JoVE-Enzyklopädie der Experimente
Biologische Techniken
0 Aufrufe • 4:05 Min. • July 8th, 2025
Guanin-Nukleotid-bindende Proteine – eine Kategorie von GTPasen – fungieren als molekularer Schalter, der zwischen einer GTP-gebundenen aktiven Form und einer GDP-gebundenen inaktiven Form wechselt.
Die aktiven GTPasen binden an spezifische Proteinpartner. Diese Partner konkurrieren um die gleiche Bindungsstelle auf den GTPasen.
Um die kompetitive Bindung zu untersuchen, beginnen Sie mit der Einnahme einer Suspension von GTP-gebundener GTPase, die auf magnetischen Kügelchen immobilisiert ist. Fügen Sie den ersten Interaktionspartner hinzu – das fluoreszenzmarkierte Protein A. Inkubieren Sie unter Rühren, um die Kügelchen in Suspension zu halten. Protein A bindet und sättigt die Bindungsstellen an allen GTPase-Molekülen.
Teilen Sie diese Lösung gleichmäßig in mehrere Rohre auf. Fügen Sie den Röhrchen in zunehmender Menge einen zweiten Interaktionspartner hinzu – das fluoreszenzmarkierte Protein B. Unter Rühren inkubieren.
Protein B bindet an die gleiche Bindungsstelle auf den GTPasen – und verdrängt so Protein A.
Setzen Sie die Röhren einem Magnetfeld aus, um die Kügelchen auf einer Seite zu sammeln. Entsorgen Sie den Überstand, um ungebundene Proteine zu entfernen. Resuspendieren S
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