Name: Kombination von histochemische Färbung und Bildanalyse, Stärke in den Eierstock Primordia der Süßkirsche während der Winterruhe zu quantifizieren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-20T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 25 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie Stärke in Süßkirschen-Eierstock-Primordien während der Winterruhe quantifizieren. Diese Methode kombiniert histochemische Färbung mit Bildanalyse, um physiologische Aktivität in sehr kleinen Proben zu erfassen.

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Die Autoren danken dankbar Maria Herrero und Eliseo Rivas für ihre hilfreiche Diskussion und Beratung. Diese Arbeit wurde unterstützt durch das Ministerio de Economía y Competitividad – europäischer Fonds für regionale Entwicklung, Europäische Union [Grant-Nummer BES-2010-037992, E. F.]; Das Instituto Nacional de Investigación y Tecnología Agraria y Alimentaria [Grant-Nummern RFP2015-00015-00, RTA2014-00085-00, RTA2017-00003-00]; und des Gobierno de Aragón – Europäische Sozialfonds, Europäische Union [Grupo Consolidado A12-17R].

(1) Dormanz Entschlossenheit und Pflanze Materialkollektion
<ol><li>Probieren Sie die Blütenknospen im Feld. Dormanz Studien sind Langzeitexperimente und benötigen Erwachsene groß genug Bäume Knospen zu sammeln und schießt den ganzen Winter ohne die Bäume Entwicklung im nächsten Frühjahr. Spezielle Obstgarten Management könnte je nach dem Trainingssystem erforderlich; so kann Beschneidung weniger schwerwiegend als für Produktionszwecke Obst sein.<ol>
<li>Jede Woche von Anfang Herbst bis zum Beginn des austreiben, sammeln Sie und wiegen Sie 10 Blütenknospen.</li>
		<li>Beheben Sie die Blütenknospen zu, indem man sie in ein 10 mL Glasrohr mit einer Kappe und genießen Sie die Proben in einer Fixativ Lösung von Ethanol/Essigsäure Säure (3:1) für mindestens 24 Stunden bei 4 ° c Dann verwerfen Sie das Fixiermittel und fügen Sie 75 % Ethanol, großzügig um sicherzustellen, dass die Proben deckt. Die Proben können bis zur Verwendung in dieser Lösung bei 4 ° C aufbewahrt werden. Hinweis: Vakuum eindringen lässt sich die Luftblasen im Inneren Keim entfernen und verhindern, dass sie schweben. Dies erleichtert das Eindringen von das Fixiermittel in den Geweben, aber beschädigen die Struktur des Gewebes. Versuchen Sie es ggf. nicht zu vermeiden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Probieren Sie die Triebe im Feld.<ol>
<li>Nehmen Sie jede Woche von Anfang Herbst bis zum Beginn des austreiben, drei Triebe von 15-30 cm lang und 5 mm im Durchmesser, mit mindestens 10 Blütenknospen. Legen Sie sie auf Wasser getränkten Florist Schaum in einer Kammer Wachstum bei 22 ± 1 ° C mit einer 12 h Licht Photoperiode.</li>
		<li>Wählen Sie nach 10 Tagen in der Wachstums-Kammer und wiegen Sie 10 Blütenknospen aus der Triebe.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bewerten der Knospe-Wachstum und den Dormanz-Status zu bestimmen. Die Abfrageperiode muss an die Gegebenheiten des Standortes angepasst werden. In den Obstgarten-Bedingungen (Zaragoza, Spanien, 41 ° 44'30 "N, 0 ° 47'00" W und 220 m über dem Meeresspiegel), die Probenahme der Triebe wurde vom 30. November bis Ende Februar oder Anfang März durchgeführt.<ol>
<li>Wöchentlich bewerten Sie die Reaktion der die Blütenknospen, die geeignete Wachstumsbedingungen der Kammer, von Anfang Herbst bis zum Austrieb im Frühjahr, durch den Vergleich des Gewichts der 10 Knospen aus dem Feld gepflückt.</li>
