Quantifizierung der Membrankräuselbildung mittels Rasterelektronenmikroskopie

Externe Stimulatoren aktivieren Zellen und induzieren eine dreidimensionale zirkuläre Membranvorwölbung oder Membrankräuselbildung, die für verschiedene zelluläre Aktivitäten unerlässlich ist.

Um die Bildung von Membrankräuseln zu visualisieren, beginnen Sie mit einer Multi-Well-Platte, die an der Basis ein Deckglas enthält. Auf der Oberseite des Deckglases befinden sich kultivierte Makrophagen.

Behandeln Sie diese Makrophagen mit Stimulatormolekülen, die die Zellen aktivieren und die Reorganisation des Zytoskeletts und die Bildung von Membranvorsprüngen erleichtern. Überlagern Sie die Zellen mit einer Fixierlösung, vernetzen Sie die Proteine und bewahren Sie die Zellstruktur.

Behandeln Sie die fixierten Makrophagen mit steigenden Alkoholkonzentrationen für eine vollständige Dehydratisierung. Trocknen Sie diese Makrophagen mit einem Trockner an kritischen Punkten aus und entfernen Sie alle Spuren von Wasser für eine bessere Bildgebung.

Befestigen Sie das Deckglas mit leitfähigem Klebeband auf einem Rasterelektronenmikroskopie-Probenhalter (REM). Sputtern überziehen das Makrophagen-haltige Deckglas mit einer dünnen Metallschicht, die eine gute elektronische Leitfähigkeit während der Bildgebung gewährleistet.

Legen Sie das Deckglas in die REM-Kammer. Fokussieren Sie den Elektronenstrahl auf das Deckglas. Der Elektronenstrahl trifft auf die Membran des metallbeschichteten Makrophagen und bewirkt eine niederenergetische Sekundärelektronenbildung von der Membranoberfläche.

Die dreidimensionalen Vorsprünge streuen Elektronen anders als der Rest der Membran, wodurch diese Merkmale auf der Zelloberfläche hervorgehoben werden. Der Detektor sammelt die gestreuten Elektronen aus verschiedenen Zelloberflächenregionen und erzeugt so ein Kontrastbild.

Auf dem REM-Bild erscheinen Makrophagen dunkler mit hellen kreisförmigen Vorsprüngen auf der Oberfläche, was die Kräuselungsbildung bestätigt.

Beginnen Sie damit, sterile Glasdeckgläser mit einer autoklavierten Pinzette in Vertiefungen einer 24-Well-Platte zu legen. Dann säen Sie RAW 264.7-Makrophagen mit einer Dichte von 10⁶ Zellen pro Milliliter auf die Deckgläser und inkubieren Sie die Platte über Nacht in einem befeuchteten Inkubator bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid.

Ersetzen Sie am nächsten Tag das Medium in jeder Vertiefung durch 500 Mikroliter frisches vollständiges Medium und behandeln Sie die Makrophagen dann 30 Minuten lang mit einer Vehikelkontrolle wie DMSO oder einem Makropinozytose-Inhibitor wie EIPA. Um die Membrankräusel zu fördern, behandeln Sie die Zellen 30 Minuten lang mit Makropinozytose-Stimulatoren, wie z. B. einer 1-mikromolaren PMA-Lösung oder 100 Nanogramm pro Milliliter Makrophagen-Kolonie-stimulierender Faktor.

Um die Küvetten für die Rasterelektronenmikroskopie zu fixieren, saugen Sie das Medium aus den Vertiefungen ab und waschen Sie die Deckgläser zweimal mit eiskaltem PBS. Dann inkubieren Sie die Deckgläser 30 Minuten lang bei Raumtemperatur in einem Fixiermittel, gefolgt von einer Inkubation über Nacht bei 4 Grad Celsius.

