Amphotericin-B-vermittelte perforierte Patch-Clamp-Analyse: Eine elektrophysiologische Technik zur Untersuchung von Ionenströmen in Harnblasenzellen

perforierte Patch-Clamp-Technik ermöglicht Echtzeitmessungen von Ionenströmen, die mit der Aktivität von Ionenkanälen auf Zellen wie Detrusor-Glattmuskelzellen (DSM) der Harnblase verbunden sind.

Laden Sie zunächst die DSM-Zellsuspension in eine Glaskammer und inkubieren Sie, um die Zelladhärenz zu ermöglichen. Als nächstes fügen Sie den anhaftenden Zellen eine extrazelluläre Lösung hinzu, die Tetraethylammonium- und Cäsium-Ionen enthält. Diese Kationen blockieren Kaliumkanäle auf der Zellmembran und hemmen die störenden Kaliumströme.

Nehmen Sie anschließend eine polierte Patch-Clamp-Pipette - ein dünnes hohles Glasröhrchen, das eine Aufnahmeelektrode enthält, die an einen Verstärker angeschlossen ist. Füllen Sie die Pipette mit einer intrazellulären Lösung und füllen Sie sie mit der gleichen Lösung auf, die jedoch Amphotericin-B, ein membranperforierendes Antibiotikum, enthält.

Tauchen Sie nun die Pipettenspitze in die extrazelluläre Lösung mit DSM-Zellen ein. Nachdem Sie das Potential und den Strom auf die entsprechenden Werte eingestellt haben, schieben Sie die Pipettenspitze in Richtung Zellmembran und überwachen Sie gleichzeitig den Elektrodenwiderstand.

Ein rascher Anstieg des Widerstandswertes zeigt an, dass die Pipettenspitze die Zellmembran erreicht hat. Üben Sie nun einen sanften Sog an der Elektrode aus, um eine dichte Versiegelung namens Giga-Seal zwischen der Pipettenspitze und der Plasmamembran zu bilden.

Nach der Versiegelungsbildung diffundiert Amphotericin langsam in die Spitze und perforiert die Membran, wodurch sich Ionenporen bilden. Sobald eine optimale Perforation erreicht ist, bewegen sich die Ionen zwischen den Zellen und der Elektrode und erzeugen Ströme, die proportional zur Funktion des Ionenkanals sind.

Pipettieren Sie 0,25 bis 1 Milliliter Zellsuspension in eine Glasbodenkammer, die auf dem Tisch eines inversen Mikroskops steht, und inkubieren Sie sie mindestens 45 Minuten lang, damit die Zellen anhaften können. Nehmen Sie dann den DS aus dem Bad und ersetzen Sie ihn durch Superfusion durch E-Lösung.

Ziehen Sie mehrere Patch-Elektroden heraus, polieren Sie die Elektrodenspitzen und beschichten Sie die Spitzen bei Bedarf mit Zahnwachs. Füllen Sie die Spitze einer Patch-Elektrode mit der Pipettenlösung ohne Amphotericin-B, indem Sie die Elektrode kurz in die Lösung tauchen. Der Erfolg der Patch-Clamp-Elektrophysiologie hängt von der Qualität der DSM-Zellen und der Solubilisierung von Amphotericin-B ab.

Füllen Sie die Elektrode mit der gleichen Pipettenlösung, die Amphotericin-B enthält, und montieren Sie die Elektrode auf eine Halterung, die mit einem Patch-Clamp-Verstärkerkopftisch verbunden ist. Verwenden Sie einen Mikromanipulator, um die Elektrode knapp unter der Oberfläche der extrazellulären Lösung zu platzieren, so dass die Spitze der Elektrode gerade untergetaucht ist.

Bestimmen Sie dann den Elektrodenwiderstand mit der Membrantestfensterfunktion der kommerziellen Erfassungssoftware und schieben Sie die Elektrode in Richtung der gewünschten Zelle. Wenn Sie die Zelloberfläche mit der Elektrode berühren, bilden Sie eine Giga-Dichtung, indem Sie über einen Schlauch einen sanften, schnellen Unterdruck auf die Elektrode ausüben. Dies führt zu einem Unterdruck an der Spitze der Elektrode, was zu einer erfolgreichen Giga-Versiegelung führt, wie der Membrantest bestätigt.

Lassen Sie das Amphotericin-B 30 bis 60 Minuten über die Pipette diffundieren und in die Plasmamembran eingeführt werden, wobei es Poren bildet, die hauptsächlich für monovalente Kationen selektiv sind. Überwachen Sie die Giga-Versiegelung weiterhin mit der Membrantest-Funktion.

Wenn die Patch-Perforation optimal ist, heben Sie die Kapazitätstransienten auf, indem Sie die Drehregler für die Zellkapazität und den Serienwiderstand am Verstärker anpassen. Sobald die stabilen Spannungsschritt-Kationenströme beobachtet wurden, zeichnen Sie die Ströme mit dem Routing-Spannungsschrittprotokoll auf, wie im Manuskript beschrieben.