Gewebecharakterisierung nach einer neuen Disaggregation Methode für Haut Micro-Grafts-Generation

Das übergeordnete Ziel dieser chirurgischen Erfindung besteht darin, autologe Hautmikrotransplantate herzustellen, die sofort in derselben Operation zur Wundheilung verwendet werden können. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im Bereich der regenerativen Medizin und des Skin Tissue Engineering zu beantworten, z. B. zu chronischer Wundheilung, Verbrennungen und posttraumatischen Geschwüren. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass sie vom Arzt ohne erwartete Technik sehr einfach anzuwenden ist und ebenso schnell und erschwinglich ist.

Verwenden Sie zunächst einen Biopsiestempel, um Hautproben von einem Patienten zu entnehmen. Entfernen und entsorgen Sie dann die Epithelschicht. Kombinieren Sie jede Gewebeprobe mit 1 Milliliter Kochsalzlösung, um autologe Mikrotransplantate zu erzeugen.

Um Biokomplexe für die klinische Anwendung vorzubereiten, geben Sie 1 Milliliter der Mikrotransplantatlösung auf Kollagenschwämme. Tragen Sie den Biokomplex sofort auf die verletzte Stelle des Patienten auf. Um in vitro die Lebensfähigkeit des Biokomplexes zu testen.

Nach dreitägiger Kultur 0,3 % Formalin direkt auf die Biokomplexe gießen und 10 Minuten bei Raumtemperatur fixieren. Verwenden Sie ein Mikrotom, um 5 Mikrometer dicke Abschnitte zu schneiden und direkt auf einen Objektträger zu montieren. Legen Sie dann die Abschnitte drei Minuten lang in 15 bis 20 Milliliter Xylol.

Tauchen Sie anschließend die Scheiben jeweils eine Stunde lang in abnehmendes Ethanol, bevor Sie sie in entionisiertes Wasser legen, um die Abschnitte zu entparaffinisieren und zu rehydrieren. Verwenden Sie dann 1 bis 2 Milliliter 1 Gramm pro Liter Hämatoxylin für ein bis zwei Minuten, um die Abschnitte zu färben. Und geben Sie es in Wasser, um den Fleck abzuspülen.

Nun mit 1 bis 2 Millilitern 1 % Eosin Y und 70 % Ethanol in Wasser verdünnen, färben Sie die Abschnitte vier bis fünf Minuten lang. Spülen Sie die Rutschen dann mit fließendem Leitungswasser ab. Tauchen Sie die Abschnitte jeweils eine Stunde lang in steigende Konzentrationen von Ethanol, bevor Sie eine einstündige Inkubation in Xylol durchführen.

Tragen Sie abschließend ein Eindeckmedium auf die Proben auf, bevor Sie ein Deckglas hinzufügen. Betrachten Sie dann unter einem Lichtmikroskop bei 100-facher Vergrößerung. Entnehmen Sie mit einem Dermatom 0,6 Millimeter, 1 Millimeter oder 0,2 Millimeter dicke Papillen-, Tot- oder Dermisproben aus den Rumpfbereichen von vier 40 bis 55 Jahre alten Mehrgewebespendern nach den nationalen Vorschriften für die Entnahme.

Geben Sie die Proben in 0,9 %NaCl und legen Sie sie fünf Minuten lang auf einen Orbitalschüttler, um das Gewebe vorsichtig zu spülen. Erstellen Sie mit einem 5-Millimeter-Biopsiestanzen Proben mit einheitlichem Durchmesser aus dem Hautgewebe, dem toten Gewebe und der Dermis und wiegen Sie alle Gewebeproben. Als nächstes werden acht, drei oder vier gleichmäßige Proben von Hautgewebe, abgestorben bzw. dermis, in den Gewebedisruptor eingeführt und 1,5 Milliliter Kochsalzlösung für die Disaggregation hinzugefügt.

Sie die Disaggregation für alle Gewebeproben durch, wie in dieser Tabelle angegeben. Verwenden Sie als Kontrollen eine entsprechende Anzahl von Stanzbiopsien aus intakten Gewebeproben. Nach der mechanischen Disaggregation aspirieren Sie die Kochsalzlösung mit Mikrotransplantaten und geben Sie jede Probe separat in eine einzelne Vertiefung einer 12-Well-Platte.

