Wildtyp-blockierende PCR zum Nachweis niederfrequenter somatischer Mutationen

Die Wildtyp-blockierende Polymerase-Kettenreaktion (WTB-PCR) weist Punktmutationen nach, indem sie mutierte Allele mit geringer Abundanz selektiv amplifiziert und gleichzeitig die Amplifikation von Wildtyp-Allelen mit hoher Abundanz in DNA-Proben hemmt.

Bei der WTB-PCR werden gesperrte Nukleinsäuren oder LNA-haltige, einzelsträngige, modifizierte Oligonukleotide verwendet, die komplementär zum Wildtyp-DNA-Strang der Probe komplementär sind und spezifisch an den komplementären Strang binden. Die LNA-Bindung blockiert die Aktivität der DNA-Polymerase und hemmt die Verlängerung der Wildtyp-Template-DNA.

Um die WTB-PCR durchzuführen, nehmen Sie einen Mastermix mit dNTPs, LNAs und zielspezifischen Vorwärts- und Rückwärtsprimern in nukleasefreiem destilliertem Wasser.

Geben Sie eine thermostabile DNA-Polymerase-haltige Lösung in das Röhrchen und pipettieren Sie die Mischung in die Vertiefung einer PCR-Platte. Geben Sie die genomische DNA-Probe, die Wildtyp- und mutierte DNA enthält, in die Vertiefung und beginnen Sie mit der PCR.

Während der PCR trennt eine durch Hochtemperatur vermittelte Denaturierung die doppelsträngigen DNAs. Die getrennten Stränge dienen als Matrizen für die Primer zum Anneal, während der LNA an seinen komplementären Wildtyp-DNA-Strang bindet und den Blocker-Wildtyp-DNA-Hybrid bildet. Bei einer höheren Temperatur fügt die DNA-Polymerase dNTPs hinzu und verlängert die Primer-DNA-Templates.

Eine höhere Schmelztemperatur des LNA-DNA-Hybriden als der DNA-DNA-Komplex hält ihn intakt. Die Modifikation von LNA blockiert schließlich die DNA-Polymerase daran, den LNA-DNA-Hybriden zu verlängern, was seine Verlängerung hemmt.

Über mehrere PCR-Zyklen hinweg erhöht die LNA-vermittelte Blockierung die Anzahl der mutierten Amplikons im Vergleich zu ihrer Wildtyp-Variante in der Probe, was deren selektive Detektion unterstützt.

Die Vorwärts- und Rückwärtsprimer wurden mit einer 5'-M13-Sequenz ausgelegt, um das Annealing von komplementären Sequenzierungsprimern zu ermöglichen. Das blockierende Oligonukleotid ist so konzipiert, dass es etwa 10 bis 15 Basen lang ist und komplementär zum Wildtyp-Template ist, wo eine Mutantenanreicherung gewünscht ist.

Ein kürzeres Oligo wird die Diskriminierung von Diskrepanzen verbessern. Um eine hohe Zielspezifität zu erreichen, ist es wichtig, nicht zu viel von den blockierenden Nukleotiden zu verwenden, da dies zu einem sehr "klebrigen" Oligonukleotid führt.

Um das blockierende Oligonukleotid zu entwerfen, navigieren Sie zunächst zur Website von Oligo Tools. Wählen Sie das Werkzeug "Oligo T_M Prediction". Es öffnet sich ein neues Fenster. Fügen Sie die Sequenz des zu blockierenden Wildtyp-Templates in das Feld "Oligo-Sequenz" ein. Fügen Sie ein Pluszeichen vor den Blocker-Bases hinzu, um sie zu markieren. Klicken Sie auf die Schaltfläche "Berechnen", um den ungefähren T_M des DNA-Blocker-Hybriden zu bestimmen. Die berechneten Schmelztemperaturen werden in den Feldern unten angezeigt.

Das blockierende Oligo ist so zu gestalten, dass es eine Schmelztemperatur hat, die 10 bis 15 Grad Celsius über der Dehnungstemperatur während des Thermocyclings liegt. Hier beträgt die Ausdehnungstemperatur 72 Grad Celsius. Um die Schmelztemperatur einzustellen, fügen Sie blockierende Basen hinzu, entfernen Sie sie oder ersetzen Sie sie. Vermeiden Sie lange Strecken von drei bis vier blockierenden C- oder G-Basen.

Um die Bildung von Sekundärstrukturen oder Selbstdimerisierung zu vermeiden, gehen Sie zurück zum Startbildschirm der Oligo Tools-Website und wählen Sie das Tool "Oligo Optimizer" aus. Es öffnet sich ein neues Fenster. Fügen Sie die Sequenz der Wildtype-Vorlage, die blockiert werden soll, in das Feld ein. Fügen Sie ein Pluszeichen hinzu, um blockierende Basen anzuzeigen. Wählen Sie die beiden Kästchen für "Sekundärstruktur" und "Nur Selbst" aus und klicken Sie auf die Schaltfläche "Analysieren", um die Ergebnisse für Hybridisierung und Sekundärstruktur anzuzeigen.

Diese Werte stellen sehr grobe Schätzungen der Schmelztemperaturen der Selbstdimere bzw. der Sekundärstrukturen dar. Niedrigere Werte sind optimal und können durch die Begrenzung der Blocker-Blocker-Paarung erreicht werden. Entfernen oder positionieren Sie blockierende Nukleotide neu, um niedrigere Werte zu erzielen. Das hier gezeigte, optimierte blockierende Oligonukleotid für MyD88 schafft ein Gleichgewicht zwischen der Schmelztemperatur des DNA-Blocker-Hybrids und den niedrigen Hybridisierungs- und Sekundärstrukturwerten.

Es wurde entwickelt, um die Aminosäuren Q262 bis I266 abzudecken und verfügt über ein 3'-invertiertes dT, um sowohl die Expansion durch DNA-Polymerase als auch den Abbau durch 3'-Exonuklease zu hemmen. Sobald die Primer entworfen wurden, richten Sie die Wildtyp-Blocking-PCR ein und führen Sie Thermocycling durch, wie im Begleitdokument beschrieben.