		<li>Wenn es keine Unterschiede gibt, diese Unterschiede weniger als 30 sind % der Ansicht, dass die Knospen ihre abschreckenden Anforderungen nicht erfüllt und sind Endodormant22. Wenn die Unterschiede mehr als 30 sind % der Ansicht, dass die Knospen ihre abschreckenden Anforderungen erfüllt haben und sind Ecodormant22.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. technische Anlagen Vorbereitung des Materials für die Quantifizierung der Stärke
<ol><li>Wählen Sie etwa sechs feste Knospen aus jeder Probenahme Datum (siehe Punkt 1.1). Je nach Sorten enthält jedes Süßkirsche Blütenknospe bis zu fünf Blume Primordia.<ol>
<li>Entfernen Sie die äußere Knospenschuppen und legen Sie die Knospe auf einem Uhrmacher Glas mit 75 % Ethanol zu verhindern Austrocknung.</li>
		<li>Keim zu sezieren und mindestens eine Blume Primordium pro Bud mit Hilfe von Präzisions-Pinzetten und eine ophthalmologische Skalpell unter eine stereoskopische Mikroskop zu extrahieren. Die Blume Primordium kann in einer 10 mL Glasröhre mit 75 % Ethanol bei 4 ° C aufbewahrt werden oder sofort mit dem nächsten Schritt fortfahren.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Die Proben in einer tertiären Butyl Alkohol-Serie zu entwässern.<ol>
<li>Ersetzen Sie die 75 % ige Ethanol-Lösung mit 10 mL 75 % tertiären Butyl-Alkohol (TBA) großzügig bedecken die Proben und inkubieren sie 1,5 h. Eine Pasteurpipette kann um die Lösung zu verwerfen.</li>
		<li>Wiederholen Sie Schritt 2.2.1, Hinzufügen von TBA mit steigenden Konzentrationen (85 %, 95 % und 100 % V/V; und 3 X mit reinen TBA) in einem trocknen Ofen bei 30 ° C mit Entlüftung, da reine TBA bei Raumtemperatur (< 20 ° C kristallisiert) und sehr flüchtig und giftig ist. Wenn TBA mit der Probe sprechen, würde es das Gewebe schädigen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Die Proben in Paraffin18einbetten.<ol>
<li>Schmelzen Sie das Paraffin durch die Einführung der Paraffin-Perlen im trocknen Ofen bei 60 ° C mit Luftabsaugung am Vortag. Paraffin-Perlen können auch auf eine Heizplatte geschmolzen werden, aber dafür sorgen, dass das flüssige Paraffin bei 60 ° C und nicht bei einer höheren Temperatur, um Gewebeschäden zu vermeiden ist.</li>
		<li>Ersetzen Sie die TBA mit einer Mischung aus TBA und Paraffin-Öl (1:1) und inkubieren Sie für 24 h in einem trocknen Ofen bei 60 ° C. Ersetzen Sie dann die Mischung aus TBA und Paraffinöl mit reinem Paraffin schmilzt und inkubieren Sie für mindestens 6 h in einem trocknen Ofen bei 60 ° C. Wiederholen Sie es 2 X und inkubieren Sie die letzte Änderung für mindestens 4-6 d.</li>
		<li>Legen Sie jede Probe auf eine kleine Basis Metallform über eine Wärme-Oberfläche, eingebettet in Paraffinwachs und Tempo der einbettenden Kassette. Legen Sie es über eine kalte Oberfläche und entfernen Sie den Block zu, sobald das Wachs erstarrt ist.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Abschnitt und die Vorbereitungen rehydrieren.<ol>
<li>Bereiten Sie Haupts-Klebstoff: lösen Sie 1 g schlicht Knox Gelatine in 100 mL destilliertem Wasser bei 30 ° C; Fügen Sie 2 g Phenol lose Kristalle (C6H5OH) und 15 mL Glycerin. Einen Objektträger mit einer Bürste bestreichen Sie die Haupt-Kleber und Tropfen Sie einen einer 1 % igen Formaldehyd-Lösung.</li>
		<li>Abschnitt jedes Paraffin bei 10 µm in eine rotatorische Mikrotom blockieren und legen Sie in den Abschnitten auf dem Objektträger mit Haupt Klebstoff bedeckt.</li>
