Gewebecharakterisierung nach einer neuen Disaggregation Methode für Haut Micro-Grafts-Generation

Das übergeordnete Ziel dieser chirurgischen Erfindung besteht darin, autologe Hautmikrotransplantate herzustellen, die sofort im Rahmen derselben Operation zur Wundheilung verwendet werden können. Diese Methode kann dabei helfen, zentrale Fragen auf dem Gebiet der regenerativen Medizin und des Hautgewebe-Engineerings zu beantworten, beispielsweise im Zusammenhang mit der Heilung chronischer Wunden, Verbrennungen und posttraumatischer Ulzera. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie vom Arzt ohne spezielle Fachkenntnisse sehr einfach anzuwenden ist und zudem schnell sowie kostengünstig ist.

Beginnen Sie damit, mithilfe einer Biopsiezange Hautproben von einem Patienten zu entnehmen. Entfernen und entsorgen Sie anschließend die epidermale Schicht. Geben Sie jede Gewebeprobe mit 1 Milliliter Kochsalzlösung zusammen, um autologe Mikrotransplantate herzustellen.

Um Biokomplexe für die klinische Anwendung vorzubereiten, 1 Milliliter der Mikrotransplantat-Lösung auf Kollagenschwämme übertragen. Den Biokomplex unverzüglich auf die verletzte Stelle des Patienten aufbringen. Um die Lebensfähigkeit des Biokomplexes in vitro zu testen.

Nach dreitägiger Kultur 0,3 % Formalin direkt auf die Biokomplexe geben und 10 Minuten bei Raumtemperatur fixieren. Mit einem Mikrotom Schnitte von 5 Mikrometern Dicke anfertigen und direkt auf einen Objektträger aufbringen. Anschließend die Schnitte für drei Minuten in 15 bis 20 Milliliter Xylol geben.

Anschließend die Schnitte zur Entparaffinierung und Rehydratation jeweils eine Stunde in absteigenden Ethanolkonzentrationen baden und danach in entionisiertes Wasser überführen. Danach die Schnitte mit 1 bis 2 Milliliter einer 1 Gramm pro Liter Lösung von Hämatoxylin für ein bis zwei Minuten anfärben. Danach zur Entfernung der Färbung in Wasser überführen.

Jetzt die Schnitte mit 1 bis 2 Milliliter 1 % Eosin Y in 70 % Ethanol ansetzen und vier bis fünf Minuten lang einfärben. Anschließend die Objektträger mit fließendem Leitungswasser abspülen. Danach die Schnitte nacheinander eine Stunde lang in aufsteigenden Ethanol-Konzentrationen inkubieren, gefolgt von einer einstündigen Inkubation in Xylol.

Schließlich wird ein basisches Eindeckmittel auf die Proben aufgetragen, bevor ein Deckglas hinzugefügt wird. Anschließend erfolgt die Beobachtung unter dem Lichtmikroskop bei 100facher Vergrößerung. Mithilfe eines Dermatoms werden 0,6 Millimeter, 1 Millimeter beziehungsweise 0,2 Millimeter dicke Proben der Papillarschicht, der toten Haut oder der Dermis aus den Rumpfbereichen von vier Spender*innen mit multiplen Geweben im Alter von 40 bis 55 Jahren gemäß den nationalen Vorschriften zur Gewinnung entnommen.

Geben Sie die Proben in 0,9 % NaCl und stellen Sie sie fünf Minuten lang auf einen Rotations-Schüttler, um das Gewebe vorsichtig zu spülen. Erstellen Sie mit einer 5-Millimeter-Biopsiepunchvorrichtung Proben mit einheitlichem Durchmesser aus dem Hautgewebe, der Hornschicht und der Dermis, und wiegen Sie alle Gewebeproben. Fügen Sie anschließend acht, drei bzw. vier einheitliche Proben aus Hautgewebe, Hornschicht oder Dermis in den Gewebemazerator ein und geben Sie 1,5 Milliliter Kochsalzlösung zur Disaggregation hinzu.

Führen Sie die Disaggregation für alle Gewebeproben wie in dieser Tabelle angegeben durch. Verwenden Sie eine entsprechende Anzahl von Stanzbiopsien, die aus intakten Gewebeproben gewonnen wurden, als Kontrollen. Nach der mechanischen Disaggregation pipettieren Sie die Salzlösung, die Mikrotransplantate enthält, ab und geben jede Probe einzeln in eine einzelne Vertiefung einer 12-Loch-Platte.

