Bio-Schicht-Interferometrie zur Messung der Kinetik der Protein-Protein-Interaktionen und allosterische Ligandeneffekte

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, die Kinetik von Proteinen, Proteininteraktionen und die allosterischen Effekte kleiner Liganden auf diese Wechselwirkungen mit Hilfe der Biolayer-Interferometrie (BLI) zu messen. Dies wird erreicht, indem eines der Proteine mit spezifischem Biotin präpariert und auf der Oberfläche von Streptokokken immobilisiert wird. Parallel zu Aden beschichteten Biosensoren.

In einem zweiten Schritt wird das sensorgebundene Protein einem Puffer ausgesetzt, der seinen Bindungspartner enthält, und die Bindung wird in Echtzeit anhand ihrer Wirkung auf die optische Interferenz an der Sensoroberfläche gemessen. Als nächstes wird jeder Sensor ohne den Bindungspartner in einen Puffer überführt, um die Dissoziation des Proteins in Echtzeit zu messen. Protein-Komplexe.

Die erzielten Ergebnisse erlauben die Bestimmung der kinetischen Geschwindigkeitskonstanten für die Bindung und Dissoziation der interagierenden Proteine und damit deren Bindungsaffinität. Weitere Ergebnisse zeigen, dass BLI die Auswirkungen kleiner Liganden auf die Dissoziationsrate des Proteinproteinkomplexes nachweisen kann. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der Oberflächenplasmaresonanz besteht darin, dass BLI nicht übermäßig empfindlich auf Änderungen des Brechungsindex reagiert.

Die Bindungs- und Assoziationsschritte können also Veränderungen in kleinen Liganden beinhalten, um ihre Auswirkungen auf die Protein-Protein-Wechselwirkungen in Echtzeit zu testen. Diese Methode kann jedoch Einblicke in die Kinetik der Protein-Protein-Interaktion liefern. Es kann auch auf verschiedene Kombinationen angewendet werden, z. B. auf die Proteinbindung an immobilisierte DNA oder RNA oder die Liposomenbindung an ein immobilisiertes Protein. Beginnen Sie dieses Experiment, indem Sie das BLI-Instrument wie im Textprotokoll beschrieben einrichten.

Richten Sie dann das Versuchsdesign in der Datenerfassungssoftware ein. Wählen Sie auf der Registerkarte des Experimentassistenten die Option Neues Kinetikexperiment aus. Es wird ein Registerkartenmenü mit allen Schritten angezeigt, die auf der ersten Registerkarte definiert werden müssen.

Definieren Sie die zu verwendenden Spalten. Auf der 96-Well-Probenplatte. Ordnen Sie die Säulen zu, die den Puffer enthalten, das zu immobilisierende Protein oder den Bindungspartner.

Geben Sie für jede Assoziation die Konzentration des zu verwendenden Bindungspartners ein. Definieren Sie auf der zweiten Registerkarte alle Schritte, die für den Assay erforderlich sind. Dazu gehören die Baseline-Loading-Assoziation und die Dissoziation des Bindungspartners.

Einzelne Assay-Schritte werden mit Säulen von Wells auf der Probenplatte verknüpft, indem Sie den Assay-Schritt auswählen und dann auf die entsprechende Spalte doppelklicken. Dadurch werden die Sensoren so programmiert, dass sie von einer Well-Säule zur nächsten bewegt werden. Beginnen Sie während des Assays mit einem kurzen Basisschritt, der mit der ersten Säule der Wells mit Assay-Puffer verknüpft ist, um die ersten BLI-Signale in der 96-Well-Platte zu etablieren.

Verknüpfen Sie dann den Ladeschritt mit Vertiefungen, die das biotinylierte Protein enthalten. Verwenden Sie die Schwellenwertfunktion, um eine vorgegebene Bindungsebene zu erreichen. Legen Sie die Option für den Schwellenwert so fest, dass alle Sensoren in die nächste Spalte der Vertiefungen verschoben werden.

Wenn einer der Sensoren den Schwellenwert erreicht, fügen Sie einen weiteren Basisschritt in den Puffer ein, um nicht immobilisierte biotinylierte Proteine von den Sensoren wegzuspülen, und etablieren Sie neue stabile Basissignale für Basisassays zur Bestimmung der globalen Bindungs- und Dissoziationsratenkonstanten. Fügen Sie einen zusätzlichen Basisschritt mit Sensoren in einer neuen Säule von Puffervertiefungen vor der Assoziation ein. Verknüpfen Sie als Nächstes die Zuordnung. Treten Sie zu der Säule mit Vertiefungen, die unterschiedliche Konzentrationen des Bindungspartners enthalten.

