Name: Bio-Schicht-Interferometrie zur Messung der Kinetik der Protein-Protein-Interaktionen und allosterische Ligandeneffekte (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-18T14:15:00.000+00:00
Duration: 13 min 57 s
Description: Erfahren Sie, wie Bio-Schicht-Interferometrie die Kinetik von Protein-Protein-Interaktionen und allosterische Ligandeneffekte bei ATP-Synthase in Echtzeit misst. Diese Methode liefert präzise kinetische Daten für die biochemische Forschung.

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Wir bedanken uns für die Bereitstellung FortéBio Grafiken in Abbildung 1 verwendet. Diese Arbeit wurde vom NIH GM083088 TMD unterstützt

<html> 1. Programmierung des Instruments für BLI-Test Schalten Sie das Gerät mindestens eine Stunde im Voraus, um die Lampe zum Aufwärmen, das ist notwendig, um das Rauschen zu minimieren und Drift in der optischen Signal während des Experiments. Stellen Sie die gewünschte Temperatur über die Registerkarte Instrument, um die Probe Plattenhalter vorwärmen. Dann das experimentelle Design in der Datenerfassung-Software. Wählen Sie &quot;Neu Kinetics Experiment&quot; in der Registerkarte Assistent Experiment. Dies stellt eine Tabbed-Menü mit allen Schritten, die definiert werden müssen. 1.1. Teller Definition Definieren Sie die Spalten, die auf der 96-Loch-Probenplatte verwendet werden. Weisen Spalten-Puffer, immobilisiert Protein oder Bindungspartner enthalten. Für jeden Verein gut, geben die Konzentration der Bindungspartner verwendet werden. Hinweis: die Platte Definition in Fig. 2 gezeigt hat Optionen für verschiedene Tests. 1.2. Assay Definition NHALT &quot;&gt; Definieren Sie alle Schritte für den Test benötigt. Dazu gehören (i) Baseline (mehrere), (ii) Laden, (iii) Vereinigung und (iv) Die Dissoziation der Bindungspartner. dann, wie unten beschrieben, link einzelnen Testschritte mit Spalten von Vertiefungen auf der Probenplatte durch Auswählen der Testschritt und dann einen Doppelklick auf den jeweiligen Spalten. Diese Programme die Sensoren von einer Spalte von Vertiefungen zur nächsten während des Tests bewegt. <ol><li> Grundlinie Beginnen mit einer kurzen Basislinien Schritt (≥ 60 sec), mit Sensoren in Assay-Puffer (Figur 2, Spalte 1), um Ausgangssignale BLI in der 96-Well-Platte herzustellen. </li><li> Laden (Immobilisierung des biotinylierten Proteins auf die Sensoren) Zuweisen Sensoren Vertiefungen, welche das biotinylierte Protein (Fig. 2, Spalte 2) enthält. Verwenden Sie die Schwellenwertfunktion, um eine vorgegebene Grad der Bindung (siehe Einleitung) zu erreichen. Stellen Sie die Option Schwelle, so dass alle Sensoren Bewegung seind zur nächsten Spalte von Vertiefungen, wenn einer der Sensoren den Schwellenwert erreicht. </li><li> Grundlinie Fügen Sie einen weiteren Schritt in der Baseline-Puffer (Abbildung 2, Spalte 3, in der Regel&gt; 5 min), um die von den Sensoren weg waschen nicht immobilisierten biotinylierten Proteinen und neue, stabile Basislinie Signale. Für grundlegende Bindung / Dissoziation Assays nur (wie in Abbildung 3), extra eine Basisstufe (60 sec) mit Sensoren in neue Brunnen Puffer (Abbildung 2, Spalte 4) vor der Vereinigung Schritt. </li><li> Verband (des Bindungspartners an das immobilisierte Protein) Für eine Grund Bindung / Dissoziation Assay (wie in Abbildung 3), wählen Sie einen Bereich von Konzentrationen der Bindungspartner für verschiedene Sensoren / Brunnen verwendet werden (Abbildung 2, Spalte 5). Einstellen der Schrittzeit, so dass zumindest ein Sättigungskonzentration des Bindungspartners sollte Gleichgewicht nähern Bindungssignal. Für eineAssay, um allosterische Effekte von kleinen Liganden auf die Dissoziation des Protein-Protein-Komplex (siehe Abbildung 5) zu testen, wählen Sie eine einzelne hohe