Bio-Schicht-Interferometrie zur Messung der Kinetik der Protein-Protein-Interaktionen und allosterische Ligandeneffekte

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, die Kinetik von Proteinen, Proteinwechselwirkungen und die allosterischen Effekte kleiner Liganden auf diese Wechselwirkungen mittels Bio-Layer-Interferometrie (BLI) zu messen. Dies wird erreicht, indem eines der Proteine gezielt mit Biotin markiert und parallel auf der Oberfläche von streptavidinbeschichteten Biosensoren immobilisiert wird.

Im zweiten Schritt wird das an den Sensor gebundene Protein einem Puffer ausgesetzt, der seinen Bindungspartner enthält, und die Bindung wird in Echtzeit anhand ihres Einflusses auf die optische Interferenz an der Sensorsoberfläche gemessen. Anschließend wird jeder Sensor in einen Puffer ohne den Bindungspartner überführt, um die Echtzeit-Dissociation des Proteins zu messen. Protein-Komplexe.

Die erhaltenen Ergebnisse ermöglichen die Bestimmung der kinetischen Geschwindigkeitskonstanten für die Bindung und Dissoziation der wechselwirkenden Proteine und damit deren Bindungsaffinität. Weitere Ergebnisse zeigen, dass BLI die Auswirkungen kleiner Liganden auf die Dissoziationsrate des Protein-Protein-Komplexes nachweisen kann. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber etablierten Methoden wie der Oberflächenplasmonenresonanz besteht darin, dass BLI nicht übermäßig empfindlich gegenüber Änderungen des Brechungsindex ist.

Die Bindungs- und Assoziations­schritte können somit Änderungen kleiner Liganden beinhalten, um deren Einfluss auf die Protein-Protein-Wechselwirkungen in Echtzeit zu untersuchen. Diese Methode kann jedoch Einblicke in die Kinetik der Protein-Protein-Wechselwirkung liefern. Sie kann außerdem auf verschiedene Kombinationen angewendet werden, beispielsweise die Proteinbindung an immobilisierte DNA oder RNA oder die Liposomenbindung an ein immobilisiertes Protein. Beginnen Sie dieses Experiment, indem Sie das BLI-Gerät gemäß der schriftlichen Versuchs­anleitung einrichten.

Danach das experimentelle Design in der Datenerfassungssoftware einrichten. Im Reiter des Versuchsassistenten „Neues Kinetikexperiment“ auswählen. Dies öffnet ein mehrteiliges Menü, in dem alle Schritte auf dem ersten Reiter definiert werden müssen.

Legen Sie die zu verwendenden Spalten fest. Auf der 96-Well-Probeplatte. Weisen Sie Spalten zu, um Puffer, das zu immobilisierende Protein oder den Bindungspartner zu enthalten.

Für jede Assoziation geben wir die Konzentration des Bindungspartners ein, der verwendet werden soll. Auf Tabulator zwei definieren Sie alle Schritte, die für den Assay erforderlich sind. Dazu gehören die Beladung der Basislinie sowie Assoziation und Dissoziation des Bindungspartners.

Einzelne Assayschritte werden verknüpft mit Kolonnen von Vertiefungen auf der Probenplatte, indem der Assayschritt ausgewählt und anschließend auf die jeweilige Kolonne doppelt geklickt wird. Dadurch werden die Sensoren programmiert, von einer Kolonne von Vertiefungen zur nächsten bewegt zu werden. Beginnen Sie während des Assays mit einem kurzen Basislinienschritt, der mit der ersten Kolonne von Vertiefungen mit Assaypuffer verknüpft ist, um die anfänglichen BLI-Signale in der 96-Loch-Platte zu etablieren.

Verknüpfen Sie dann den Ladeschritt mit den Vertiefungen, die das biotinylierte Protein enthalten sollen. Nutzen Sie die Schwellenwertfunktion, um ein vorbestimmtes Bindungsniveau zu erreichen. Stellen Sie die Schwellenwertoption so ein, dass alle Sensoren zur nächsten Spalte mit Vertiefungen weitergeschaltet werden.

Wenn einer der Sensoren die Schwelle erreicht, fügen Sie einen weiteren Baseline-Schritt im Puffer hinzu, um nicht immobilisierte biotinylierte Proteine von den Sensoren zu waschen und neue stabile Baseline-Signale zu etablieren. Für grundlegende Assays zur Bestimmung globaler Bindungs- und Dissoziationsgeschwindigkeitskonstanten schließen Sie einen zusätzlichen Baseline-Schritt mit Sensoren in einer neuen Spalte von Puffergefäßen vor der Assoziation ein. Schritt danach: Verbinden Sie die Assoziation. Schritt zur Spalte mit Gefäßen, die unterschiedliche Konzentrationen des Bindungspartners enthalten.