		<li>Legen Sie die Glas-Objektträger mit den Abschnitten über eine Wärme-Oberfläche bei 35-40 ° C bis trocken; fahren Sie die Glas-Folien zu einem Dia-Rack.</li>
		<li>Bereiten Sie die Dewax und Rehydratation Lösungen. Legen Sie 200 mL Histoclear II in drei Glas-Färbung Gerichte, einen mit Histoclear II:ethanol (1:1, V/V), eine Ethanol-Serie (100 %, 70 %, 40 % V/V), und eine endgültige waschen mit destilliertem Wasser.</li>
		<li>Wachsentfernung die Abschnitte mit drei Wäschen, jede 5 min, in Histoclear II und Histoclear II:ethanol (1:1, V/V). Platzieren Sie Folie-Rack in die Glas-Färbung Gerichte, um sicherzustellen, dass die Lösung vollständig die Folien bedeckt und verschieben Sie dann die Folie Rack aus einer Lösung zur nächsten.</li>
		<li>Rehydrieren die Abschnitte durch die folgende Reihe von 2 min Wäschen: eine Ethanol-Serie (100 %, 70 %, 40 % V/V) und eine endgültige waschen mit destilliertem Wasser. Schließlich trocknen Sie die Objektträger bei Raumtemperatur.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Färben Sie die Abschnitte18.<ol>
<li>Bereite ich2KI Fleck: lösen Sie 2 g Kaliumjodid (KI) und 0,2 g Jod (ich2) in 100 mL destilliertem Wasser. Geben Sie einen Tropfen frisch ich2KI über die Abschnitte für 5 min und verwerfen Sie die überschüssige Beize mit einem Löschpapier absorbieren. Schnell fahren Sie mit dem nächsten Schritt fort.</li>
		<li>Tropfen Sie einen kleinen eine synthetische Montage-Medien, legen Sie einen kleinen Deckglas darauf und drücken Sie fest. Sobald die Montage Medien trocknet, unter dem Hellfeld Mikroskop für eine vorläufige Einschätzung der Eierstock Stärke beobachten. Hinweis: Dieser Schritt ist nicht zwingend erforderlich, obwohl ein besserer Kontrast zwischen der Stärke und dem Hintergrund gewonnen wird. Wenn der Abschnitt hat mit anderen Flecken nach Stärke Quantifizierung wiederverwendet werden, platzieren Sie das Deckglas über die Tropfen Fleck und verwerfen den Überschuss mit einem Löschpapier absorbieren (siehe 2.5.1). Dann, nach Stärke Quantifizierung, waschen, das ich2KI Fleck mit destilliertem Wasser und Stelle die Vorbereitungen Hitze bei 35-40 ° C trocknen Oberfläche.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Quantifizierung des Stärkegehalts
<ol><li>Kalibrieren Sie die optischen Bedingungen. Hinweis: Die Erfassungsebenen von Image Analyzer verwendet, um die gefärbten Stärke zu erkennen sind direkt abhängig von Lichtverhältnissen und Vergrößerung des Mikroskops; so befestigen Sie diese Bedingungen für alle Präparate ausgewertet. Anzupassen Sie die Einstellung hier vorgeschlagen, um die verfügbaren Mikroskop und Lichtverhältnissen.<ol>
<li>Passen Sie die Aperturblende um die 20 X Vergrößerung und der Helligkeit oder Intensität des Lichts.</li>
		<li>Stellen Sie sicher, dass es keine Filter auf den Filterhalter, und wählen Sie eine Hellfeld Bedingung im Mikroskop. Wählen Sie eine geeignete Vergrößerung (z.B.40 X für Süßkirsche Eierstock Primordium).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Steuern Sie die Bild Erwerb. Passen Sie die Kameraeinstellungen mit einem gefärbten Präparat ohne Gewebe über Bild | Erwerb | Pre-View.<ol>
<li>Beheben Sie die Helligkeit auf 50 %, der Gewinn bei 1,0 x und die Histogramm-Indikatoren der Gamma value-at-1,00 und der Kontrast bei 0 - 100, mit den Grenzen der Helligkeit Verteilung Histogramm Schlange.</li>
		<li>Aktivieren Sie die Funktion der Überbelichtung/Unterbelichtung und passen Sie die Belichtungszeit an der Grenze zur Überbelichtung.</li>