Konzentration der Bindungspartner (~ 10-fache über dem geschätzten K D) für den Einsatz in allen Verband Brunnen. </li><li> Dissoziation (der Bindungspartner) Einen Grundbindungs ​​/ Dissoziation Assay nur (wie in Fig. 3) bezeichnen die Sensoren bis Spalte 4 (Fig. 2), den gleichen Puffer als Brunnen für die zusätzliche Grundlinie vor der Vereinigung verwendet zurückzukehren. Für ein Test, um allosterische Effekte kleiner Liganden zu testen, statt bezeichnen Sensoren bis Spalte 6 (Abbildung 2), wobei jeder gut kann Puffer plus verschiedene allosterische Liganden enthalten zu bewegen. </li></ol> 1.3. Sensor Zuordnung Geben Sie die Stellen in der Sensorschale, die Feuchtsalzstreuung Sensoren für den Test enthält. Identifizieren Sie alle leeren Stellen, da das Experiment fail, wenn keine Sensoren werden bei Ihnen abgeholt. 1.4. Bewertung Experiment Visualisieren Sie alle geplanten Schritte, um auf Fehler zu überprüfen und gehen Sie zurück, um sie zu korrigieren. 1.5. Führen Experiment Geben Sie notwendigen Informationen, einschließlich Standort der Datendateien. Geben Sie die gewünschte Temperatur für das Experiment. Wenn die Sensoren noch Vorbenetzung benötigen, wählen Sie die Option, verzögern Start des Experiments. Schließlich ist, wenn alle Probenvorbereitung abgeschlossen (Schritt 2) und sowohl die Probenplatte und Sensorfach im Gerät geladen ist, klicken Sie auf die Go-Taste, um den Test auszuführen. 2. Probenvorbereitung <ol><li> Eine geeignete Testpuffer. Puffer für Experimente in den Fig. 3 und 5 gezeigt: 20 mM MOPS (3 - (N-Morpholino) propansulfonsäure), Tris (Tris (hydroxymethyl) aminomethan) (um den pH auf 8,0 einzustellen), 50 mM KCl. Fügen BSA (Rinderserumalbumin, Fettsäure-frei, 0.5mg / ml Endkonzentration) in dem Puffer für alle Testschritte und für alle Verdünnungen der biotinylierten Proteins oder Bindungspartner, nicht-spezifische Bindung von Proteinen an die Sensoren zu minimieren. </li><li> Verdünnen Sie die biotinylierte Protein (ε) in Assay-Puffer auf eine geeignete Konzentration (siehe Einleitung). </li><li> Verdünnungen des Bindungspartners (F 1 (-ε)) in Assay-Puffer (siehe Beiträge zu Konzentrationsbereich zu verwenden). </li><li> Vorbefeuchtet die Streptavidin-beschichteten Sensoren für mindestens 10 min auf ihre Schutz Saccharose Beschichtung zu entfernen. Entfernen Sie den Sensor-haltigen Zahnstange von der Sensorleiste und legen Sie eine 96-Well-Platte in den Boden der Schale, Schiebe einer Ecke der Platte in der Orientierungs Kerbe auf dem Tablett. Für die Spalte von Sensoren verwendet werden, mit 200 &amp;mgr; l Assay-Puffer pro well in dieser Spalte der 96-Well-Platte. Bringen Sie das Rack von Sensoren, die das Fach in der richtigen Ausrichtung (mit Tabs in Slots). </li><li> Wie bei der Programmierung in Schritt 1 zugeordnet, füllen Brunnen of die Probenplatte mit Testpuffer oder der entsprechenden Proteinverdünnungen, wie in 2. Einführen von Luftblasen zu vermeiden, da sie Rauschen in dem optischen Signal führen. Eine oder mehrere Referenzvertiefungen, die entweder (i) biotinylierte Protein oder (ii) Bindungspartner verzichtet werden. </li><li> Öffnen Sie die Tür des Gerätes und stecken Sie den Sensor Tablett auf die Bühne (links), mit Reitern des Fachs in die Schlitze der Bühne eingesetzt. Legen Sie die Probenplatte in den Plattenhalter (rechts), stellen Sie sicher, dass die Platte flach und in der richtigen Orientierung sitzt, wie auf dem Plattenhalter angezeigt. Schließen Sie die Tür und starten den Test von der Datenerfassungsprogramm (Schritt 1.5). </li></ol> 3. Datenverarbeitung <ol><li> Nachdem der Test ausgeführt wurde, öffnen Sie die Datenanalyse-Software, und laden Sie den Ordner mit den Daten. Klicken Sie auf die Registerkarte &quot;Bearbeiten&quot;, um eine schrittweise