Stellen Sie die Schrittzeit so ein, dass zumindest eine Sättigungskonzentration des Bindungspartners das Gleichgewichtsbindungssignal erreichen sollte. Bestimmen Sie für den Dissoziationsschritt die Sensoren, die zu Spalte vier zurückkehren sollen, also zu den gleichen Puffervertiefungen, die für die zusätzliche Basislinie vor der Assoziation verwendet wurden. Die Zeiten für Assoziations- und Dissoziationsschritte können während des Experiments angepasst werden, wenn die Raten langsamer oder schneller als erwartet sind.

Geben Sie auf Registerkarte drei die Positionen im Sensorfach an, die vorbenetzte Sensoren für den Assay enthalten sollen. Der vierte Reiter ermöglicht die grafische Überprüfung des Programms. Geben Sie auf der fünften Registerkarte die erforderlichen Details ein, einschließlich des Speicherorts der Datendateien und der gewünschten Temperatur.

Für das Experiment. Befeuchten Sie die mit Streptavidin beschichteten Sensoren mindestens 10 Minuten lang. Um die schützende Saccharosebeschichtung zu entfernen, entfernen Sie das Sensor-Gestell aus dem Sensorfach und setzen Sie eine 96-Well-Platte in den Boden des Tabletts ein, indem Sie eine Ecke der Platte in die Ausrichtungskerbe am Tablett schieben.

Für die zu verwendende Sensorsäule fügen Sie 200 Mikroliter Assay-Puffer pro Vertiefung hinzu. In dieser Spalte der 96-Well-Platte wird das Rack mit den Sensoren in der korrekten Ausrichtung wieder in das Tablett eingesetzt. Füllen Sie während der Programmierung die Wells der Probenplatte mit Assay-Puffer oder den entsprechenden Proteinverdünnungen. Vermeiden Sie das Einbringen von Blasen, da diese Rauschen im optischen Signal verursachen können.

Fügen Sie eine oder mehrere Referenzvertiefungen hinzu, die entweder biotinyliertes Protein oder Bindungspartner auslassen. Öffnen Sie die Klappe des Instruments und notieren Sie die Lichtabgabe des Sensorarms. Setzen Sie das Sensorfach so auf den Tisch ein, dass die Laschen in die Schlitze des Tisches eingesetzt werden.

Setzen Sie die Probenplatte in den Plattenhalter ein. Vergewissern Sie sich, dass die Platte flach und in der richtigen Ausrichtung sitzt, wie auf dem Tellerhalter angegeben. Schließen Sie die Tür und starten Sie den Assay über das Datenerfassungsprogramm.

Wenn die Sensoren immer noch eine Vorbenetzung benötigen, wählen Sie die Option, um den Start des Experiments zu verzögern. Sobald die gesamte Probenvorbereitung abgeschlossen ist und sowohl die Probenplatte als auch das Sensorfach in das Gerät eingelegt sind, klicken Sie auf die Schaltfläche "Los", um den Assay auszuführen. Nachdem der Assay ausgeführt wurde, öffnen Sie die Datenanalysesoftware und laden Sie den Ordner mit den Daten.

Klicken Sie auf die Registerkarte "Verarbeitung", um ein schrittweises Verarbeitungsmenü und die kinetischen Rohdaten anzuzeigen, wobei jedem Sensor unter der Datenauswahl eine andere Farbe zugewiesen wurde. Klicken Sie auf die Schaltfläche zur Sensorauswahl in der Probenplattenkarte. Legen Sie die Wells für einen oder zwei Steuersensoren als Referenzwells im Verarbeitungsmenü fest.

Aktivieren Sie das Kontrollkästchen "Subtrahierung" und wählen Sie "Referenz-Wells" aus, um das Referenzsignal von allen anderen Sensorsignalen zu subtrahieren. Richten Sie alle Leiterbahnen so aus, dass Y gleich Null ist, indem Sie den Schritt Y-Achse ausrichten verwenden. Wählen Sie dann Baseline als Ausrichtungsschritt für den Zeitraum aus.

