Expansion Pathology: Ein Verfahren zur hochauflösenden optischen Bildgebung klinischer Gewebeproben

Die Expansionspathologie (ExPath) ist eine Probenvorbereitungstechnik für biologische Proben, die es der konventionellen Lichtmikroskopie ermöglicht, nanoskalige Strukturen abzubilden, indem sie mit einem Polymersystem expandiert werden.

Nehmen Sie zunächst einen aufbereiteten immungefärbten Objektträger und bedecken Sie ihn mit einer Verankerungslösung, die sowohl Protein- als auch polymerreaktive Gruppen enthält. Die proteinreaktive Gruppe des Verankerungsreagenzes bindet an die Amine von Biomolekülen in Zellen.

Geben Sie dann eine geeignete Gelierlösung über die Probe und inkubieren Sie, damit sie im Gewebe diffundieren kann. Die polymerreaktive Gruppe des Verankerungsreagenzes bindet an die freien Monomere in der Gelierlösung, so dass sich die Biomoleküle bei der Polymerisation am Polymer verankern können.

Sobald die Polymerisation der Probe abgeschlossen ist, bedecken Sie den Objektträger mit einer Proteinaselösung. Proteinasen verdauen Proteine des Zytoskeletts, um strukturelle Widerstände zu beseitigen, so dass sich die Zellen ausdehnen können, ohne zu reißen. Beim enzymatischen Aufschluss löst sich die gelierte Probe vom Objektträger und geht in Suspension.

Füllen Sie nun die Probe in einen geeigneten Waschpuffer in einem mikroskopgeeigneten Behälter um. Ersetzen Sie anschließend den Puffer durch Wasser und inkubieren Sie. Das Polymer nimmt im Verhältnis zu seiner Masse enorm viel Wasser auf und quillt auf.

Wenn sich das Polymer ausdehnt, bewegen sich die Biomoleküle, die an das Polymernetzwerk gebunden sind, auseinander, während sie ihre räumliche Orientierung behalten. Dies ermöglicht eine einfache Visualisierung unter einem herkömmlichen Lichtmikroskop.

Bereiten Sie die Verankerungslösung gemäß den Anweisungen des Manuskripts vor. Legen Sie die Objektträger in eine 100-Millimeter-Petrischale. Pipettieren Sie die Verankerungslösung über das Gewebe und inkubieren Sie sie mindestens 3 Stunden lang bei Raumtemperatur. Bereiten Sie dann die Gelierlösung gemäß den Anweisungen des Manuskripts vor.

Entfernen Sie überschüssige Verankerungslösung aus dem Gewebeschnitt und setzen Sie den Objektträger wieder in die Petrischale ein. Geben Sie frische, kalte Gelierlösung in die Probe und inkubieren Sie die Mischung 30 Minuten lang bei 4 Grad Celsius. Um auf dem Objektträger eine Kammer um die Probe herum zu konstruieren, stellen Sie Abstandshalter her, indem Sie mit einem Diamantmesser dünne Stücke des Deckglases schneiden. Befestigen Sie die Abstandshalter auf beiden Seiten des Gewebes mit Wasser und legen Sie vorsichtig einen Deckglasdeckel über den Objektträger, wobei Sie darauf achten müssen, dass keine Luftblasen über dem Gewebe eingeschlossen werden.

Inkubieren Sie die Probe dann 2 Stunden lang bei 37 Grad Celsius in einer befeuchteten Umgebung. Entfernen Sie den Deckel der Gelierkammer, indem Sie eine Rasierklinge vorsichtig unter das Deckglas schieben und sie langsam von der Geloberfläche abheben. Schneiden Sie das leere Gel um das Gewebe herum, um das Volumen zu minimieren, und achten Sie darauf, das Gel asymmetrisch zu schneiden, um die Ausrichtung zu verfolgen.

Verdünnen Sie Proteinase K 1:200 in Verdauungspuffer und stellen Sie sicher, dass genügend Lösung vorbereitet ist, um das Gel vollständig einzutauchen. Inkubieren Sie dann die Probe mit der Lösung in einem geschlossenen Behälter für 3 Stunden bei 60 Grad Celsius. Wenn sich die Probe während des Aufschlusses nicht ablöst, verwenden Sie eine Rasierklinge, um sie vorsichtig zu entfernen.

Verwenden Sie einen weichen Pinsel, um die Probe in 1X PBS in einen Behälter zu überführen, der mit dem gewünschten Bildgebungssystem kompatibel und groß genug ist, um das vollständig expandierte Gel aufzunehmen. Waschen Sie die Probe 10 Minuten lang in PBS und legen Sie sie, falls gewünscht, mit 300 Millimolar DAPI auf. Erweitern Sie die Proben, indem Sie die Probe 3 bis 5 Mal 10 Minuten lang pro Waschgang mit einem überschüssigen Volumen aus doppelt destilliertem Wasser waschen. Führen Sie dann eine Fluoreszenzbildgebung durch.

• Expansion Pathology (ExPath) - A sample preparation technique for biological specimens.
• Acryloyl-X SE - A protein-reactive group used in the anchoring solution during ExPath.
• BP160/100 - Another term for the anchoring solution used in ExPath.
• P06-1.5H-N - A specific type of gelling solution used in ExPath.
• Gelling Solution - The solution that allows biomolecules to anchor to the polymer in ExPath.

• Introduce Expansion Pathology (ExPath) – A sample preparation technique that enables conventional light microscopy to better visualize nano-scale structures (e.g., ExPath).
• Key Concepts – This includes the use of an anchoring solution and a gelling solution which helps in better visualization (e.g., Acryloyl-X SE, P06-1.5H-N).
• Underlying Mechanisms – These involve the biomolecules anchoring to the polymer as it gets polymerized, followed by the expansion of this polymer (e.g., BP160/100).
• Connect to Experiment – This technique eventually allows biomolecules to retain their spatial orientation while being easily visualized under a microscope.

• What is Expansion Pathology (ExPath) and how does it help in sample preparation for biological specimens?
• What are the steps and key elements used in the Expansion Pathology process?
• How does the use of specific solutions like Acryloyl-X SE and P06-1.5H-N impact the procedure?

• Practical Applications – Expansion Pathology (ExPath) enhances the visualization process in microscopy (e.g., medical research).
• Industry Impact – Sectors like biomedical research and healthcare benefit from this procedure (e.g., diagnostics).
• Societal Importance – Enhancing our ability to study and understand biological specimens at a nano-scale (e.g., medical advancements).
• Link to Scientific Advancements – Improvements in visual imaging can lead to scientific breakthroughs (e.g., disease treatment).