Verarbeitung Menü (links) und die rohen kinetischen Daten zu sehen, mit jedem Sensor (AH) eine andere Farbe zugeordnet (sieheAbbildung 3). </li><li> Unter &quot;Datenauswahl&quot;, klicken Sie auf die Schaltfläche &quot;Sensorauswahl&quot;. Auf der &quot;Sample-Kennzeichen-Karte&quot;, bezeichnen die Vertiefungen für 1 oder 2 Steuersensoren (G, H in Test von Abbildung 3) als Referenzquellen. Auf der Verarbeitung Menü, überprüfen Sie die &quot;Subtraktion&quot; und wählen Sie &quot;Referenz Wells&quot;, um Referenzsignal (Einzel-oder gemittelt) von jedem anderen Sensor das Signal zu subtrahieren. </li><li> Richten Sie alle Spuren zu Y = 0 mit dem &quot;Y-Achse ausrichten&quot; Schritt. Wählen Sie &quot;Baseline&quot; als Ausrichtungsschritt (dies ist die letzte Grundlinie vor der Vereinigung Schritt). Für &quot;Zeitbereich&quot; geben Sie die letzten 10 Sekunden von dieser Grundlinie (dh 50-60 Sekunden für eine 60-Sekunden-Basislinie, wie in Abbildung 3). </li><li> Überprüfen Sie die &quot;Inter-Schritt-Korrektur&quot;-Box, um die Signalverschiebungen zwischen Assoziation und Dissoziation Schritte zu minimieren. Wählen ausrichten, um Baseline oder Dissoziation. </li><li> Wählen Savitzky-Golay-Filter-Funktion in den meisten Fällen und klicken Sie auf &quot;Process Data!&quot; , um fortzufahren. Sichtprüfungdie letzten verarbeiteten Daten (unten rechts). Mit Tests zur globalen Datenanalyse (wie in Abbildung 4) bestimmt, ob das Signal Spuren zeigen eine deutliche Verschiebung zwischen Assoziation und Dissoziation Schritte, ändern Sie die Auswahl der Dissoziation oder Baseline für die &quot;Inter-Schritt-Correction&quot; und neu verarbeiten die Daten, bevor Sie mit Daten Analyse. </li></ol> 4. Datenanalyse Klicken Sie auf die Registerkarte &quot;Analyse&quot; in der Datenanalyse zu beginnen. Hinweis: Das Beispiel unten sind die Schritte für die globale Analyse von mehreren Bindungs ​​/ Dissoziations-Kurven (wie in 3). <ol><li> Für &quot;Step auf Analyze&quot;, wählen Sie Assoziation und Dissoziation. Für &quot;Model&quot;, wählen 01.01. Hinweis: andere begrenzte Optionen sind verfügbar. </li><li> Für &quot;Fitting&quot;, wählen Sie Global (Full). Für &quot;Group By&quot; wählen Farbe (wie auf der Grafik). Wählen Sie &quot;R max UNLINKED Durch Sensor&quot; für unabhängige Montage von R max ermöglichen (maximale Signalantwort auf Sättigung der Bindung des Partner an das immobilisierte Protein). Hinweis: Wir tun dies für die meisten Tests als Sensoren unterscheiden sich leicht in der Menge an Protein immobilisiert (siehe Abbildung 3, Loading). </li><li> Auf der gezeigten Tabelle sicher, dass alle Sensor Spuren analysiert werden dieselbe Farbe haben, so werden sie als globaler Satz analysiert werden. Wählen Sie bei Bedarf ein oder mehrere Sensor Spuren von den globalen Pass weglassen: Unter dem &quot;Include&quot;-Spalte mit der rechten Maustaste auf die gewünschte Sensorposition und wählen Sie &quot;Ausschließen Wells&quot;. </li><li> Klicken Sie auf &quot;Fit Kurven!&quot; , um die nicht-lineare Regressionsanalyse starten. Untersuchen Sie die passenden Ergebnisse, die (i) Überlagerung von Regressionskurven mit Sensordatenspuren (wie in Abbildung 4), (ii) Grundpass Residuen und (iii) eine Tabelle mit bestimmten Parameterwerte (Geschwindigkeitskonstanten, R max umfassen, K D) und Statistiken (Standardfehler für die Parameter, Chi-Quadrat, R 2). </li><li> Unter &quot;Daten-Export&quot;, speichern Anpassungsergebnisse, indem Sie auf &quot;Export Tabelle zu. Csv-Datei&quot;. Für grapHing oder weitere Analyse der Daten / Kurven ausgestattet mit anderer Software, klicken Sie auf &quot;Export Fitting Ergebnisse&quot;, um die Daten der einzelnen Sensor und angepassten Kurve in einer Textdatei speichern. </li></ol>