		<li>Gelten Sie die Weißabgleich-Funktion für das gesamte Bild alle Null-farbigen Komponenten des Bildes ohne jeden Farbton und Schattierung Korrektur, das komplette Bild erstelle ich eine korrigierte und homogenere Bild anzuzeigen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Kalibrieren Sie die Bild-Analyse-System die Kontrollwerte der grauen Ebene (0, schwarz, 255, weiße) unterschiedlicher optischer Dichte (OD) zu erhalten, die durch die Transmission (T) Werte erhalten werden.<ol>
<li>Erwerben Sie ein Bild einer gefärbten Zubereitung ohne Gewebe, als Kontrolle weiß, und Messen Sie die graue Ebene der schwarz / weiß Bild über Maßnahme | Graue Maßnahme | Kalibrieren, grau | Sollwert = 0 | Maßnahme | Kalibrieren | OK. Dies entspricht einem 100 % Transmission; so eine optische Dichte von 0, nach OD = 2 - Anmeldung T.</li>
		<li>Erwerben Sie ein Bild der gleichen Vorbereitung mit einem 4N-Filter, das reduziert die Menge an Licht 4 X und messen die graue Ebene der schwarz / weiß Bild über Maßnahme | Graue Maßnahme | Kalibrieren, grau | Sollwert = 0,6 | Maßnahme | Kalibrieren | OK. Dies entspricht einer 25 % Durchlässigkeit; so eine Extinktion von 0,6 nach OD = 2 - Anmeldung T.</li>
		<li>Ein Bild der gleichen Zubereitung ohne Licht, als schwarz zu erwerben, und Messen Sie die graue Ebene der schwarz / weiß Bild über Maßnahme | Graue Maßnahme | Kalibrieren, grau | Sollwert = 1 | Maßnahme | Kalibrieren | OK. Dies entspricht einer 0 % Transmission; so eine optische Dichte von 1 nach OD = 2 - Anmeldung T.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Stärke zu erkennen.<ol>
<li>Erwerben Sie ein Farbbild des Feldes im TIFF-Format mit einer Auflösung von mindestens 300 Punkte pro Zoll (dpi) gemessen.</li>
		<li>Erstellen Sie ein binäres Bild entspricht der Gegend gebeizt. Die drei Farben Schwellenwerte festgelegt (Werte zwischen 0 - 255 für jeden) bis binäre Bild genau gefärbten Stärkekörner beobachtet spiegelt, über Bild | Erkennen | Wählen Sie die Schwellen von rot, blau und grün | OK. Immer wieder visuelle Vergleiche in verschiedenen Zubereitungen und Geweben zu tune up die endgültige Erfassungsebenen. Speichern Sie und verwenden Sie diese Werte für alle Vorbereitungen.</li>
		<li>Quantifizierung der Stärke. Umwandeln Sie das ursprüngliche Farbbild in ein Schwarzweißbild mit dem Bild-Analyse-System. Verwenden Sie das binäre Bild als überlagerten Maske auf der schwarz / weiß Bild über Bild | Binäre bearbeiten. Die Summe der optischen Dichte der jedes Pixel unter der Maske über Maßnahme messen | Graue Ebene | OK und dieser Wert als der Stärkegehalt im gemessenen Bereich betrachten.</li>
		<li>Wiederholen Sie die Schritte 3.4.1 - 3.4.3 in vier Orten der Eierstock Primordia einen repräsentativen Wert des Stärkegehalts in den Eierstöcken der Blume Primordia zu erhalten.</li>
		<li>Wiederholen Sie die Schritte 3.4.1 - 3.4.3 und Schritt 3.4.5 in verschiedenen Blumen jeder sammeln Datum.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Dormanz in holzigen Stauden stellt deutliche Auswirkungen im Obstbau und Forstwirtschaft im Klimawandel, obwohl der biologische Prozess hinter Dormanz unklar bleibt. Dormanz Studien aus verschiedenen Blickwinkeln angegangen werden können, aber die Forschung auf der Suche nach einer biologischen Marker für die Winterruhe hat in den letzten Jahren intensiviert. Allerdings wurden die meisten Versuche, eine eindeutige Kennzeichen, wenn eine Knospe Dormanz gebrochen hat zu finden erfolglos3. Die hierin...

