Blut-Hirn-Tumor-Schranke oder BBTB-Modell: Eine Anpassung des Blut-Hirn-Schranken- oder BHS-Modells zur Bewertung der Verabreichung von Therapeutika an den Tumor

Die Blut-Hirn-Schranke (BHS) ist eine selektive Barriere aus Endothelzellen und Gehirnzellen wie Astrozyten, die den Transport von Substanzen zwischen dem Blut und dem Gehirn reguliert.

Um ein BHS-Modell zu entwickeln, drehen Sie einen Membraneinsatz auf einen Kulturplattendeckel

Säen Sie Astrozyten über die Membran aus. Legen Sie die Kulturplatte über den Einsatz und inkubieren Sie.

Dadurch werden die Astrozyten zwischen der Membran und der Well-Oberfläche eingeschlossen.

Drehen Sie die Platte zurück, um die Astrozyten auf den Boden zu bringen und ein geeignetes Medium in die Vertiefung zu geben.

Fügen Sie dem Insert Endothelzellen hinzu, die optimale Tight-Junction-Proteine exprimieren, die die für die Barrierebildung notwendigen Zell-zu-Zell-Kontakte verbessern.

Inkubieren, damit die Endothelzellen an der Membran haften können.

Entfernen Sie das verbrauchte Medium und übertragen Sie den Einsatz in ein anderes gut enthaltendes, wachstumsfaktorfreies Astrozytenmedium.

Anschließend wird dem Einsatz ein wachstumsfaktorfreies Endothelzellmedium zugesetzt und inkubiert.

Das Fehlen von Wachstumsfaktoren hemmt die Zellteilung, wodurch die Zell-zu-Zell-Kontakte erhalten und die Barriereeigenschaften stabilisiert werden.

Die Endothelzellen und Astrozyten interagieren und bilden eine Basalmembran mit Tight Junctions wie der BHS.

Als nächstes säen Sie Gliom-Sphäroide in einer neuen Kulturvertiefung.

Übertragen Sie das BHS-Modell auf diese Sphäroide und inkubieren Sie, um die Blut-Hirn-Tumor-Schranke oder das BBTB-Modell zu bilden.

Fügen Sie dem BBTB-Modell Zielmoleküle hinzu, um deren Abgabe an die Tumorstelle zu beurteilen.

Waschen Sie die kultivierten Astrozyten unter einer sterilen Zellkulturhaube vorsichtig mit 5 Millilitern sterilem PBS. Verwenden Sie eine Vakuumpumpe, um das PBS vorsichtig zu verwerfen, und fügen Sie 5 Minuten lang 2 Milliliter Zelldissoziationsreagenz hinzu, um die Zellen zu lösen.

Geben Sie dann 10 Milliliter steriles vollständiges Astrozyten-Zellkulturmedium in das Gefäß, um die Aktivität des Zelldissoziationsreagenzes zu hemmen. Verwenden Sie eine sterile serologische Pipette, um die abgelösten Zellen aus dem Gefäß in ein steriles 15-Milliliter-Röhrchen zu übertragen.

Bei 250 x g 3 Minuten bei Raumtemperatur zentrifugieren. In der Zwischenzeit die Einsätze auslegen. Platzieren Sie die Einsätze mit einer sterilen Pinzette mit der Gehirnseite nach oben auf dem Deckel einer sterilen 6-Well-Platte.

Wenn die Zentrifugation abgeschlossen ist, verwerfen Sie den Überstand vorsichtig aus der Zellsuspension und resuspendieren Sie das Astrozyten-Pellet in 1 Milliliter ABM plus, indem Sie das Pellet vorsichtig bis zu fünfmal an der Röhrchenwand pipettieren.

Zählen Sie dann die Zellen und stellen Sie die Zellsuspensionsdichte auf 150.000 Zellen in 400 Mikrolitern ABM plus pro Einsatz ein. Platzieren Sie diese Zellsuspension in der Mitte der Gehirnseite der Membran des Einsatzes und verteilen Sie sie vorsichtig mit Kapillarkraft mit einer sterilen Pipettenspitze.

Setzen Sie die 6-Well-Platte mit der Gehirnseite der Einsätze wieder auf die Einsätze ein. Legen Sie die Platte und die Einsätze mit der Gehirnseite nach oben in einen Inkubator bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid, um die Zelladhäsion zu ermöglichen.

