Kombination von histochemische Färbung und Bildanalyse, Stärke in den Eierstock Primordia der Süßkirsche während der Winterruhe zu quantifizieren

Wir präsentieren eine Methodik zur Quantifizierung des Stärkegehalts in den Eierstock Primordia in Süßkirsche (Prunus Avium L.) während der Winterruhe, mithilfe einer Bild-Analyse-System mit histochemische Techniken kombiniert.

Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen über das Schlafen in holzigen Pflanzen zu beantworten, wie zum Beispiel, warum die Blütenknospen brauchen, um Kälte im Winter anzusammeln, um richtig zu blühen. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass sie die Quantifizierung der Stärke in sehr kleinen Proben von Blütenprimordium ermöglicht. Dieser Ansatz ist sehr nützlich, um die physiologische Aktivität der Blüte Primordium während des Ruhezustandes zu erkennen und kann auch auf andere Baumarten wie Aprikosen oder Pflaume angewendet werden.

Obwohl diese Methode Einblick in die ruhende Blütenknospe geben kann, kann sie auch auf andere Prozesse wie die Fortpflanzungsphase von der Bestäubung bis zum Beginn der Fruchtung angewendet werden. Zu Beginn, sammeln Sie fünf Schüsse aus dem Feld. Dann wiegen und fixieren 10 Blütenknospen in einem 10-Milliliter-Glasrohr mit fixativer Lösung für mindestens 24 Stunden bei vier Grad Celsius.

Danach entsorgen Sie das Fixativ und fügen Sie genügend 75% Ethanol hinzu, um die Proben abzudecken. Erhalten Sie drei Triebe, die 15 bis 30 Zentimeter lang und fünf Millimeter im Durchmesser mit jeweils 10 Blütenknospen sind. Dann legen Sie die Triebe auf wassergetränkten Blumenschaum in eine Wachstumskammer.

Nach 10 Tagen in der Wachstumskammer die Blütenknospen von den Trieben entfernen und wiegen. Bewerten Sie jede Woche vom Anfang des Herbstes bis zum Budburst im Frühjahr das Wachstum der Blütenknospen. Entfernen Sie die externen Knospenwaagen aus jeder Probe, und legen Sie dann jede Knospe in ein Uhrmacherglas, das 75 % Ethanol enthält.

Verwenden Sie Präzisionszangen und ein ophthalmologisches Skalpell, um die Knospen zu sezieren und mindestens ein Blütenprimordium aus jeder Knospe zu erhalten. Die Proben einzeln in Paraffinwachs einbetten, um einen Block zu bilden, und sie auf ein rotierendes Mikrotom zu sektionieren. Nach dem Schnitt der Proben einen Tropfen frisches Lugol-Jod über einen Abschnitt auftragen.

Nach fünf Minuten überschüssigen Fleck mit Blotting-Papier entfernen. Als nächstes einen kleinen Tropfen synthetischer Montagemedien auftragen, ein kleines Deckglas über die Probe legen und hart drücken. Sobald das Montagemedium trocken ist, beobachten Sie den gebeizten Abschnitt unter einem Hellfeldmikroskop.

Passen Sie zunächst die Blendenmembran und die Helligkeitssteuerung entsprechend dem Textprotokoll an. Stellen Sie dann sicher, dass sich keine Filter im Filterhalter befinden, und wählen Sie einen Hellfeldzustand im Mikroskop aus. Passen Sie danach die Kameraeinstellungen für das gebeizte Präparat ohne Gewebe an.

Fixieren Sie die Helligkeit bei 50%Weiter aktivieren Sie die Überbelichtungs-/Unterbelichtungsfunktion und passen Sie die Belichtungszeit an der Grenze der Überbelichtung an. Wenden Sie die Weißabgleichfunktion und die Schattierungskorrektur an. Messen Sie den Graugrad des resultierenden Schwarz-Weiß-Bildes des gebeizten Präparats ohne Gewebe.

Wenden Sie dann einen 4N-Filter an, erfassen Sie ein weiteres Schwarzweißbild der Zubereitung und messen Sie den Graugrad. Als nächstes erfassen Sie ein Bild der gleichen Zubereitung ohne Licht und messen Sie den Graugrad des resultierenden Bildes und kalibrieren Sie. Danach können Sie ein Farbbild eines Beispielabschnitts im TIFF-Format mit einer Auflösung von mindestens 300 dpi erwerben.

Erstellen Sie ein binäres Bild, das dem gebeizten Bereich entspricht, und legen Sie dann die drei Farbschwellen fest, bis das binäre Bild genau das gefärbte Stärkegranulat widerspiegelt. Wiederholen Sie diesen Vorgang mit anderen Präparaten und Geweben, um die endgültigen Detektionsstufen zu optimieren. Messen Sie mithilfe des Bildanalysesystems die Summe der optischen Dichte jedes Pixels unter der Maske, um den Stärkegehalt im Feld zu quantifizieren.

In diesem Protokoll wurden das Wachstum der Blütenknospen und der Ruhezustand bewertet, indem der Anstieg des Knospengewichts nach 10 Tagen unter geeigneten Bedingungen gemessen wurde. Während des Ruhezustandes wurden nach 10 Tagen unter geeigneten Bedingungen keine Veränderungen beobachtet. Sobald die Ruhe überwunden war, schwollen die Knospen an und platzten in der Wachstumskammer.

Der Stärkegehalt im Eierstockprimordium wurde mittels Bildanalyse in jedem mikrotomed Abschnitt quantifiziert. Konsequenterweise hatte die Stärkemenge im frühwinterlichen Winter einen optischen Dichtewert von weniger als 40.000 und die maximale Menge erreichte in beiden Studienjahren einen Wert zwischen 120.000 und 140 000. Unter Berücksichtigung der Ruhezeiten trat die maximale Stärkemenge gleichzeitig mit der kühlenden Erfüllung in beiden Jahren auf.

Es ist wichtig, sich daran zu erinnern, dass die vom Bildanalysator verwendeten Erkennungsstufen direkt von der Kalibrierung des Systems abhängen. Dazu gehören Lichtzustand, Fleckenintensität und Vergrößerung des Mikroskops. Dieser Zustand muss für alle Zubereitungen festgelegt werden.

Die Kombination histochemischer Techniken mit der Bildanalyse hat sehr nützlich zur Untersuchung der Kohlenhydratreserve des Blütenprimordiums während der verschiedenen Phasen des Ruhezustands geführt. Es kann auch auf andere Arten und Gewebe angewendet werden. Die Beziehung zwischen Derruhefreisetzung und Stärkeakkumulation in der Ovarial-Primordie, die durch den Einsatz dieser Methode enthüllt wird, bietet eine solide Grundlage, um die biologische Grundlage der Ruhe- und Schüttelanforderungen zu verstehen.

Zukünftige Anstrengungen müssen sich auf die Untersuchung zuverlässiger biologischer Indikatoren konzentrieren, die leicht auf den Ruhezustand des Baumes hinweisen könnten. In der Zwischenzeit kann das Muster der Stärkevariationen entlang des Ruhezustands verwendet werden, um weitere physiologische und genetische Studien zu rahmen.