<ol><li>Nirschl, M., Reuter, F., Voros, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review+of+Transducer+Principles+for+Label-Free+Biomolecular+Interaction+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors%22%5BJournal%5D)">Review of Transducer Principles for Label-Free Biomolecular Interaction Analysis.</a> Biosensors. 1, 70-92 (2011).</li>
<li>Homola, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Present+and+future+of+surface+plasmon+resonance+biosensors%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Bioanal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Present and future of surface plasmon resonance biosensors.</a> Anal. Bioanal. Chem. 377, 528-539 (2003).</li>
<li>Piehler, J., Brecht, A., Gauglitz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Affinity+Detection+of+Low+Molecular+Weight+Analytes%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Affinity Detection of Low Molecular Weight Analytes.</a> Anal. Chem. 68, 139-143 (1996).</li>
<li>Duncan, T. M. The Enzymes. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDuncan%2C+TM+%22Energy+Coupling+and+Molecular+Motors+Vol%22">Energy Coupling and Molecular Motors Vol</a>. Hackney, D. D., Tamanoi, F. XXIII, Elsevier Academic Press. 203-275 (2004).</li>
<li>Feniouk, B. A., Suzuki, T., Yoshida, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+subunit+%CE%B5+in+the+catalysis+and+regulation+of+FOF1-ATP+synthase%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">The role of subunit ε in the catalysis and regulation of FOF1-ATP synthase.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1757, 326-338 (2006).</li>
<li>Cingolani, G., Duncan, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+ATP+synthase+catalytic+complex+%28F1%29+from+Escherichia+coli+in+an+autoinhibited+conformation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struc.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Structure of the ATP synthase catalytic complex (F1) from Escherichia coli in an autoinhibited conformation.</a> Nat. Struc. Mol. Biol. 18, 701-707 (2011).</li>
<li>Mirsaeidi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((After+40+years%2C+new+medicine+for+combating+TB%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Mycobacteriol%22%5BJournal%5D)">After 40 years, new medicine for combating TB.</a> Int. J. Mycobacteriol. 2, 1-2 (2013).</li>
<li>Shah, N. B., Hutcheon, M. L., Haarer, B. K., Duncan, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((F1-ATPase+of+Escherichia+coli%3A+The+%CF%B5-inhibited+state+forms+after+ATP+hydrolysis%2C+is+distinct+from+the+ADP-inhibited+state%2C+and+responds+dynamically+to+catalytic+site+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">F1-ATPase of Escherichia coli: The ϵ-inhibited state forms after ATP hydrolysis, is distinct from the ADP-inhibited state, and responds dynamically to catalytic site ligands.</a> J. Biol. Chem. 288, 9383-9395 (2013).</li>
<li>Burgess, T. L., Ross, S. L., Qian, Y. -x, Brankow, D., Hu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biosynthetic+Processing+of+neu+Differentiation+Factor%3A+glycosylation%2C+trafficking%2C+and+regulated+cleavage+from+the+cell+surface%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Biosynthetic Processing of neu Differentiation Factor: glycosylation, trafficking, and regulated cleavage from the cell surface.</a> J. Biol. Chem. 270, 19188-19196 (1995).</li>
<li>Loo, T. W., Clarke, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+Topology+of+a+Cysteine-less+Mutant+of+Human+P-glycoprotein%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Membrane Topology of a Cysteine-less Mutant of Human P-glycoprotein.</a> J. Biol. Chem. 270, 843-848 (1995).</li>
<li>Tsao, K. -L., DeBarbieri, B., Michel, H., Waugh, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+plasmid+expression+vector+for+the+production+of+biotinylated+proteins+by+site-specific%2C+enzymatic+modification+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">A versatile plasmid expression vector for the production of biotinylated proteins by site-specific, enzymatic modification in Escherichia coli.</a> Gene. 169, 59-64 (1996).</li>
<li>Dayne, D. BioLayer Interferometry (BLI) - How Does it Work?. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDayne%2C+D+%22Fort%C3%A9Bio+newsletter+In+Interactions%22">FortéBio newsletter In Interactions</a>. 5, 8-9 (2012).</li>
<li>Wartchow, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biosensor-based+small+molecule+fragment+screening+with+biolayer+interferometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comput.+Aided+Mol.+Des%22%5BJournal%5D)">Biosensor-based small molecule fragment screening with biolayer interferometry.</a> J. Comput. Aided Mol. Des. 25, 669-676 (2011).</li>
<li>Abdiche, Y., Malashock, D., Pinkerton, A., Pons, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determining+kinetics+and+affinities+of+protein+interactions+using+a+parallel+real-time+label-free+biosensor%2C+the+Octet%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Determining kinetics and affinities of protein interactions using a parallel real-time label-free biosensor, the Octet.</a> Anal. Biochem. 377, 209-217 (2008).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine Interessenkonflikte haben.