Setzen Sie danach die 6-Well-Platte wieder in ihre normale Position zurück, wobei die Einsätze nun mit der Blutseite nach oben zeigen. Fügen Sie Medium hinzu und setzen Sie die Inkubation wie im Textprotokoll beschrieben fort. Waschen Sie die kultivierten Endothelzellen unter einer sterilen Zellkulturhaube vorsichtig mit 5 Millilitern sterilem PBS.

Verwenden Sie eine Vakuumpumpe, um das PBS vorsichtig zu verwerfen, und fügen Sie 5 Minuten lang 2 Milliliter Zelldissoziationsreagenz hinzu, um die Zellen zu lösen. Geben Sie dann 10 Milliliter steriles vollständiges Endothelzellkulturmedium in das Gefäß, um die Aktivität des Zelldissoziationsreagenzes zu hemmen.

Verwenden Sie eine sterile serologische Pipette, um die abgelösten Zellen aus dem Gefäß in ein steriles 15-Milliliter-Röhrchen zu übertragen. Bei 250 x g 3 Minuten bei Raumtemperatur zentrifugieren. Danach verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Endothelzellpellet in 1 Milliliter EBM plus, indem Sie die Zellsuspension langsam bis zu fünfmal an der Wand des Röhrchens pipettieren.

Zählen Sie die Zellen und passen Sie die Zellsuspensionsdichte auf 200.000 Zellen in 2,5 Millilitern Endothelzellkultur an, ohne Serum und vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor-A pro Einsatz. Entnehmen Sie die Platte mit den Einsätzen.

Entsorgen Sie das Medium vorsichtig von der Blutseite und ersetzen Sie es durch die 2,5 Milliliter Endothelzellsuspension. Stellen Sie die Platte dann wieder in den Inkubator und lassen Sie sie über Nacht stehen, damit die Endothelzellen an der Membran haften können.

Bereiten Sie am nächsten Tag eine 6-Well-Platte vor, indem Sie 3 Milliliter vorgewärmtes ABM minus in jede Vertiefung geben. Berühren Sie die Einsätze mit einer sterilen Pinzette, um das endotheliale vollständige Medium vorsichtig von der Blutseite zu entfernen, und setzen Sie den Einsatz in die neue Platte mit ABM minus ein. Fügen Sie dann 2,5 Milliliter EBM minus hinzu.

Lassen Sie die Einsätze 5 Tage lang mit minimaler körperlicher Störung oder Temperaturschwankungen im Inkubator. Tauschen Sie das Medium am Tag der Übertragung aus. Für die Immunfluoreszenzbildgebung legen Sie bis zu vier runde sterile Borosilikat-Deckgläser in jede Vertiefung einer 6-Well-Platte, die 2 Milliliter Poly-D-Lysin enthält. 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.

In der Zwischenzeit verwenden Sie eine sterile serologische Pipette, um die Tumorkugeln vorsichtig aus dem Zellkulturgefäß in ein steriles 15-Milliliter-Röhrchen zu übertragen. Zentrifugieren Sie die Tumorkugeln bei 250 x g für 3 Minuten. Entsorgen Sie den Überstand und suspendieren Sie die Kugeln vorsichtig in 1 Milliliter GBM minus.

Zählen Sie die Zellen und stellen Sie die Zelldichte auf ca. 10.000 Kugeln oder 100.000 Zellen pro Milliliter GBM minus ein. Entsorgen Sie anschließend das Poly-D-Lysin aus den Vertiefungen und spülen Sie die Vertiefungen dreimal mit sterilem PBS aus. Besiedeln Sie jede Vertiefung der Platte mit 3 Millilitern der Tumorsphäroidsuspension und übertragen Sie die Inserts mit dem BBTB-Mimikat auf die Tumorzellsuspension.

Über Nacht bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid inkubieren, damit die Blut- und Hirntumorstellen des Assays ins Gleichgewicht kommen können. Ersetzen Sie am nächsten Tag das Medium auf der Blutseite durch EBM abzüglich, das mit den interessierenden Molekülen, Medikamenten oder Nanopartikeln ergänzt wird.