Wildtyp-blockierende PCR zum Nachweis niederfrequenter somatischer Mutationen

Die Wildtyp-blockierende Polymerase-Kettenreaktion (WTB-PCR) weist Punktmutationen nach, indem sie mutierte Allele mit geringer Abundanz selektiv amplifiziert und gleichzeitig die Amplifikation von Wildtyp-Allelen mit hoher Abundanz in DNA-Proben hemmt.

Bei der WTB-PCR werden gesperrte Nukleinsäuren oder LNA-haltige, einzelsträngige, modifizierte Oligonukleotide verwendet, die komplementär zum Wildtyp-DNA-Strang der Probe komplementär sind und spezifisch an den komplementären Strang binden. Die LNA-Bindung blockiert die Aktivität der DNA-Polymerase und hemmt die Verlängerung der Wildtyp-Template-DNA.

Um die WTB-PCR durchzuführen, nehmen Sie einen Mastermix mit dNTPs, LNAs und zielspezifischen Vorwärts- und Rückwärtsprimern in nukleasefreiem destilliertem Wasser.

Geben Sie eine thermostabile DNA-Polymerase-haltige Lösung in das Röhrchen und pipettieren Sie die Mischung in die Vertiefung einer PCR-Platte. Geben Sie die genomische DNA-Probe, die Wildtyp- und mutierte DNA enthält, in die Vertiefung und beginnen Sie mit der PCR.

Während der PCR trennt eine durch Hochtemperatur vermittelte Denaturierung die doppelsträngigen DNAs. Die getrennten Stränge dienen als Matrizen für die Primer