Agarose-Gelelektrophorese von DNA-Amplikons nach der PCR: Eine Methode zur Analyse von Produkten der Multiplex-PCR und zur Bewertung des Erfolgs von PCR-Reaktionen

Zur Analyse von DNA-Amplikons - amplifizierten DNA-Fragmenten spezifischer Länge -, die aus der Multiplex-Polymerase-Kettenreaktion (PCR) hervorgegangen sind, wird unter Verwendung der Agarose-Gelelektrophorese eine Gießschale mit einem Kamm zusammengebaut, um Vertiefungen für die Probenbeladung zu schaffen.

Gießen Sie eine geeignete Konzentration geschmolzener Agarose, eines linearen Polysaccharids, gelöst in Elektrophoresepuffer, ergänzt mit einem fluoreszierenden DNA-Farbstoff, auf die Gießschale und lassen Sie es erstarren.

Die geschmolzene Agarose polymerisiert und bildet ein dreidimensionales Gel mit mikroskopisch kleinen Poren.

Geben Sie das gegossene Gel in einen Elektrophoresetank, wobei die Kammseite in der Nähe der negativen Kathode ausgerichtet ist. Der Tank enthält den Elektrophoresepuffer, der bei der Gelherstellung verwendet wird, um eine optimale Leitfähigkeit aufrechtzuerhalten. Den Kamm entfernen.

Übertragen Sie die PCR-Produktprobe, gemischt mit der Ladefarbstofflösung zur Überwachung der Probenmigration, in die Vertiefungen. Beladen Sie eine Vertiefung mit DNA-Leitern definierter Länge. Elektrophorese einleiten.

DNA-Amplikone mit gleichmäßig verteilten negativen Phosphatgruppen wandern aus den Vertiefungen in das Gel in Richtung der positiven Anode und werden aufgrund der hohen Beweglichkeit kürzerer Amplikons als größerer Amplikons nach ihrer Länge getrennt. Gleichzeitig wandert der positive fluoreszierende DNA-Farbstoff im Gel in die entgegengesetzte Richtung und verbindet sich mit DNA-Amplikons, wobei er zwischen den Basen interkaliert.

Nach der Elektrophorese das Gel mit ultraviolettem Licht abbilden. Für eine erfolgreiche PCR erscheinen die Farbstoff-interkalierten DNA-Amplikons als diskrete, fluoreszierende Banden, die der Leiter der erwarteten Amplikonlänge am nächsten liegen. Die Lampikonausbeute kann durch die Fluoreszenzintensität abgeschätzt werden.

Gemäß den Empfehlungen des Herstellers Agarose-Gelpulver in 1x TBE-Puffer auf 1,5 (Gewicht/Volumen) Prozent zugeben und erhitzen, um sich aufzulösen.

Kippen Sie die gelöste Gellösung vor dem Gießen kurz unter fließendem Wasser. Fügen Sie 5 Mikroliter fluoreszierenden Nukleinsäurefarbstoff pro 50 Mikroliter Gellösung hinzu und mischen Sie.

Montieren Sie die Gießschale und richten Sie sie aus. Fügen Sie je nach Anzahl der Proben Kämme hinzu. Gieße die Gellösung in den Gips und warte, bis sie sich verfestigt hat.

Tauchen Sie danach den Gips mit dem Gel in 1x FSME-Puffer in ein Gelelektrophoresesystem. Mischen Sie 5 Mikroliter der PCR-Produkte zusammen mit 2 Mikrolitern Ladefarbstoff in neuen PCR-Streifen. Übertragen Sie 5 Mikroliter der Mischungen in die Vertiefungen im Gel. Bewahren Sie mindestens eine Mulde leer auf. Geben Sie 5 Mikroliter DNA-Leiter als Referenz in die leere Vertiefung.

Stecken Sie die Elektroden ein und lassen Sie das Gel bei 110 Volt pro 15 Zentimeter etwa 1 Stunde lang laufen. Verwenden Sie ein UV-basiertes Gel-Bildgebungssystem, um das Vorhandensein mehrerer Banden zu überprüfen, die PCR-Amplikons darstellen.