Gebe 1 Milliliter RPMI-1640-Medium, ergänzt mit 10 % FBS und Antibiotika, zu jeder Probe hinzu. Zur Bestimmung der Zellviabilität gebe jedem Well 1 Milliliter Medium mit 0,5 Milligramm pro Milliliter MTT-Lösung hinzu und inkubiere drei Stunden bei 37 °C und 5 % Kohlendioxid. Nach der Inkubation entferne das MTT-Medium und ersetze es durch 1 Milliliter DMSO.

Nach einer Inkubation von 10 Minuten überführen Sie jede Probe in DMSO in eine Küvette und messen mit einem Spektrophotometer die optische Dichte bei 570 Nanometern. Berechnen Sie die Zellviabilität als Verhältnis der Absorption bei 570 Nanometern zur Masse in Gramm des vor der Disaggregation verwendeten Gewebes. Danach, sobald die Kochsalzlösung aus dem Hautgewebe abgesaugt wurde, geben Sie die toten und Dermis-Proben von einem einzelnen Spender jeweils separat in eine Vertiefung einer 12-Loch-Platte für einen Zellviabilitätstest oder in einen Kulturkolben zur morphologischen Analyse.

Gebe 1 Milliliter RPMI-1640 mit 10 % FBS und Antibiotika in die 12-Loch-Platte oder 5 Milliliter in den Kulturflasche und kultiviere bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid für 24 Stunden bzw. sieben Tage. Führe nach 24 Stunden eine morphologische Analyse mittels Lichtmikroskopie durch, indem du das Vorhandensein von Zellsuspension bewertest. Wiederhole am siebten Tag.

Analysieren Sie mithilfe der FACS-Analyse die Dermisproben hinsichtlich mesenchymaler und hämatopoetischer Zellmarker wie CD146, CD34 und CD45. Geben Sie Medium zu den dissoziierten Zellen und inkubieren Sie drei Tage bei 37 Grad Celsius. Überprüfen Sie die Sterilität des Gewebes durch mikrobiologische Analyse, wie zuvor beschrieben.

Wie hier gezeigt, wurden humane autologe Mikrotransplantate, die unmittelbar auf einem Kollagen-Träger aufgebracht wurden, in eine Beinläsion implantiert. Nach 30 Tagen wurde eine vollständige Reepithelialisierung in Verbindung mit einer Gewebeheilung beobachtet. Zudem zeigte die klinische Nachuntersuchung nach fünf Monaten eine gute Textur und Weichheit des betroffenen Bereichs.

Wie in dieser Tabelle aufgeführt, wurden die Schwellenwerte von acht, vier bzw. drei Biopsien festgelegt, die in einem einzigen Schritt verarbeitet werden können, und die Gewebe wurden zu vier verschiedenen Zeitpunkten disaggregiert, um die optimalen Bedingungen für die Disaggregation zur Aufrechterhaltung einer guten Zellviabilität zu ermitteln. Die in diesem Video gezeigte mechanische Disaggregation weist bei allen Hautproben – totes Gewebe und Dermis – einen mittleren Wert von 30 % Zellviabilität auf, wenn sie zu unterschiedlichen Zeitpunkten im Vergleich zum intakten Gewebe bewertet wird. Diese Grafik zeigt, dass nach 24 Stunden oder sieben Tagen Kultur keine wesentliche Veränderung der Zellviabilität in den Hautgewebeproben im Zeitpunkt der Homogenisierung in Kultur gegenüber dem Ausgangszeitpunkt beobachtet wurde.

Jedoch wurde eine verminderte Vitalität von toten Proben nach 24 Stunden in Kultur im Vergleich zum Startzeitpunkt beobachtet. Die Zellviabilität wurde jedoch nach sieben Tagen in Kultur wiederhergestellt. Ähnliche Ergebnisse wurden für die Dermis beobachtet.

Wenn sie beherrscht wird, kann diese Technik in fünf Minuten durchgeführt werden, sofern sie ordnungsgemäß ausgeführt wird. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, die epidermale Schicht von der Haut zu entfernen. Nach diesem Verfahren können weitere Methoden wie die Disaggregation von Knochengewebe angewendet werden, um weitere Fragestellungen, beispielsweise zum Heilungsmechanismus von Knochen, zu untersuchen.

Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik Forschern auf dem Gebiet der regenerativen Medizin und des Gewebeengineerings den Weg, um die Gewebeheilung bei Patienten zu untersuchen. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man dieses Mikrotransplantat-Verfahren durchführt. Vergessen Sie nicht, dass das Arbeiten mit Gewebe äußerst gefährlich sein kann.

Und die Vorsichtsmaßnahmen wie zum Beispiel Schutzbrille sollten stets beachtet werden, während dieser Vorgang durchgeführt wird.