprimiert, ein GFP oder SNF zwei HGFP, drei mit einem Plasmid, das für E vier oder vier kodiert, und ein Plasmid, das GFP exprimiert, und mit dem Plasmid, das für E vier kodiert, alle vier. Und der Vektor, der SHRA-resistentes ACF, ein GFP oder SNF zwei HGFP exprimiert, inkubiert nach der Transfektion alle Platten über Nacht bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid.

Am Tag nach der Transfektion der Zellen werden Proteine aus einer Platte pro Probe für die Western-Blot-Analyse extrahiert, um festzustellen, ob ACF eins oder SNF zwei H effizient abgebaut wurde und dass E vier oder vier in den verschiedenen Proben gleichmäßig exprimiert wurde. Die restlichen 16 Platten werden für den DPI-Assay verwendet. Aspirieren Sie das Medium aus den für den DPI-Assay vorgesehenen Platten und waschen Sie die Zellen vorsichtig mit PBS in einer chemischen Haube.

Fügen Sie einen Milliliter 4%para-Formaldehyd hinzu, das in PBS hergestellt wurde, um die Zellen abzudecken und 15 Minuten lang bei Raumtemperatur zu inkubieren, ohne zu schütteln. Aspirieren Sie das para-Formaldehyd und waschen Sie es mit PBS und schütteln Sie es fünf Minuten lang bei Raumtemperatur. Wiederholen Sie die Wäsche noch zwei weitere Male für insgesamt drei Wäschen nach der dritten PBS-Wäsche bei 80 % Ethanol, gehalten bei minus 20 Grad Celsius und inkubieren Sie mindestens eine Stunde lang bei minus 20 Grad Celsius.

Aspirieren Sie das Ethanol und waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS, schütteln Sie jedes Mal fünf Minuten lang bei Raumtemperatur, waschen Sie es einmal fünf Minuten lang bei Raumtemperatur, wobei PBS 0,5 % BSA und 0,05 % zwischen 20 oder P-B-S-B-T enthält. Auch mit Schütteln, um eine unspezifische Antikörperbindung zu verhindern. Blockieren Sie die Zellen in einem Milliliter P-B-S-B-T-Puffer mit 10 % Ziegenserum für 20 Minuten, während Sie sie bei Raumtemperatur schütteln.

Waschen Sie dann die Zellen zweimal in P-B-S-B-T jeweils fünf Minuten. Inkubieren Sie die Zellen mit dem Primärantikörper, in diesem Fall einem E-, Vier- oder Vier-spezifischen Antikörper, in einem Milliliter P-B-S-B-T für eine Stunde unter Schütteln bei Raumtemperatur. Dann zweimal in P-B-S-B-T und einmal in PBS mit 0,1 % BSA waschen, jeweils fünf Minuten.

Als nächstes fügen Sie den Zellen einen Milliliter PBS 0,1 % BSA hinzu, der den entsprechenden sekundären fluoreszenzmarkierten Antikörper und 0,5 Mikrogramm pro Milliliter enthält. Die endgültige Konzentration von DPI inkubiert 40 Minuten lang unter Schütteln bei Raumtemperatur im Dunkeln. Zum Schluss fünf Minuten lang mit PBS waschen.

Trocknen Sie die Vertiefung durch Aspiration und stellen Sie die Platten eine weitere Stunde bis über Nacht auf den Kopf, um eine vollständige Trocknung zu erreichen, und bedecken Sie sie mit Aluminiumfolien-Abdeckobjektträgern auf den Zellen mit flora Mount G-Lösung. Bewahren Sie die Platten bei vier Grad Celsius im Dunkeln auf, bis sie zum Zählen bereit sind. Die apoptotischen Zellkernzellen, die den verschiedenen im Protokoll beschriebenen Behandlungen unterzogen wurden, wurden fixiert und mit E, vier oder vier spezifischen Antikörpern und DPI gefärbt, um die Zellkerne der transfizierten Zellen sichtbar zu machen.

Diese Abbildung zeigt ein Beispiel von Zellen, die E vier oder vier exprimieren, und GFP-Panel A zeigt die Kontroll-GFP-Proteinexpression allein, und Panel B zeigt die Expression von E vier oder vier Expressions-DAPI-Färbekern sind in Panel C zu sehen, und die zusammengefügten Bilder sind in Panel D zu sehen.Die weißen Pfeile markieren GFP und E.Vier oder vier transfizierte Zellen, die Kerne mit apoptotischer Morphologie enthalten. Rote Pfeile markieren Kerne mit unregelmäßigen Formen, die nicht als apoptotische Kerne gezählt werden, Sternchen markieren mitotische Kerne oder Kerne, die gerade die Anzahl der kondensierten oder fragmentierten Kerne geteilt haben, die durch DAPI visualisiert werden. Die Färbung wurde gezählt, um den Prozentsatz der Zellkerne mit apoptotischer Morphologie innerhalb der transfizierten Zellpopulation zu berechnen und so eine optimale Objektivität des Tests zu gewährleisten.

Die Zählung des apoptotischen Nukleos in den verschiedenen Proben erfolgte in einer blinden Weise, bei der die zählende Person sich der Probenidentität nicht bewusst war. Ein repräsentatives Ergebnis ist in dieser Grafik dargestellt. Höhere Prozentsätze von nuklearen Anomalien wurden in E vier oder vier exprimierenden Zellen beobachtet, was bestätigt, dass T vier oder vier den Zelltod induziert. Der höchste Prozentsatz an nuklearen Anomalien wurde in E vier oder vier exprimierenden Zellen beobachtet, bei denen die Spiegel von ACF 1 durch SHR reduziert wurden und ein vermittelter Knockdown darauf hindeutet, dass ein ACF 1-Knockdown die Toxizität von E vier oder vier erhöht, der Tod von Inge die Toxizität von E vier oder vier erhöhte.

Die Expression niedriger ACF-Spiegel eins resultierte nicht aus einem Anstieg der E-Spiegel um vier oder vier Stimmen, wie beim Western Blot. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, eine sinnvolle Zählung des apoptotischen Kernstent mit DPI zu ermöglichen und strenge Kriterien für die Identifizierung dieses Kerns anzuwenden. Zusätzlich zu diesem Verfahren können andere Methoden, wie z. B. Klon-Gen-Assays, durchgeführt werden, um die Ergebnisse der DAPSE zu validieren.

Andere Methoden, wie z.B. Co-Immunpräzipitations-Assays, können durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten. Zum Beispiel, ob es eine physikalische Wechselwirkung zwischen den untersuchten Proteinen gibt.