JoVE-Enzyklopädie der Experimente
Biologische Techniken
0 Aufrufe • 2:58 Min. • July 8th, 2025
Beginnen Sie für die CRISPR-vermittelte Genom-Editierung mit der HAP1-BE3-Kultur, einer haploiden Zelllinie mit einem integrierten BE-Gen, das für ein Baseneditor-Enzym kodiert. Fügen Sie dieser Kultur lentivirale Vektoren hinzu, die CRISPR-Cas9-Plasmid enthalten, das für ein spezifisches Ziel wie das menschliche Brustkrebsgen BRCA1 entwickelt wurde.
Das Lentivirus-Partikel verschmilzt mit der Wirtszellmembran und setzt das Plasmid frei, das sich schließlich in das Genom der Wirtszelle integriert, um die CRISPR-Cas9-BE-Gensegmente zu bilden. Diese Gene erzeugen eine BRCA1-targeting-gRNA, eine Cas9-Endonukompaktase und eine BE-Cytidin-Desaminase.
Die BRCA1-targeting-gRNA ist eine RNA, die mit Cas9 fusioniert und den Komplex zum BRCA1-Genlocus leitet. In der Nähe dieses Gens befindet sich ein Protospacer Adjacent Motif (PAM), an dem BE stabil andocken und sich stromaufwärts bewegen kann, um seine aktive katalytische Region zu erreichen. Hier erkennt der BE eine Cytidinbase und wandelt sie in Uridin um.
Diese Basensubstitutionsmutation löst die Cas9-Nuklease aus, um den unmodifizierten DNA-Strang zu durchtrennen. Der Bruch des DNA-Strangs aktiviert Reparaturenzyme, die die fehlende Ba
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