CRISPR-vermittelte Basen-Editing-Tools: Eine Genom-Editing-Technik zur Induktion einer gezielten Basensubstitution

Beginnen Sie für die CRISPR-vermittelte Genom-Editierung mit der HAP1-BE3-Kultur, einer haploiden Zelllinie mit einem integrierten BE-Gen, das für ein Baseneditor-Enzym kodiert. Fügen Sie dieser Kultur lentivirale Vektoren hinzu, die CRISPR-Cas9-Plasmid enthalten, das für ein spezifisches Ziel wie das menschliche Brustkrebsgen BRCA1 entwickelt wurde.

Das Lentivirus-Partikel verschmilzt mit der Wirtszellmembran und setzt das Plasmid frei, das sich schließlich in das Genom der Wirtszelle integriert, um die CRISPR-Cas9-BE-Gensegmente zu bilden. Diese Gene erzeugen eine BRCA1-targeting-gRNA, eine Cas9-Endonukompaktase und eine BE-Cytidin-Desaminase.

Die BRCA1-targeting-gRNA ist eine RNA, die mit Cas9 fusioniert und den Komplex zum BRCA1-Genlocus leitet. In der Nähe dieses Gens befindet sich ein Protospacer Adjacent Motif (PAM), an dem BE stabil andocken und sich stromaufwärts bewegen kann, um seine aktive katalytische Region zu erreichen. Hier erkennt der BE eine Cytidinbase und wandelt sie in Uridin um.

Diese Basensubstitutionsmutation löst die Cas9-Nuklease aus, um den unmodifizierten DNA-Strang zu durchtrennen. Der Bruch des DNA-Strangs aktiviert Reparaturenzyme, die die fehlende Base auffüllen und Uracil, eine Nicht-DNA-Base, in Thymin umwandeln. Insgesamt erzeugen diese Prozesse eine Genvariante.

Inkubieren Sie nun die Zellen unter physiologischen Bedingungen und in Subkultur, um die Genvariante zu vermehren. Extrahieren Sie genomische DNA und sequenzieren Sie sie, um die Effizienz der CRISPR-vermittelten Baseneditierung zu analysieren.

Säen Sie einen Tag vor der Transfektion 5 x 10⁵ HAP1-BE3-Zellen pro Well in 24-Well-Platten und kultivieren Sie sie, um eine Konfluenz von 70 % bis 80 % für die Transfektion zu erreichen. Transfect BRCA1-targeting-Guide-RNAs unter Verwendung der gekauften Transfektionsreagenzien gemäß dem Protokoll des Herstellers. Verwenden Sie 1 Mikrogramm BRCA1-Targeting-Guide-RNAs, um die Umwandlung von CG in TA an BRCA1-Zielstellen zu induzieren. Inkubieren Sie die Zellen dann bei 37 Grad Celsius und subkulturieren Sie alle 3 bis 4 Tage. Ernten Sie die Zellpellets 3, 10 und 24 Tage nach der Transfektion, um die Effizienz der Baseneditierung zu analysieren. Extrahieren Sie genomische DNA mit dem genomischen DNA-Aufreinigungskit.