Passen Sie die Schrittzeit so an, dass mindestens eine sättigende Konzentration des Bindungspartners das Gleichgewichtssignal der Bindung erreicht. Für den Dissoziationsschritt weisen Sie die Sensoren an, zur vierten Spalte zurückzukehren, dieselben Puffergefäße wie für die zusätzliche Basislinie vor der Assoziation. Die Zeiten für Assoziations- und Dissoziationsschritt können während des Experiments angepasst werden, falls die Raten langsamer oder schneller sind als erwartet.

Auf Tabulator drei geben Sie die Positionen in der Sensorplatte an, die für den Assay vorgenässte Sensoren enthalten sollen. Auf Tabulator vier können Sie eine grafische Überprüfung des Programms vornehmen. Auf Tabulator fünf geben Sie erforderliche Angaben ein, einschließlich des Speicherorts der Datendateien und der gewünschten Temperatur.

Führen Sie für das Experiment die Streptavidin-beschichteten Sensoren mindestens 10 Minuten vorab ein. Um ihre schützende Saccharosebeschichtung zu entfernen, nehmen Sie das Sensorhaltergestell aus dem Sensortablett heraus und setzen Sie eine 96-Loch-Platte in den Boden des Tabletts ein, wobei Sie eine Ecke der Platte in die Orientierungsnut des Tabletts schieben.

Fügen Sie für die verwendete Sensorspalte 200 Mikroliter Assaypuffer pro Vertiefung hinzu. Bringen Sie anschließend die Sensorspalte in der 96-Loch-Platte im korrekten, gemäß der Programmierung vorgesehenen Orientierung in das Tablett zurück. Füllen Sie währenddessen die Vertiefungen der Probenplatte mit Assaypuffer oder den entsprechenden Proteindilutionen. Vermeiden Sie die Bildung von Blasen, da diese Rauschen im optischen Signal verursachen können.

Schließen Sie einen oder mehrere Referenzansätze ein, die entweder das biotinylierte Protein oder den Bindungspartner nicht enthalten. Öffnen Sie die Tür des Geräts und beachten Sie die Lichtemission vom Sensorarm. Setzen Sie das Sensortablett auf die Probehalterung, wobei die Register des Tabletts in die Schlitze der Halterung eingeführt werden.

Platzieren Sie die Probenplatte in den Plattenhalter. Stellen Sie sicher, dass die Platte flach sitzt und die korrekte Ausrichtung gemäß der Markierung am Plattenhalter eingehalten wird. Schließen Sie die Tür und starten Sie den Assay über das Datenerfassungsprogramm.

Wenn die Sensoren weiterhin eine Vorbenetzung erfordern, wählen Sie die Option, um den Beginn des Experiments zu verzögern. Schließlich, sobald die gesamte Probenvorbereitung abgeschlossen ist und sowohl die Probenplatte als auch das Sensortablett im Gerät geladen sind, klicken Sie auf die Schaltfläche „Go“, um den Assay durchzuführen. Nachdem der Assay durchgelaufen ist, öffnen Sie die Software zur Datenanalyse und laden Sie den Ordner mit den Daten.

Klicken Sie auf den Verarbeitungs-Tab, um ein schrittweises Verarbeitungsmenü und die rohen kinetischen Daten anzuzeigen, wobei unter Datenauswahl jedem Sensor eine andere Farbe zugewiesen ist. Klicken Sie auf die Sensorauswahl-Schaltfläche in der Probentabletten-Karte. Weisen Sie im Verarbeitungsmenü eine oder zwei Kontrollsensoren als Referenzgefäße zu.

Wählen Sie das Subtraktionskästchen aus und wählen Sie Referenzgefäße aus, um das Referenzsignal von jedem anderen Sensorsignal zu subtrahieren. Richten Sie alle Kurvenverläufe auf Y gleich null aus, indem Sie den Schritt „Y-Achse ausrichten“ verwenden. Wählen Sie anschließend „Baseline“ als Ausrichtungsschritt für den Zeitbereich aus.