Die derzeit verfügbaren Instrumente zur BLI ermöglichen signifikante Durchsatz und Flexibilität in Tests zur biomolekularen Wechselwirkungen. Verschiedene Lösungsproben werden in die Vertiefungen einer schwarzen Mikrotiterplatte abgegeben wird, und einen Satz von parallelen BLI Sensoren programmiert werden, um zwischen den Spalten der Vertiefungen auf der Platte hin und her zu bewegen. Die Proben werden durch Orbitalschütteln während des Tests gerührt. Das hier verwendete System 8 Sensoren und verwendet eine 96-well-Pro...

Protein-Protein-Wechselwirkungen sind wichtig für viele biologische Prozesse und markierungsfreie optische Methoden wie Oberflächenplasmonenresonanz (SPR) wurden in vitro verwendet worden, um die Kinetik der Bindung und Dissoziation 1 studieren. Die meisten markierungsfreien Methoden ein Biomolekül Immobilisierung auf einer Sensoroberfläche und verwenden Sie ein optisches Signal an einen Bindungspartner aus der Lösung zu erkennen, wie es mit dem immobilisierten Biomolekül 1 zuordnet. Während SPR ist ein hochempfindliches Verfahren, ist es anfällig für Störungen aufgrund von Änderungen des Brechungsindex der Lösung über dem Sensor 2 fließt. Obwohl nicht so empfindlich wie SPR, Bio-Schicht-Interferometrie (BLI) weniger von Änderungen in der Probenzusammensetzung 1,3 betroffen. BLI verwendet LWL-Biosensoren, die eine proprietäre biokompatible Beschichtung an der Spitze zu haben. Das hier verwendete (Octet-RED96)-System enthält acht Spektralphotometer. Weißes Licht wird an einer Reihe von Sonden, die an einem Roboterarm bewegen geleitet. Faseroptische Sensoren are, aufgenommen durch die Sonden und in eine Platte mit 96 Vertiefungen enthaltenden Proben. Eines der Zielmoleküle auf der Biosensoroberfläche immobilisiert. Dann Sensoren werden in die Vertiefungen, die die Bindungspartner in der Lösung bewegt wird. BLI überwacht Verband der Bindungspartner immobilisiert mit dem Molekül und überwacht Dissoziation nach dem Umzug die Sensoren an-Lösung ohne den Bindungspartner dann. Bindung von Molekülen an die Biosensor-Oberfläche führt zu Änderungen der optischen Interferenz zwischen Lichtwellen, die von einer Innenfläche und von der externen Schnittstelle zwischen Sensor und zurück in die Lösung Spektralphotometer reflektieren. Diese Veränderungen in der Interferenz quantifiziert und zur kinetischen Raten der Bindung und Dissoziation, wie in der Animation der Figur 1 zusammengefaßt bestimmen. Wir haben BLI angelegt, um Wechselwirkungen zwischen dem katalytischen Komplex von bakteriellen ATP-Synthase und seine ε-Untereinheit, die das automatische hemmen das Enzym zu messen. ATP synthase ist eine membranständige Drehnanomotor, der Synthese und Hydrolyse von ATP katalysiert 4. Der katalytische Komplex (F 1) in einer löslichen Form, die als ATPase arbeitet isoliert werden. Ε-Untereinheit besitzt zwei Domänen: die N-terminale Domäne (NTD) ist die korrekte Montage und funktionelle Kopplung des Enzyms notwendige, aber nicht direkt interagieren mit den katalytischen Untereinheiten, der C-terminalen Domäne (CTD) kann das Enzym durch die Interaktion mit inhibieren mehrere katalytischen Untereinheiten 5,6. Diese ε-vermittelte Regulierung ist spezifisch für bakterielle ATP-Synthase und wird nicht in der mitochondrialen Homolog beobachtet. ATP-Synthase hat als Ziel für antibakterielle Medikamente entstanden, wie die jüngsten FDA-Zulassung von bedaquiline zu arzneimittelresistenten Tuberkulose zu behandeln 7 gezeigt. So Targeting ε die hemmende Rolle für die Wirkstoffforschung konnte die antibakterielle die mitochondriale ATP-Synthase nicht hemmen ergeben. Mit dem isolierten katalytischen Komplex (F 1), εwird zu einem dissoziierbares Untereinheit. Doch mit ε F 1 gebunden ist, der kann einen dramatischen εCTD Konformationsänderung unterziehen, teilweise in zentralen Hohlraum des Enzyms Einfügen und Bildung eines hemmenden Zustand, die wahrscheinlich nicht direkt 6,8 distanzieren ist. Wir verwenden BLI Kinetik der F 1 / ε-Bindung und Dissoziation zu messen, und indirekt an allosterische Effekte von katalytischen-Ort-Liganden auf die ε-Konformation zu untersuchen. In unserem System wurde ε für die Immobilisierung auf der Sensoroberfläche, da BLI-Signal (wie SPR) ausgewählt ist empfindlich gegenüber der Masse der Bindungsmoleküle an der Oberfläche. Die ε-Untereinheit ist klein (~ 15 kDa) gegenüber dem Haupt F 1-Komplex (~ 347 kDa). Somit wird eine größere BLI Signal aus der Bindung an immobilisiertes F 1 ε führen. Um F 1 Dissoziation, die sehr langsam sein kann überwachen, müssen ε stark immobilisiert werden. So entschieden wir uns für biotinylierenUnd Immobilisierung auf Streptavidin-beschichteten Biosensoren. Proteine ​​können durch (i) zufällige Modifikation der Oberfläche Lysine 9, (ii) Umsetzung einer einzigartigen nativen oder gentechnisch Cystein mit einem Biotin-Maleimid-Reagenz 10 oder (iii) Zugabe einer genetisch bestimmten Biotin-Akzeptor-Peptid, das enzymatisch biotinyliert wird während biotinyliert in vivo-Expression des markierten Proteins 11. In unserem System wird ε (iii) 8 unter Verwendung von Verfahren biotinyliert. Sobald Biotin-markierten ε auf Streptavidin immobilisiert Sensoren können BLI die Bindung und Dissoziation von F 1, die von ε-Untereinheit (F 1 (-ε)) abgereicherte messen. Für die hier beschriebenen Experimente war vorläufigen Tests durchgeführt, um angemessene Mengen des biotinylierten Proteins zu bestimmen, um auf die Sensoren zu immobilisieren. Dies kann variieren, abhängig von dem Molekulargewicht des Proteins und seinem Bindungspartner, aber das Ziel ist, eine minimale Menge an immobilisiertem Protein t bestimmenHat bietet (i) akzeptable Signal-zu-Rauschen für Bindungskinetik mit einer niedrigen Konzentration des Bindungspartners (nachfolgend K D) und (ii) minimale Verzerrung Bindungskinetik mit nahezu Sättigungskonzentration des Bindungspartners. Auch kann Stöchiometrie Biotinylierungsgrad variieren (aber vermeiden&gt; 1 Mol Biotin / Mol Protein), so dass einige erste Test kann für jede neue Charge von biotinyliertem Protein benötigt werden, um zu bestätigen, dass eine konsistente BLI-Signal kann während der Immobilisierung auf Streptavidin-beschichteten erreicht werden Sensoren.