Gemäßigte waldige Stauden passen sich den Jahreszeiten durch die Modulation, ihr Wachstum und ihre Entwicklung. Während sie im Frühling und Sommer zu entwickeln, aufhören sie zu wachsen im Herbst, im Winter1schlafend gehen. Obwohl Dormanz bei niedrigen Temperaturen im Winter überleben kann, ist chillen Voraussetzung für eine ordnungsgemäße Knospenaustrieb im Frühjahr2. Die wichtigen Implikationen der Vegetationsruhe in gemäßigten Obstproduktion und Forstwirtschaft führten zu vielfältigen Bemühungen zu bestimmen und Vorhersage der Dormanz Periode3. In Obst-Baum-Spezies, empirischer Experimente Übertragung Triebe zu zwingen, Bedingungen und statistische Vorhersagen basierend auf Daten der Blüte sind aktuelle Ansätze feststellen, das Datum für das Brechen der Keimruhe, wodurch Forscher schätzen die Chillen Anforderungen für jede Sorte. So erkennen Sie die Dormanz Status basierend auf biologische Prozesse bleibt jedoch unklar3.
Blüte im gemäßigten Obstbäume wie Süßkirsche (Prunus Avium L.), tritt einmal im Jahr und dauert etwa zwei Wochen. Allerdings beginnen Blumen zu differenzieren und rund 10 Monate früher, während der vergangenen Sommer4zu entwickeln. Blume Primordia aufhören zu wachsen im Herbst ruhend innerhalb der Knospen im Winter zu bleiben. In dieser Zeit muss jeder Sorte eine besondere kühle Voraussetzung für richtige Blüte4ansammeln. Trotz des Fehlens der phänologischen Veränderungen in den Knospen im Winter Blume Primordia sind physiologisch aktiv während der Vegetationsruhe und die Anhäufung von kühlen Temperaturen wurde vor kurzem assoziiert mit der Dynamik der Stärke Anhäufung oder verringern innerhalb der Zellen von der Eierstock Primordium bietet einen neuen Ansatz für Dormanz Bestimmung5. Die geringe Größe und die Position des Eierstocks Primordium erfordern jedoch eine spezielle Methodik.
Stärke ist das große Speicher-Kohlenhydrat im Gehölz Arten6. So haben Veränderungen in Stärke auf die physiologische Aktivität der Blume Gewebe, die brauchen Kohlenhydrate zur Unterstützung ihrer Entwicklung7,8in Verbindung gebracht. Andere wichtige Ereignisse während der reproduktiven Prozesses beziehen sich auch auf Variationen in Stärkegehalt in verschiedenen floralen Strukturen, z. B. Anthere Meiose9, das Wachstum der Pollenschläuche durch den Stil oder Ovulum Befruchtung10. Histochemische Techniken ermöglichen die Erkennung von Stärke in jedem bestimmten Gewebe Blume Primordia während der Vegetationsruhe. Allerdings bleibt die Schwierigkeit bei der Quantifizierung dieser Stärke, im Anschluss an ihre Muster der Akkumulation/Abnahme über die Zeit oder die Stärke zu vergleichen zwischen Gewebe, Sorten oder Jahre Inhalte zulassen. Dies ist aufgrund der kleinen Menge an Gewebe für die analytische Techniken11zur Verfügung. Als Alternative ermöglicht Bildanalyse, Mikroskopie12 verbunden die Quantifizierung der Stärke in sehr kleine Proben von pflanzlichen Gewebe13.
Ansätze, die Kombination von Mikroskopie und Bildanalyse wurden zur quantifizieren des Inhalts der verschiedenen Komponenten in pflanzlichen Geweben, wie Kallose14, Mikroröhrchen15, oder16, durch Messung der Größe des Bereichs gefärbt durch spezifische Stärke Flecken. Für Stärke, kann leicht erkannt werden mit Kaliumiodid-Jod (ich2KI) Reaktion17. Diese Methode ist sehr spezifisch; Ich2KI Plasmamembrane innerhalb der laminaren Struktur der Stärke Körner und bildet eine dunkle blaue oder rötlich-braune Farbe, abhängig von der Amylosegehalt Stärke18. Abschnitte mit ich befleckt2KI Fleck zeigen ausreichenden Kontrast zwischen Stärke und dem Hintergrund Gewebe, so dass eine eindeutige Stärke-Erkennung und der anschließenden Quantifizierung durch die Bild-Analyse-System19. Obwohl dieser Farbstoff nicht stöchiometrischen ist, ist die Anhäufung von Jod proportional zur Länge des Stärke-Moleküls, die17stark variieren kann. So kann die Größe des verschmutzten Bereich ausgedrückt als die Anzahl der Pixel nicht genau den Inhalt der Stärke, da hohe Unterschiede im Stärkegehalt zwischen Feldern mit gefärbten Bereiche ähnlicher Größe gefunden werden konnte. Als Alternative kann der Stärkegehalt ausgewertet werden durch die Messung der optischen Dichte der gefärbten Körnchen auf schwarz / weiß Bilder von dem Mikroskop ausgewiesen in verschiedenen Geweben in Apricot8,13 , 19, Avocado10,20und Olive21.
Hier beschreiben wir eine Methodik, die die experimentelle Bestimmung der Dormanz Status mit der Quantifizierung der Stärkegehalt in Primordium Eierstockgewebe vom Herbst kombiniert bis zum Frühling in süßen Kirschen, bietet ein neues Tool für das Verständnis und die Vorhersage der Vegetationsruhe basierend auf der Studie der biologischen Mechanismen im Zusammenhang mit Keimruhe.