Geben Sie 1 Milliliter RPMI-1640 Medium, ergänzt mit 10 % FBS und Antibiotika, zu jeder Probe. Um die Lebensfähigkeit der Zellen zu bewerten, fügen Sie in jede Vertiefung 1 Milliliter Medium mit 0,5 Milligramm pro Milliliter MTT-Lösung hinzu und inkubieren Sie drei Stunden lang bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid. Entfernen Sie nach der Inkubation das MTT-Medium und ersetzen Sie es durch 1 Milliliter DMSO.

Nach einer 10-minütigen Inkubation wird jede Probe in DMSO in eine Küvette überführt und mit einem Spektralphotometer die optische Dichte bei 570 Nanometern abgelesen. Berechnen Sie die Zellviabilität als Verhältnis der Absorption bei 570 Nanometern und dem Gewicht und den Gramm des verwendeten Gewebes vor der Disaggregation. Sobald die Kochsalzlösung aus dem Hautgewebe, den toten und dermisfarbenen Proben eines einzelnen Spenders aspiriert wurde, wird jede Probe separat in eine Vertiefung einer 12-Well-Platte für einen Zellviabilitätstest oder einen Kulturkolben für die morphologische Analyse gegeben.

Geben Sie 1 Milliliter RPMI-1640 mit 10 % FBS und Antibiotika in die 12-Well-Platte oder 5 Milliliter in den Kulturkolben und kultivieren Sie ihn bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid für 24 Stunden bzw. sieben Tage. Verwenden Sie nach 24 Stunden Lichtmikroskopie, um eine morphologische Analyse durchzuführen, indem Sie das Vorhandensein von Zellsuspension bewerten. Wiederholen Sie dies am siebten Tag.

Bei der FACS-Analyse werden die Dermisproben von mesenchymalen und hämatopoetischen Zellmarkern wie CD146, CD34 und CD45 analysiert. Geben Sie Medium zu den entsegregierten Zellen und inkubieren Sie sie drei Tage lang bei 37 Grad Celsius. Und beurteilen Sie die Sterilität des Gewebes, indem Sie die mikrobiologische Analyse wie zuvor beschrieben durchführen.

Wie hier gezeigt, wurden humane autologe Mikrotransplantate, die unmittelbar auf den Kollagenträger geladen wurden, in eine Beinläsion implantiert. Und eine vollständige Reepithelisierung, die mit der Gewebereparatur verbunden war, wurde nach 30 Tagen beobachtet. Darüber hinaus zeigte die klinische Nachuntersuchung nach fünf Monaten eine gute Textur und Weichheit der geschädigten Stelle.

Wie in dieser Tabelle aufgeführt, wurden die Schwellenwerte von acht, vier und drei Biopsien festgelegt, die in einem einzigen Schritt verarbeitet werden können, und die Gewebe wurden zu vier verschiedenen Zeitpunkten disaggregiert, um optimale Disaggregationsbedingungen zu identifizieren, um eine gute Zellviabilität zu erhalten. Die in diesem Video gezeigte mechanische Disaggregation behält einen Mittelwert von 30 % Zellviabilität in allen Hautproben, toten und Dermis, bei, wenn sie zu unterschiedlichen Zeitpunkten in Bezug auf intaktes Gewebe ausgewertet wird. Dieses Transplantat zeigt, dass nach 24 Stunden oder sieben Tagen in Kultur zum Zeitpunkt der Homogenisierung in Kultur im Vergleich zum Startzeitpunkt keine wesentliche Variation der Zellviabilität in Hautgewebeproben beobachtet wurde.

Es wurde jedoch eine verminderte Lebensfähigkeit toter Proben nach 24 Stunden in Kultur im Vergleich zum Startzeitpunkt beobachtet. Die Lebensfähigkeit der Zellen war jedoch nach sieben Tagen in Kultur wiederhergestellt. Ähnliche Ergebnisse wurden für die Dermis beobachtet.

Wenn diese Technik gemeistert wird, kann sie in fünf Minuten ausgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, die Epithelschicht von der Haut zu entfernen. Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Methoden wie die Disaggregation des Knochengewebes durchgeführt werden, um andere Fragen wie den Knochenheilungsmechanismus zu beantworten.

Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der regenerativen Medizin und des Tissue Engineering, um die Gewebeheilung bei Patienten zu erforschen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie dieses Mikrotransplantatverfahren durchführen. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit dem Gewebe äußerst gefährlich sein kann.

Und die Vorsichtsmaßnahmen wie eine Schutzbrille sollten immer getroffen werden, wenn Sie diesen Vorgang durchführen.