Extrazellulärer Vesikelaufnahme-Assay: Eine Methode zur Visualisierung und Quantifizierung der zellulären Aufnahme von extrazellulären Vesikeln mit Hilfe der 3D-Fluoreszenzbildgebungstechnik

Um die zelluläre Kommunikation zu erleichtern, sezernieren Zellen extrazelluläre Vesikel, EVs - nanoskalige Strukturen, die von einer Lipidmembran umgeben sind. EVs transportieren verschiedene biologische Frachten, darunter Makromoleküle und Metaboliten, um sie an die Empfängerzellen zu liefern.

Um die Aufnahme von EV durch Zellen mit Hilfe der konfokalen Mikroskopie sichtbar zu machen, nehmen Sie zunächst frisch isolierte EVs. Diese EVs sind mit Antikörpern vormarkiert, die an eine Fluoreszenzsonde gebunden sind, um sie anschließend leicht sichtbar zu machen.

Geben Sie ein ausreichendes Volumen fluoreszenzmarkierter EVs in eine adhärente Empfängerzellkultur. Inkubieren Sie für den gewünschten Zeitraum. Während der Inkubation heftet sich eine Teilpopulation der markierten EVs oberflächlich an die Zelloberfläche, während andere EVs internalisiert werden.

Fügen Sie einen anderen Fluoreszenzfarbstoff hinzu, um das Zytoplasma der Zelle zu markieren und so internalisierte EVs von denen zu unterscheiden, die an der Empfängerzelle haften. Platzieren Sie die Küvetten unter einem konfokalen Mikroskop und bilden Sie Bilder in verschiedenen Fokusebenen entlang der z-Achse ab, wobei Sie eine Reihe von optischen Schnitten über die Probendicke aufnehmen.

Stellen Sie diese Sammlung optischer Schnitte - einen Z-Stapel - zusammen, um ein hochauflösendes, dreidimensionales Probenbild zu erstellen. Wenden Sie virtuelles Rendering an - ein Post-Imaging-Verfahren -, um die Zelloberflächen zu rekonstruieren.

Um oberflächlich angehaftete von internalisierten EVs zu unterscheiden, rendern Sie sie als Punkte in verschiedenen Farbtönen. Berechnen Sie das Zellvolumen und die Anzahl der von ihnen internalisierten EVs und quantifizieren Sie die EV-Aufnahme pro Zelle.

4 x 10⁴ PC3-Zellen in eine 35-Milliliter-Schale mit 1-Milliliter-Medium aussäen. Lassen Sie die Zellen über Nacht unter optimalen Zellkulturbedingungen anhaften. Waschen Sie die anhaftenden Zellen am nächsten Tag zweimal mit Exosomen-abgereicherten Medien.

Nachdem die fluoreszenzmarkierten EVs mit Hilfe von Exosomen-abgereicherten Medien auf die entsprechende Konzentration verdünnt wurden, fügen Sie die verdünnten EVs zu den adhärenten Zielzellen hinzu und inkubieren Sie für die gewünschte Versuchszeit. Nach der Entfernung von nicht internalisierten EVs durch dreimaliges Waschen der Zellen mit exosomenfreien Medien wird das Zytoplasma der adhärenten Zellen mit 1 μg/ml CMTMR markiert und unter optimalen Zellkulturbedingungen inkubiert.

Für die Bildgebung lebender Zellen legen Sie die vorbereiteten Zellen in den Inkubator auf der Bühne. Nachdem Sie die Bildgebungsparameter basierend auf Kontrollproben eingestellt haben, bestimmen Sie die Tiefe der Zielzellen und den Bereich der Stapelgröße in z-Richtung, um konfokale 3D-Bilder aufzunehmen. Stellen Sie dann die Bildaufnahme auf mehrere z-gestapelte Bilder von zellspezifischem Farbstoff und EV-spezifischem Farbstoff gleichzeitig ein.

Verwenden Sie für die Bildverarbeitung eine automatische Bildverarbeitungssoftware.

Um virtuelle Oberflächen der Zellen zu erstellen, klicken Sie auf "Neue Oberflächen hinzufügen". Um die virtuellen Zelloberflächen zu konfigurieren, klicken Sie auf die Schaltfläche "+ Hinzufügen" und wählen Sie "Qualität" als "Filtertyp" aus. Legen Sie durch Sichtprüfung den entsprechenden Schwellenwert für die untere Grenze fest, legen Sie den Höchstwert für die Obergrenze fest und klicken Sie auf die Schaltfläche "Fertigstellen".

Um als Nächstes die virtuellen Punkte der Elektrofahrzeuge zu erstellen, klicken Sie auf die Schaltfläche "Neue Spots hinzufügen". Wählen Sie unter "Algorithmus-Einstellungen" die Optionen "Unterschiedliche Spotgrößen" und "Berechnung der kürzesten Entfernung". Klicken Sie dann auf "Weiter" und wählen Sie "Kanal 1 - Alexa Fluor 488" als "Quellkanal" aus. Geben Sie unter "Spot-Erkennung" den entsprechenden Wert für den "Geschätzten XY-Durchmesser" ein und klicken Sie auf "Weiter".

Um die virtuellen EV-Punkte zu konfigurieren, klicken Sie auf die Schaltfläche "+ Hinzufügen" und wählen Sie "Qualität" als "Filtertyp" aus. Legen Sie den "unteren Schwellenwert" durch eine Sichtprüfung fest und klicken Sie auf "Weiter". Wählen Sie für den "Spot-Bereichstyp" die Option "Absolute Intensität" aus und klicken Sie dann auf "Weiter".

Um den Schwellenwert für den Bereich der EV-Punkte festzulegen, geben Sie den entsprechenden Wert für "Bereichsschwellenwert" durch Sichtprüfung ein. Wählen Sie unter "Bereichsvolumen" die Option "Durchmesser von" und klicken Sie auf "Fertigstellen".

Um die gruppierten Punkte innerhalb der gebauten Oberfläche zu teilen, klicken Sie auf die gebauten "Spots" und gehen Sie zu "Filter". Klicken Sie anschließend auf die Schaltfläche "Hinzufügen" und wählen Sie "Kürzeste Entfernung zu Oberflächenoberflächen = Oberfläche 1" als "Filtertyp" aus.

Nachdem Sie den niedrigsten Schwellenwert für die untere Grenze und den entsprechenden Wert für die Obergrenze festgelegt haben, klicken Sie auf die Schaltfläche "Abschnitt auf neue Spots duplizieren".

Um die EVs in den Zellen automatisch zu zählen, klicken Sie auf die erstellte Auswahl "Spots 1", gehen Sie zu "Statistiken" und exportieren Sie den Wert aus der "Gesamtzahl der Spots".

Um die Anzahl der Zellen zu erhalten, klicken Sie auf die erstellten "Flächen 1", gehen Sie dann zu "Statistik" und exportieren Sie den Wert von "Gesamtzahl der Flächen" aus "Gesamt". Gehen Sie abschließend auf die Registerkarte "Detailliert" unter "Statistiken", um das Volumen zu exportieren.