Wettbewerbsbindungsassay zur Untersuchung konkurrierender GTPase-bindender Proteinpartner

Guanin-Nukleotid-bindende Proteine – eine Kategorie von GTPasen – fungieren als molekularer Schalter, der zwischen einer GTP-gebundenen aktiven Form und einer GDP-gebundenen inaktiven Form wechselt.

Die aktiven GTPasen binden an spezifische Proteinpartner. Diese Partner konkurrieren um die gleiche Bindungsstelle auf den GTPasen.

Um die kompetitive Bindung zu untersuchen, beginnen Sie mit der Einnahme einer Suspension von GTP-gebundener GTPase, die auf magnetischen Kügelchen immobilisiert ist. Fügen Sie den ersten Interaktionspartner hinzu – das fluoreszenzmarkierte Protein A. Inkubieren Sie unter Rühren, um die Kügelchen in Suspension zu halten. Protein A bindet und sättigt die Bindungsstellen an allen GTPase-Molekülen.

Teilen Sie diese Lösung gleichmäßig in mehrere Rohre auf. Fügen Sie den Röhrchen in zunehmender Menge einen zweiten Interaktionspartner hinzu – das fluoreszenzmarkierte Protein B. Unter Rühren inkubieren.

Protein B bindet an die gleiche Bindungsstelle auf den GTPasen – und verdrängt so Protein A.

Setzen Sie die Röhren einem Magnetfeld aus, um die Kügelchen auf einer Seite zu sammeln. Entsorgen Sie den Überstand, um ungebundene Proteine zu entfernen. Resuspendieren Sie die proteinkomplexierten Kügelchen in einem geeigneten Puffer und quantifizieren Sie die gebundenen Proteine.

Plotten Sie die relativen Intensitäten der Proteine A und B, die an GTPase gebunden sind, bei jeder Konzentration von Protein B.

Protein B erreicht ein Gleichgewicht – es besetzt die Bindungsstellen der Hälfte der GTPase-Moleküle – bei einer relativ niedrigeren Konzentration als Protein A, was auf eine höhere Affinität von Protein B zur GTPase hinweist.

Um die Wettkampfbindung durchzuführen, stellen Sie sechs Mikrofuge-Röhrchen mit je 200 Mikrolitern Wettkampfbindungspuffer auf. Jedes Röhrchen sollte außerdem 10 Mikroliter der mit Nukleotiden beladenen Rac1-Kügelchen und fünf Mikroliter des Rac1-bindenden Proteins A als konstantes Bindungsprotein enthalten.

Geben Sie in jedes Röhrchen 0, 1, 2,5, 5, 10 oder 20 Mikroliter Rac1-bindendes Protein B als variables Bindungsprotein. Diese Volumina gehen von ungefähr gleichen Stammkonzentrationen der konstanten und variablen Bindungsproteine aus und müssen möglicherweise angepasst werden.

Das Gesamtvolumen der Bindungsmischung wird durch Zugabe des Wettkampf-Bindungspuffers auf 235 Mikroliter erhöht. Als nächstes richten Sie ein Mikrofuge-Röhrchen ein, das 200 Mikroliter des Wettbewerbspuffers, 10 Mikroliter experimentelle nukleotidbeladene Rac1-Kügelchen und 10 Mikroliter Rac1-bindendes Protein A enthält.

Richten Sie dann GDP, GTPγS und keine Nukleotid-Kontrollröhrchen ein, wie im Textprotokoll beschrieben. Inkubieren Sie die Röhrchen zwei Stunden lang und mischen Sie sie durch Inversion bei 4 Grad Celsius. Waschen Sie die Kügelchen nach der Inkubation dreimal mit dem Wettkampf-Bindungspuffer.

Zum Schluss eluieren Sie die gebundenen Proteine in 20 Mikrolitern reduzierendem Probenpuffer.