Kolorimetrischer Assay zur Quantifizierung von nicht-strukturellen Kohlenhydraten in pflanzlichen Geweben

Verdauliche Kohlenhydrate sind die nichtstrukturellen Bestandteile des Pflanzengewebes und fungieren als Reserveenergiequelle für das Pflanzenwachstum und den Stoffwechsel.

Um die nicht-strukturellen Kohlenhydrate zu quantifizieren, nehmen Sie eine abgemessene Menge Pflanzengewebe in einem Röhrchen. Geben Sie verdünnte Schwefelsäure in das Röhrchen und erhitzen Sie die Probe. Beim Erhitzen hydrolysiert Schwefelsäure die Polysaccharide der verdaulichen Kohlenhydrate in ihre jeweiligen Monosaccharid-Untereinheiten.

Kühlen Sie die Probe ab. Zentrifugieren Sie das Röhrchen, um das unverdaute Pflanzenmaterial zu pelletieren und einen Überstand zu erhalten, der die Monosaccharide enthält.

Aspirieren Sie den Überstand in ein frisches Röhrchen und behandeln Sie die Monosaccharide mit Phenollösung, gefolgt von der Zugabe von Schwefelsäure. Wirbeln Sie das Röhrchen vor, um den Inhalt zu mischen und zu inkubieren.

Während der Inkubation dehydriert Schwefelsäure die Monosaccharide, um Furfuralderivate herzustellen. Diese Furfuralderivate reagieren mit dem Phenol zu einer Gelbgoldlösung.

Spektroskopisch bestimmen Sie die Extinktion der Gelbgoldlösung bei 490 Nanometern, die dem Kohlenhydratgehalt in der Pflanzenprobe entspricht.

Nehmen Sie als Nächstes verschiedene Konzentrationen von Glukoselösungen und wiederholen Sie die Phenol-Schwefelsäure-Behandlung, um unterschiedliche Farbintensitäten zu erhalten, und zeichnen Sie eine Standardkurve. Vergleichen Sie den Absorptionswert der unbekannten Kohlenhydratprobe mit dem Glukosestandard, um den Gehalt an verdaulichen Kohlenhydraten im Pflanzengewebe zu erhalten.

Wiegen Sie zunächst die Replikate jeder Gewebeprobe in 15-Milliliter-Glasröhrchen ab. Beschriften Sie die Röhrchen und notieren Sie die genaue Masse jeder Probe.

Geben Sie anschließend 1 Milliliter 0,1 molare Schwefelsäure in jedes Röhrchen und verschließen Sie die Kappen fest. Legen Sie dann die Röhren 1 Stunde lang in ein kochendes Wasserbad.

Schieben Sie die Röhren zum Abkühlen in ein lauwarmes Wasserbad. Gießen Sie dann den Inhalt der Röhrchen in beschriftete 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Danach zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 15.000 g für 10 Minuten. Verwenden Sie eine Mikropipette, um den Überstand in neu markierte 1,5-Milliliter-Röhrchen zu übertragen.

Übertragen Sie mit einer Pipette 15 Mikroliter jeder unbekannten Probe in ein eigenes Reagenzglas. Geben Sie dann 385 Mikroliter destilliertes Wasser in jedes Röhrchen.

Geben Sie in einem Abzug 400 Mikroliter 5 % Phenol in jedes Standard- und unbekannte Probenreagenzglas. Geben Sie unmittelbar danach 2 Milliliter Schwefelsäure in jedes Röhrchen.

Achten Sie darauf, die Schwefelsäure an die Oberfläche der Lösung zu geben.

Nachdem Sie die Röhrchen 10 Minuten lang inkubiert haben, wirbeln Sie die Röhrchen ein. Inkubieren Sie das Röhrchen dann für weitere 30 Minuten.

Übertragen Sie 800 Mikroliter aus jedem Probenröhrchen auf drei 1,5-Milliliter-Halbmikroküvetten aus Polystyrol. Stellen Sie dann das Spektralphotometer auf 490 Nanometer ein und kalibrieren Sie es mit einer leeren Küvette.

Führen Sie abschließend jede Küvette durch das Spektralphotometer und zeichnen Sie die Extinktion auf.