Biolayer-Interferometrie-Technologie zum Nachweis von Wechselwirkungen zwischen Ligand und Analyt

Um Liganden-Analyt-Wechselwirkungen mit Hilfe der Biolayer-Interferometrie (BLI) zu erkennen, beginnen Sie mit einem hydratisierten faseroptischen Biosensor, der auf einer BLI-Instrumentenhalterung befestigt und auf das gewünschte Programm eingestellt ist.

Die Biosensorspitze ist mit einer biokompatiblen Schicht beschichtet, die mit Nickel-Nitriotriessigsäure, Ni-NTA-Gruppen, immobilisiert ist. Tauchen Sie die Spitze des Biosensors in Puffer.

Das Instrument sendet weißes Licht in Richtung des Biosensors, das von zwei Grenzflächen reflektiert wird: der internen Referenz- oder optischen Schicht und der biokompatiblen Schicht. Die reflektierten Strahlen interferieren konstruktiv oder destruktiv bei unterschiedlichen Lichtwellenlängen. Ein Photodetektor detektiert das resultierende Interferenzmuster.

Nach der interferometrischen Basisreaktionsmessung fügen Sie eine Histidin-markierte Ligandenlösung hinzu. Histidin-Tags binden an Nickelkationen auf dem Biosensor und immobilisieren Liganden an der Spitze.

Nach der Assoziation wird das emittierte weiße Licht von der optischen Schicht reflektiert und die biokompatible Schicht mit Liganden mit erhöhter optischer Dicke an der Spitze immobilisiert. Dadurch wird der Abstand zwischen den reflektierenden Schichten vergrößert, was zu einer Verschiebung des Interferenzmusters und einer Wellenlängenverschiebung führt.

Waschen Sie die Spitze und entfernen Sie ungebundene Liganden. Mit Zielanalytlösung inkubieren. Der Analyt bindet an den Liganden, wodurch die optische Dicke an der Spitze weiter erhöht wird, was zu einer erhöhten Wellenlängenverschiebung führt.

Positionieren Sie die Biosensorspitze im Puffer. Zeichnen Sie die Wellenlängenverschiebung während der Dissoziation des Analyten von dem an der Spitze immobilisierten Liganden auf.

Die Überwachung der Änderung der Wellenlängenverschiebung im Laufe der Zeit erleichtert die Untersuchung molekularer Wechselwirkungen zwischen Liganden und Analyten.

Schalten Sie die BLItz-Maschine ein. Stellen Sie sicher, dass das Gerät über einen USB-Datenausgang an der Rückseite des Geräts mit dem Computer verbunden ist.

Öffnen Sie auf dem Computer die zugehörige Software und klicken Sie auf "Advanced Kinetics" auf der linken Seite des Bildschirms. Geben Sie in der Software alle relevanten Informationen über das Experiment unter der jeweiligen Überschrift ein. Klicken Sie auf "Biosensor-Typ" und wählen Sie "Ni-NTA" aus dem Dropdown-Menü. Die Dauer jedes Schritts kann bei Bedarf von Standard geändert werden. Um optimale Ergebnisse zu erzielen, verwenden Sie mindestens 30 Sekunden für Initial Baseline und Baseline und 120 Sekunden für Assoziation und Dissoziation

Entfernen Sie den hydratisierten Nickel-NTA-Biosensor aus dem PCR-Röhrchen und befestigen Sie ihn an der Biosensorhalterung an der Maschine, indem Sie den breiten Teil des Biosensors auf die Halterung schieben.

Setzen Sie ein schwarzes 0,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen in den Röhrchenhalter der Maschine ein und pipettieren Sie 400 Mikroliter BLI-Puffer hinein. Schließen Sie die Abdeckung der Maschine so, dass die Biosensorspitze in den Puffer im Mikrozentrifugenröhrchen eintaucht. Klicken Sie in der Software auf "Weiter", um mit der Aufzeichnung der anfänglichen Baseline zu beginnen.

Nachdem der erste Basisschritt die Aufnahme abgeschlossen hat, öffnen Sie die Abdeckung des Geräts. Verschieben Sie den Schieberegler nach rechts. Pipettieren Sie 4 Mikroliter eines dialysierten His-markierten Liganden auf den Tropfenhalter und schließen Sie die Abdeckung des Geräts, das automatisch mit der Aufzeichnung des Ladeschritts beginnt.

Nachdem der Ladevorgang abgeschlossen ist, öffnen Sie die Abdeckung des Geräts. Schieben Sie den Schieberegler nach links, so dass sich der Röhrenhalter wieder vor dem schwarzen Pfeil befindet. Schließen Sie den Deckel der Maschine und stellen Sie sicher, dass die Biosensorspitze in den BLI-Puffer des Röhrchens im Röhrchenhalter eingetaucht ist. Das Gerät und die Software beginnen automatisch mit der Aufzeichnung des Basisschritts.

Nachdem der Basisschritt die Aufnahme beendet hat, öffnen Sie die Abdeckung des Geräts. Entfernen Sie den Tropfenhalter und reinigen Sie ihn, indem Sie das Protein herauspipettieren und es insgesamt fünfmal mit doppelt deionisiertem Wasser spülen. Verwenden Sie ein Taschentuch, um die Oberfläche des Tropfenhalters nach dem letzten Waschen zu reinigen. Setzen Sie den Tropfenhalter wieder auf die Maschine ein. Schieben Sie den Schieberegler an der Maschine nach rechts, so dass sich der Fallhalter wieder vor dem schwarzen Pfeil befindet.

Pipettieren Sie 4 Mikroliter eines dialysierten Analyten auf den Tropfenhalter und schließen Sie die Abdeckung des Geräts, wodurch automatisch mit der Aufzeichnung des Assoziationsschritts begonnen wird. Nachdem der Zuordnungsschritt die Aufnahme abgeschlossen hat, öffnen Sie die Abdeckung des Geräts. Bewegen Sie den Schieberegler am Gerät nach rechts, so dass sich der Schlauchhalter wieder vor dem schwarzen Pfeil befindet, und schließen Sie die Abdeckung des Geräts, wodurch automatisch mit der Aufzeichnung des Dissoziationsschritts begonnen wird.