Geben Sie die letzten 10 Sekunden dieser Basislinie ein. Durch Anklicken innerhalb dieses Basislinienschritts wird die Ausrichtung angezeigt. Aktivieren Sie anschließend das Kontrollkästchen für die Inter-Schritt-Korrektur, um Signalverschiebungen zwischen den Assoziations- und Dissoziationsschritten zu minimieren.

Wählen Sie eine Linie für die Basislinie oder Dissoziation aus. Wählen Sie in den meisten Fällen die KY-Gole-Filterfunktion aus und klicken Sie auf „Daten verarbeiten“, um die endgültigen verarbeiteten Daten im unteren rechten Bereich visuell zu überprüfen. Um die Daten zu analysieren, klicken Sie im Datenanalysebereich auf den Reiter „Analyse“ für den zu analysierenden Schritt und wählen Sie Assoziation und Dissoziation aus.

Wählen Sie als Modell „eins zu eins“ für die Anpassung und „global“. Wählen Sie unter „Gruppieren nach“ die Option „Farbe“ und „Rmax unverknüpft nach Sensor“, um eine unabhängige Anpassung der maximalen Signalantwort bei gesättigter Bindung des Partners an das immobilisierte Protein zu ermöglichen. Klicken Sie abschließend auf „Kurven anpassen“, um die nichtlineare Regressionsanalyse zu starten.

Überprüfen Sie die Anpassungsergebnisse, die eine Überlagerung der Regressionskurven mit den Sensordatenspuren, Darstellungen der Anpassungsresiduen und eine Tabelle mit den bestimmten Parameterwerten und Statistiken umfassen. Hier werden Echtzeit-Bindungs- und Dissoziations-BLI-Kinetiken gezeigt. Das Experiment wurde mit einer 10-minütigen Basislinienphase begonnen, da die Sensoren vorher nur kurz benetzt worden waren; anschließend wurde biotinyliertes Epsilon auf die Sensoren aufgebracht.

Während aller verbleibenden Schritte trat gemäß der Referenzkurve, zu der kein Bindungspartner hinzugegeben wurde, keine nachweisbare Dissoziation von Epsilon auf. Ein zweiter Referenzsensor enthielt kein mobilisiertes Protein und zeigte eine geringe unspezifische Bindung des Bindungspartners. Verschiedene Konzentrationen von F1 minus Epsilon wurden im Assoziationsschritt für die Sensoren A bis F verwendet, um die Ergebnisse global zu analysieren und die besten Werte für die Assoziationsgeschwindigkeitskonstante sowie die Gleichgewichtsdissoziationskonstante KD zu erhalten; die Ergebnisse wurden verarbeitet und ergaben die blauen Datenspuren.

In diesem Fall wurde die Referenzsensor-Spur von den Probenspuren subtrahiert, um eine unspezifische Bindung des Bindungspartners sowie Signaldrift des Systems zu korrigieren. Im Schritt der Datenanalyse wurden alle Kurven global mit einem Eins-zu-Eins-Modell angepasst. Die globale Anpassung geht von einer vollständigen Dissoziation des Bindungspartners aus.

Hier wird ein anderes Experiment gezeigt, bei dem das Enzym an auf dem Sensor immobilisiertes Epsilon in Gegenwart von einem Millimolar A-T-P-A-D-T-A gebunden war. Dies führt dazu, dass die meisten F1-Epsilon-Komplexe die nicht inhibierende Konformation annehmen, die sich leicht löst. Anschließend wurden die Sensoren in Dissoziationsgefäße überführt, die Puffer mit unterschiedlichen Liganden enthielten. Dies verdeutlicht die Auswirkungen verschiedener Liganden auf die Konformation von Epsilon.

Beispielsweise verlangsamte die Exposition gegenüber Magnesium A GP und Phosphat die Netto-Dissociation erheblich, was darauf hindeutet, dass sich epsilon in eine fest gebundene, inhibitorische Konformation verschoben hat. Bei der ersten Einrichtung von BLI-Assays ist es wichtig, Kontrollen einzuschließen, um die unspezifische Bindung von Protein an die Sensoren zu testen, und um zu prüfen, ob die unspezifische Bindung signifikant mit den zu verwendenden Protein-Konzentrationen variiert. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man BLI-Assays zur Messung der Kinetik von Protein-Protein-Wechselwirkungen plant, durchführt und analysiert, und dies entsprechend würdigen können.

BLI ermöglicht einen direkten Test der Wirkung kleiner Liganden auf Protein-Protein-Wechselwirkungen.