<table><tbody><tr><td>Octet-RED96</td><td>Pall/Fort&eacute; Bio</td><td>30-5048</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin</td><td>Sigma</td><td>A6003-10G</td><td>Fettsäurefrei</td></tr><tr><td>Biosensor/Streptavidin</td><td>Pall/Fort&eacute; Bio</td><td>18-5019</td><td>Fach mit 96 Sensoren</td></tr><tr><td>Mikrotiterplatte</td><td>Greiner Bio-one</td><td>655209</td><td>Schwarz, Polypropylen</td></tr><tr><td>Datenerfassungssoftware</td><td>Pall/Fort&eacute; Bio</td><td>Version 6.4</td><td>Neuere Versionen verfügbar</td></tr><tr><td>Datenanalyse-Software</td><td>Pall/Fort&eacute; Bio</td><td>Version 6.4</td><td>Neuere Versionen verfügbar</td></tr></tbody></table>

bio-schicht-interferometrie zur messung der kinetik der protein-protein-interaktionen und allosterische ligandeneffekte

Bio-layer Interferometry for Measuring Kinetics of Protein-protein Interactions and Allosteric Ligand Effects

Wir beschreiben die Verwendung von Bio-Schicht Interferometrie inhibitorische Wechselwirkungen der ε-Untereinheit mit dem katalytischen Komplex von Escherichia coli ATP-Synthase zu studieren. Bakterielle F-ATP-Synthase ist das Ziel eines neuen, von der FDA zugelassene Antibiotikum zur Bekämpfung der medikamentenresistenten Tuberkulose. Verständnis bakterienspezifischen Auto Hemmung der ATP-Synthase durch die C-terminale Domäne von ε-Untereinheit kann ein neues Mittel, um das Enzym für die Entdeckung der antibakterielle Medikamente an. Die C-terminale Domäne von ε erfährt eine dramatische Konformationsänderung, wenn das Enzym die Übergänge zwischen den aktiven und inaktiven Zuständen und katalytischen Ort Liganden beeinflussen, welche von Konformationen ε vorherrschende ist. Die Assay-Maßnahmen Kinetik der ε die Bindung / Dissoziation mit der katalytischen Komplex und indirekt mealeistet die Verschiebung des enzymgebundenen ε zu und von der scheinbar nondissociable inhibitorische Konformation. Die Bio-Schicht Interferometrie Signal nicht überempfindlich auf Lösungszusammensetzung, so kann es auch verwendet werden, um allosterische Effekte von katalytischen Ort Liganden auf Konformationsänderungen ε überwachen werden.