<table><tbody><tr><td>Präzisionswaage</td><td>Sartorius</td><td>CP225D</td><td></td></tr><tr><td>Stereoskopisches Mikroskop</td><td>Leica Microsystems</td><td>MZ-16</td><td></td></tr><tr><td>Trockenofen</td><td>Memmert</td><td>U15</td><td></td></tr><tr><td>Paraffin-Einbettstation</td><td>Leica Microsystems</td><td>EG1140H</td><td></td></tr><tr><td>Rotatorisches Mikrotom</td><td>Reichert-Jung</td><td>1130/Biocut</td><td></td></tr><tr><td>Mikrotom-Klinge</td><td>Feather</td><td>S35</td><td></td></tr><tr><td>Edelstahl Hellfeldmikroskop</td><td>Leica Microsystems</td><td>DM2500</td><td></td></tr><tr><td>Digitalkamera</td><td>Leica Microsystems</td><td>DC-300</td><td></td></tr><tr><td>Bildanalysesystem</td><td>Leica Microsystems</td><td>Quantiment Q550</td><td></td></tr></tbody></table>

kombination von histochemische färbung und bildanalyse, stärke in den eierstock primordia der süßkirsche während der winterruhe zu quantifizieren

Combining Histochemical Staining and Image Analysis to Quantify Starch in the Ovary Primordia of Sweet Cherry during Winter Dormancy

Veränderungen in Stärke in kleinen Strukturen sind verbunden mit wichtigen Ereignissen während mehreren Pflanze Entwicklungsprozesse, einschließlich der reproduktiven Phase von der Bestäubung zur Befruchtung und das Einsetzen der Fruchtkörper. Jedoch sind Abweichungen in der Stärke während der Blüte Differenzierung nicht vollständig, vor allem auf die Schwierigkeiten bei der Quantifizierung des Stärkegehalts in den besonders kleinen Strukturen der Blume Primordia bekannt. Hier beschreiben wir eine Methode zur Quantifizierung der Stärke in den Eierstock Primordia der Süßkirsche (Prunus Avium L.) mithilfe einer Bildanalysesystem angeschlossen an das Mikroskop, wodurch im Zusammenhang mit den Veränderungen im Stärkegehalt mit den verschiedenen Phasen der Vegetationsruhe vom Herbst bis zum Frühling. Zu diesem Zweck wird die Dormanz Blütenknospen Statusermittlung durch die Auswertung der Knospe Wachstum der Triebe, die zu verschiedenen Zeitpunkten in der Winterzeit in kontrollierten Bedingungen übertragen. Für die Quantifizierung der Stärke in den Eierstock Primordia Blütenknospen sind sequentiell gesammelt, fixiert, eingebettet in Paraffinwachs, geschnitten und gefärbt mit I2Kl (Kaliumjodid-Jod). Die Vorbereitungen sind unter dem Mikroskop beobachtet und analysiert, indem ein Bild-Analysator, der Stärke deutlich vom Hintergrund unterscheidet. Inhaltswerte Stärke erhält man durch Messung der optischen Dichte des Bildes, die die gefärbten Stärke entspricht, unter Berücksichtigung der sich aus der optischen Dichte der einzelnen Pixel als eine Schätzung des Stärkegehalts des Rahmens studierte.

Dormanz Studien erfordern die Festlegung des Zeitpunkts, wann die abschreckenden Voraussetzungen erfüllt sind. Trotz des Fehlens der phänologischen Veränderungen während des Winters unter Feldbedingungen (Abbildung 1A) wiederherstellen Kirschbäume nicht die Kapazität des Wachstums unter geeigneten Bedingungen, bis sie einen bestimmten Zeitraum unter niedrigen Temperaturen passieren. Die regelmäßige Übertragung der Triebe zu einer kontrollierten Bedingungen Ka...

Wir präsentieren eine Methodik zur Quantifizierung des Stärkegehalts in den Eierstock Primordia in Süßkirsche (Prunus Avium L.) während der Winterruhe, mithilfe einer Bild-Analyse-System mit histochemische Techniken kombiniert.

Kombination von histochemische Färbung und Bildanalyse, Stärke in den Eierstock Primordia der Süßkirsche während der Winterruhe zu quantifizieren

Changes in starch in small structures are associated with key events during several plant developmental processes, including the reproductive phase from ...

Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen über das Schlafen in holzigen Pflanzen zu beantworten, wie zum Beispiel, warum die Blütenknospen brauchen, um Kälte im Winter anzusammeln, um richtig zu blühen. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass sie die Quantifizierung der Stärke in sehr kleinen Proben von Blütenprimordium ermöglicht. Dieser Ansatz ist sehr nützlich, um die physiologische Aktivität der Blüte Primordium während des Ruhezustandes zu erkennen und kann auch auf andere Baumarten wie Aprikosen oder Pflaume angewendet werden.Obwohl diese Methode Einblick in die ruhende Blütenknospe geben kann, kann sie auch auf andere Prozesse wie die Fortpflanzungsphase von der Bestäubung bis zum Beginn der Fruchtung angewendet werden. Zu Beginn, sammeln Sie fünf Schüsse aus dem Feld. Dann wiegen und fixieren 10 Blütenknospen in einem 10-Milliliter-Glasrohr mit fixativer Lösung für mindestens 24 Stunden bei vier Grad Celsius.Danach entsorgen Sie das Fixativ und fügen Sie genügend 75% Ethanol hinzu, um die Proben abzudecken. Erhalten Sie drei Triebe, die 15 bis 30 Zentimeter lang und fünf Millimeter im Durchmesser mit jeweils 10 Blütenknospen sind. Dann legen Sie die Triebe auf wassergetränkten Blumenschaum in eine Wachstumskammer.Nach 10 Tagen in der Wachstumskammer die Blütenknospen von den Trieben entfernen und wiegen. Bewerten Sie jede Woche vom Anfang des Herbstes bis zum Budburst im Frühjahr das Wachstum der Blütenknospen. Entfernen Sie die externen Knospenwaagen aus jeder Probe, und legen Sie dann jede Knospe in ein Uhrmacherglas, das 75 % Ethanol enthält.Verwenden Sie Präzisionszangen und ein ophthalmologisches Skalpell, um die Knospen zu sezieren und mindestens ein Blütenprimordium aus jeder Knospe zu erhalten. Die Proben einzeln in Paraffinwachs einbetten, um einen Block zu bilden, und sie auf ein rotierendes Mikrotom zu sektionieren. Nach dem Schnitt der Proben einen Tropfen frisches Lugol-Jod über einen Abschnitt auftragen.Nach fünf Minuten überschüssigen Fleck mit Blotting-Papier entfernen. Als nächstes einen kleinen Tropfen synthetischer Montagemedien auftragen, ein kleines Deckglas über die Probe legen und hart drücken. Sobald das Montagemedium trocken ist, beobachten Sie den gebeizten Abschnitt unter einem Hellfeldmikroskop.Passen Sie zunächst die Blendenmembran und die Helligkeitssteuerung entsprechend dem Textprotokoll an. Stellen Sie dann sicher, dass sich keine Filter im Filterhalter befinden, und wählen Sie einen Hellfeldzustand im Mikroskop aus. Passen Sie danach die Kameraeinstellungen für das gebeizte Präparat ohne Gewebe an.Fixieren Sie die Helligkeit bei 50%Weiter aktivieren Sie die Überbelichtungs-/Unterbelichtungsfunktion und passen Sie die Belichtungszeit an der Grenze der Überbelichtung an. Wenden Sie die Weißabgleichfunktion und die Schattierungskorrektur an. Messen Sie den Graugrad des resultierenden Schwarz-Weiß-Bildes des gebeizten Präparats ohne Gewebe.Wenden Sie dann einen 4N-Filter an, erfassen Sie ein weiteres Schwarzweißbild der Zubereitung und messen Sie den Graugrad. Als nächstes erfassen Sie ein Bild der gleichen Zubereitung ohne Licht und messen Sie den Graugrad des resultierenden Bildes und kalibrieren Sie. Danach können Sie ein Farbbild eines Beispielabschnitts im TIFF-Format mit einer Auflösung von mindestens 300 dpi erwerben.Erstellen Sie ein binäres Bild, das dem gebeizten Bereich entspricht, und legen Sie dann die drei Farbschwellen fest, bis das binäre Bild genau das gefärbte Stärkegranulat widerspiegelt. Wiederholen Sie diesen Vorgang mit anderen Präparaten und Geweben, um die endgültigen Detektionsstufen zu optimieren. Messen Sie mithilfe des Bildanalysesystems die Summe der optischen Dichte jedes Pixels unter der Maske, um den Stärkegehalt im Feld zu quantifizieren.In diesem Protokoll wurden das Wachstum der Blütenknospen und der Ruhezustand bewertet, indem der Anstieg des Knospengewichts nach 10 Tagen unter geeigneten Bedingungen gemessen wurde. Während des Ruhezustandes wurden nach 10 Tagen unter geeigneten Bedingungen keine Veränderungen beobachtet. Sobald die Ruhe überwunden war, schwollen die Knospen an und platzten in der Wachstumskammer.Der Stärkegehalt im Eierstockprimordium wurde mittels Bildanalyse in jedem mikrotomed Abschnitt quantifiziert. Konsequenterweise hatte die Stärkemenge im frühwinterlichen Winter einen optischen Dichtewert von weniger als 40.000 und die maximale Menge erreichte in beiden Studienjahren einen Wert zwischen 120.000 und 140 000. Unter Berücksichtigung der Ruhezeiten trat die maximale Stärkemenge gleichzeitig mit der kühlenden Erfüllung in beiden Jahren auf.Es ist wichtig, sich daran zu erinnern, dass die vom Bildanalysator verwendeten Erkennungsstufen direkt von der Kalibrierung des Systems abhängen. Dazu gehören Lichtzustand, Fleckenintensität und Vergrößerung des Mikroskops. Dieser Zustand muss für alle Zubereitungen festgelegt werden.Die Kombination histochemischer Techniken mit der Bildanalyse hat sehr nützlich zur Untersuchung der Kohlenhydratreserve des Blütenprimordiums während der verschiedenen Phasen des Ruhezustands geführt. Es kann auch auf andere Arten und Gewebe angewendet werden. Die Beziehung zwischen Derruhefreisetzung und Stärkeakkumulation in der Ovarial-Primordie, die durch den Einsatz dieser Methode enthüllt wird, bietet eine solide Grundlage, um die biologische Grundlage der Ruhe- und Schüttelanforderungen zu verstehen.Zukünftige Anstrengungen müssen sich auf die Untersuchung zuverlässiger biologischer Indikatoren konzentrieren, die leicht auf den Ruhezustand des Baumes hinweisen könnten. In der Zwischenzeit kann das Muster der Stärkevariationen entlang des Ruhezustands verwendet werden, um weitere physiologische und genetische Studien zu rahmen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