Geben Sie die letzten 10 Sekunden dieser Baseline ein. Wenn Sie innerhalb dieses Grundlinienschritts klicken, wird die Ausrichtung angezeigt. Aktivieren Sie als Nächstes das Kontrollkästchen für die Korrektur zwischen den Schritten, um Signalverschiebungen zwischen den Assoziations- und Dissoziationsschritten zu minimieren.

Wählen Sie eine Linie zur Grundlinie oder Dissoziation aus. Wählen Sie in den meisten Fällen die Filterfunktion KY gole aus und klicken Sie auf Prozessdaten, um mit der visuellen Überprüfung der endgültigen Prozessdaten im unteren rechten Bereich fortzufahren. Um die Daten zu analysieren, klicken Sie auf die Registerkarte Analyse in der Datenanalyse für Schritt zur Analyse, wählen Sie Assoziation und Dissoziation aus.

Wählen Sie für das Modell eins zu eins für die Anpassung Global auswählen. Für die Gruppierung nach ausgewählter Farbe wählen Sie r max unlinked by sensor, um eine unabhängige Anpassung der maximalen Signalantwort bei Sättigung der Bindung des Partners an das immobilisierte Protein zu ermöglichen. Klicken Sie abschließend auf Kurven anpassen, um die nichtlineare Regressionsanalyse zu starten.

Untersuchen Sie die Anpassungsergebnisse, die eine Überlagerung von Regressionskurven mit Sensordatenspuren, Diagramme von Anpassungsresiduen und eine Tabelle mit bestimmten Parameterwerten und Statistiken umfassen. Die Echtzeit-Bindungs- und Dissoziations-BLI-Kinetik wird hier gezeigt. Dieses Experiment wurde mit einem 10-minütigen Basisschritt gestartet, da die Sensoren nur kurz mit biotinyliertem Epsilon benetzt wurden.

In allen verbleibenden Schritten trat keine nachweisbare Dissoziation von Epsilon auf, wie aus der Referenzkurve hervorgeht, in der kein Bindungspartner hinzugefügt wurde. Ein zweiter Referenzsensor enthielt kein mobilisiertes Protein und zeigte eine geringe unspezifische Bindung des Bindungspartners. Verschiedene Konzentrationen von F1 minus Epsilon wurden im Assoziationsschritt für die Sensoren A bis F verwendet, um die Ergebnisse global anzupassen und die besten Werte für die Assoziationsratenkonstante zur Assoziationsratenkonstante zu erhalten, und die Ergebnisse der Gleichgewichtsdissoziationskonstante KD wurden verarbeitet, was die blauen Datenspuren ergab.

In diesem Fall wurde die Referenzsensorspur von den Probenspuren subtrahiert, um die unspezifische Bindung des Bindungspartners und die Signaldrift des Systems zu korrigieren. Im Schritt der Datenanalyse wurden alle Kurven global mit einem Eins-zu-Eins-Modell angepasst. Die globale Anpassung geht von einer vollständigen Dissoziation des Bindungspartners aus.

Hier wird ein anderes Experiment gezeigt, in dem das Enzym an sensorimmobilisiertes Epsilon in Gegenwart von einem Millimolar, A-T-P-A-D-T-A, gebunden wurde. Dies prädisponiert die meisten F1-Epsilon-Komplexe dafür, die nicht-inhibitorische Bestätigung anzunehmen, die leicht dissoziiert. Die Sensoren wurden dann in Dissoziationsvertiefungen gebracht, die Assay-Puffer mit verschiedenen Liganden enthielten. Dies zeigt die Auswirkungen verschiedener Liganden auf die Bestätigung von Epsilon.

Zum Beispiel verlangsamte die Exposition gegenüber Magnesium A GP und Phosphat die Nettodissoziation dramatisch, was darauf hindeutet, dass Epsilon die Bestätigung in den fest gebundenen inhibitorischen Zustand verlagerte. Bei der erstmaligen Einrichtung von BLI-Assays ist es wichtig, Kontrollen einzubeziehen, um die unspezifische Bindung des Proteins an die Sensoren zu testen und zu prüfen, ob die unspezifische Bindung signifikant mit den zu verwendenden Proteinkonzentrationen variiert. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man BLI-Assays zur Messung der Kinetik von Protein-Protein-Wechselwirkungen entwirft, programmiert und analysiert, und dies zu schätzen wissen.

BLI ermöglicht einen direkten Test für die Auswirkungen kleiner Liganden auf die Protein-Protein-Wechselwirkungen.