Echtzeit-Bindung und Dissoziation BLI Kinetik sind in Abbildung 3 dargestellt. Dieses Experiment wurde mit Testpuffer in Assoziation und Dissoziation getan. Dieses Experiment wurde mit einer 10 min Basis Schritt gestartet, da die Sensoren erst kurz vorbefeuchtet worden. Als nächstes wurde biotinyliertes ε auf den Sensoren geladen. Keine nachweisbare Dissoziation von ε aufgetreten ganzen restlichen Schritte von der Referenzkurve (G), die keine Bindungspartner aufgenommen hatte gesehen. Eine zweite Refere...

Die Protokolle beschreiben kinetische Untersuchungen von Protein-Protein-Wechselwirkungen mit Bio-Schicht-Interferometrie. F-ATP-Synthase, die in der zellulären Energiestoffwechsel beteiligt ist, kann durch die ε-Untereinheit in Bakterien gehemmt werden. Wir haben Bio-Schicht Interferometrie geeignet ist, Wechselwirkungen des katalytischen Komplexes mit inhibitorischer C-terminalen Domäne ε zu studieren.

Bio-Schicht-Interferometrie zur Messung der Kinetik der Protein-Protein-Interaktionen und allosterische Ligandeneffekte

We describe the use of Bio-layer Interferometry to study inhibitory interactions of subunit &#949;&#160;with the catalytic complex of Escherichia ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, die Kinetik von Proteinen, Proteinwechselwirkungen und die allosterischen Effekte kleiner Liganden auf diese Wechselwirkungen mittels Bio-Layer-Interferometrie (BLI) zu messen. Dies wird erreicht, indem eines der Proteine gezielt mit Biotin markiert und parallel auf der Oberfläche von streptavidinbeschichteten Biosensoren immobilisiert wird.Im zweiten Schritt wird das an den Sensor gebundene Protein einem Puffer ausgesetzt, der seinen Bindungspartner enthält, und die Bindung wird in Echtzeit anhand ihres Einflusses auf die optische Interferenz an der Sensorsoberfläche gemessen. Anschließend wird jeder Sensor in einen Puffer ohne den Bindungspartner überführt, um die Echtzeit-Dissociation des Proteins zu messen. Protein-Komplexe.Die erhaltenen Ergebnisse ermöglichen die Bestimmung der kinetischen Geschwindigkeitskonstanten für die Bindung und Dissoziation der wechselwirkenden Proteine und damit deren Bindungsaffinität. Weitere Ergebnisse zeigen, dass BLI die Auswirkungen kleiner Liganden auf die Dissoziationsrate des Protein-Protein-Komplexes nachweisen kann. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber etablierten Methode

bio-layer-interferometry-for-measuring-kinetics-protein-protein

Research

Forschung

JoVE Journal

Chemistry

Chemie

Wir wenden label-free-Protein-Interaktion Analyse mittels Biacore X100 für Struktur-Funktions-Analyse der Bindung von mehreren Cystatin B-Mutanten durch kinetische Charakterisierung Papain. Calibration-free-Konzentration Analyse (EUFA) misst die Konzentration des Proteins mit behielt bindende Aktivität, ohne die Notwendigkeit für eine Standard-Kurve. Wir zeigen, dass die Bestätigung der Konzentrationen mit EUFA erhöht die Zuverlässigkeit der kinetischen Analyse und die kinetischen Konstanten...

Die Bedeutung der richtigen Protein-Konzentration für Kinetik und Affinity Bestimmung in Struktur-Funktions-Analyse

In diesem Video demonstrieren wir die Biolayer-Interferometrie (BLI)-Technologie, um die intermolekularen Wechselwirkungen zwischen Liganden und Zielanalyten in Echtzeit zu detektieren. BLI misst Veränderungen im Interferenzmuster von weißem Licht, das von einer Schicht immobilisierter Liganden auf einer Biosensoroberfläche reflektiert wird, wenn sie mit Analyten in Lösung interagieren.

Biolayer-Interferometrie-Technologie zum Nachweis von Wechselwirkungen zwischen Ligand und Analyt

Hier das Protokoll beschreibt die Wechselwirkungen von gereinigten hEAG1 Ionen-Kanal-Protein mit niedermolekularer Lipid Liganden Phosphatidylinositol 4, 5-Bisphosphate (PIP-2). Die Messung zeigt, dass BLI eine mögliche Methode für neue kleine Molekül-Ion Channel Liganden Screening werden könnte.