Die Zusammensetzung der pflanzlichen Zellwand variiert je nach Gewebetyp und kann Lignin, Zellulose, Hemicellulosen und Pektin umfassen. Es wurden verschiedene Färbetechniken entwickelt, um Unterschiede auf Zelltypebene sichtbar zu machen. Dieser Artikel ist eine Zusammenstellung häufig verwendeter Techniken zur Zellwandfärbung.

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In diesem Protokoll wir beschreiben Techniken für die richtige Zerlegung von Arabidopsis Blumen und Siliques, einige grundlegende Clearing-Techniken und Färbung Verfahren für ganz-Mount Beobachtungen der reproduktiven Strukturen ausgewählt.

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Hier präsentieren wir ein optimiertes Protokoll für die Abbildung ganzer Eierstöcke für quantitative und qualitative Analysen mittels Whole-Mount-Immunfärbung, Multiphotonenmikroskopie sowie 3D-Visualisierung und -Analyse. Dieses Protokoll ermöglicht eine zuverlässige, wiederholbare Verarbeitung mit hohem Durchsatz, die für die Toxikologie, die klinische Diagnostik und genomische Assays der Eierstockfunktion geeignet ist.

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Dieses Protokoll zielt darauf ab, detaillierte Verfahren zum Sammeln, Fixieren und Pflegen mykoheterotropher Pflanzenproben bereitzustellen, wobei verschiedene Mikroskopietechniken wie Raster- und Transmissionselektronenmikroskopie, Licht-, Konfokal- und Fluoreszenzmikroskopie angewendet werden, um die Pilzbesiedlung in Pflanzengeweben und Samen zu untersuchen, die mit Mykorrhizapilzen gekeimt sind.

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Erfahren Sie, wie Sie Stärke in Süßkirschen-Eierstock-Primordien während der Winterruhe quantifizieren. Diese Methode kombiniert histochemische Färbung mit Bildanalyse, um physiologische Aktivität in sehr kleinen Proben zu erfassen.

Kombination von histochemische Färbung und Bildanalyse, Stärke in den Eierstock Primordia der Süßkirsche während der Winterruhe zu quantifizieren (Video) | JoVE Journal

Kombination von histochemische Färbung und Bildanalyse, Stärke in den Eierstock Primordia der Süßkirsche während der Winterruhe zu quantifizieren

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