Erfassung der Interaktion Kinetics eines Ionenkanals Proteins mit kleinen Molekülen durch die Bio-Schicht Interferometrie Assay

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um die Montage und Demontage der Biolayer Interferometrie (BLI) mit Milzbrand-Toxin zu überwachen. Nach Montage/Demontage auf der Biosensor-Oberfläche sind von der Oberfläche zur Visualisierung und Identifikation von Komponenten der komplexe mit Elektronenmikroskopie und Massenspektrometrie, bzw. die große Proteinkomplexe veröffentlicht.

Analyse dynamischer Proteinkomplexe montiert auf und befreit Biolayer Interferometrie Biosensor mit Massenspektrometrie und Elektronenmikroskopie

Wechselwirkungen von Transkriptionsfaktoren (TFs) mit der RNA-Polymerase werden in der Regel mit Pulldown-Assays untersucht. Wir wenden eine Biolayer Interferometry (BLI) Technologie an, um die Wechselwirkung von GrgA mit der Chlamydien-RNA-Polymerase zu charakterisieren. Im Vergleich zu Pulldown-Assays erkennt BLI Echtzeit-Assoziation und Dissoziation, bietet eine höhere Empfindlichkeit und ist sehr quantitativ.

Anwendung der Biolayer-Interferometrie (BLI) zur Untersuchung von Protein-Protein-Wechselwirkungen bei der Transkription

Dieser Artikel beschreibt ein Protokoll zur Untersuchung von DNA-Protein-Wechselwirkungen unter Verwendung eines Streptavidin-basierten Biolayer-Interferometrie-Systems (BLI). Es werden die wesentlichen Schritte und Überlegungen zur Verwendung grundlegender oder fortgeschrittener Bindungskinetik zur Bestimmung der Gleichgewichtsbindungsaffinität (KD) der Wechselwirkung beschrieben.

Analyse von DNA-Protein-Wechselwirkungen mit Streptavidin-basierter Biolayer-Interferometrie

Ein einfaches Protokoll, um die neutrale Lipidgehalt der Algenzellen zu bestimmen, mit einer Nil-Rot-Färbung Verfahren beschrieben. Diese zeitsparende Technik bietet eine Alternative zu herkömmlichen gravimetrischen basierten Lipid Quantifizierung Protokolle. Es ist für die spezielle Anwendung der Überwachung Bioprozess Leistung ausgelegt.

Eine einfache und schnelle Protokoll zur Messung neutralen Lipiden in Algenzellen mit Fluoreszenz

Die Nanoskopie mit kolloidaler Sonde kann in einer Vielzahl von Bereichen eingesetzt werden, um Einblicke in die physikalische Stabilität und Gerinnungskinetik kolloidaler Systeme zu gewinnen und bei der Wirkstoffforschung und Formulierungswissenschaft unter Verwendung biologischer Systeme zu helfen. Die im Folgenden beschriebene Methode bietet ein quantitatives und qualitatives Mittel, um solche Systeme zu untersuchen.

Quantitative und qualitative Untersuchung der Partikel-Partikel Wechselwirkungen mit Kolloidales Probe Nanoskopie

Die vorgestellten Protokolle beschreiben zwei enzymgekoppelte Immunsorbentassays (ELISA) basierende Techniken zur schnellen Untersuchung von Ligand-Rezeptor-Interaktionen: Der erste Assay ermöglicht die Bestimmung der Dissoziationskonstante zwischen Ligand und Rezeptor. Der zweite Assay ermöglicht eine schnelle Überprüfung von blockierenden Peptiden für Ligand-Rezeptor-Interaktionen.

Ein ELISA-basierte Bindung und Wettbewerbsverfahren zu schnell zu bestimmen, Ligand-Rezeptor-Wechselwirkungen

Hierin stellen wir eine Methode zur Synthese ligandenfreier Cadmiumsulfid (CdS) Nanopartikel vor, die auf einem einzigartigen Schwefelcopolymer basieren. Das Schwefel-Copolymer fungiert während der Nanopartikelsynthese als Hochtemperaturlösungsmittel und Schwefelquelle und stabilisiert die Nanopartikel nach der Reaktion.

Synthese von Ligand freien CdS-Nanopartikel innerhalb eines Schwefel-Copolymer-Matrix

Erfahren Sie, wie Bio-Schicht-Interferometrie die Kinetik von Protein-Protein-Interaktionen und allosterische Ligandeneffekte bei ATP-Synthase in Echtzeit misst. Diese Methode liefert präzise kinetische Daten für die biochemische Forschung.

Bio-Schicht-Interferometrie zur Messung der Kinetik der Protein-Protein-Interaktionen und allosterische Ligandeneffekte

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