Waschen Sie die Deckgläser am nächsten Tag vorsichtig, ohne die Zellmonoschicht zu stören, und inkubieren Sie sie dann 15 Minuten lang in 500 Mikrolitern 0,1 molaren Natriumcacodylat. Nach zwei Wäschen mit 500 Mikrolitern destilliertem Wasser waschen Sie die Deckgläser zweimal in 500 Mikrolitern einer abgestuften Ethanolserie mit einer 10-minütigen Inkubation in jeder Wäsche.

Um eine Trocknung an kritischen Punkten durchzuführen, legen Sie die Deckgläser in einen Trockner für kritische Punkte und bedecken Sie sie mit 100 % Ethanol, drücken Sie dann die Ein-/Aus-Taste und öffnen Sie den Kohlendioxidtank. Drücken Sie die Kühltaste ca. 30 Sekunden lang, bis die Temperatur auf 0 Grad Celsius sinkt. Drücken Sie dann die Taste "Füllen", bis eine Blase im Kammerfenster angezeigt wird.

Drücken Sie anschließend die Spültaste, bis der Geruch von Ethanol aus dem Spülauspuff verschwindet. Drücken Sie dann erneut die Taste Cool, bis die Temperatur auf 0 Grad Celsius sinkt. Drücken Sie erneut die Tasten "Füllen" und "Löschen", um sie auszuschalten. Schließen Sie dann den Kohlendioxidtank. Drücken Sie erneut die Cool-Taste, um sie auszuschalten, und drücken Sie dann die Heat-Taste. Stellen Sie die Temperatur auf 42 Grad Celsius und den Druck auf 1.200 Pfund pro Quadratzoll ein.

Sobald sich Druck und Temperatur stabilisiert haben, drücken Sie die Entlüftungstaste, damit der Druck langsam abnimmt. Sobald der Kammerdruck 150 Pfund pro Quadratzoll erreicht, drücken Sie die Entlüftungstaste und warten Sie, bis der Druck auf 0 Pfund pro Quadratzoll sinkt. Schalten Sie den Critical Point Dryer aus und entfernen Sie die Deckgläser.

Montieren Sie anschließend die Deckgläser mit Hilfe von Carbon-Klebelaschen auf die Aluminium-Probenhalterungen für die Rasterelektronenmikroskopie. Fahren Sie dann mit der Sputterbeschichtung mit Gold oder Palladium in einem Sputter-Coater fort.

Schalten Sie den Netzschalter des Sputter-Coaters ein. Nachdem das Vakuum 30 Millitorr erreicht hat, spülen Sie die Kammer, um Feuchtigkeit und Luft zu entfernen, indem Sie den Gasschalter ausschalten und das Feingasventil gegen den Uhrzeigersinn drehen. Sobald das Vakuum auf 200 Millitorr ansteigt, schalten Sie den Gasschalter aus und warten Sie, bis das Vakuum 30 Millitorr erreicht. Spülen Sie dann die Kammer erneut, um Feuchtigkeit und Luft wie gezeigt zu entfernen. Nachdem Sie die Kammer dreimal gespült haben, drücken Sie die Timer-Taste und stellen Sie den Spannungsregler ein, bis das Messgerät 10 Milliampere anzeigt. Entfernen Sie dann die beschichteten Deckgläser aus der Kammer.

Um die Membrankräuselungen sichtbar zu machen und zu quantifizieren, führen Sie die Probendeckgläser in die Kammer eines Rasterelektronenmikroskops ein. Schließen Sie die Tür und drücken Sie die Evac-Taste. Öffnen Sie die Bediensoftware des Mikroskops und stellen Sie die Beschleunigungsspannung auf 15 Kilovolt und den Arbeitsabstand auf 10 Millimeter ein. Drücken Sie die Schaltfläche Koordinaten, und bewegen Sie sich um den Controller, bis die Zellen in der Mitte des Beobachtungsbildschirms angezeigt werden. Stellen Sie die Vergrößerung auf 3500x ein und bilden Sie das Muster ab, indem Sie auf die Schaltfläche Foto klicken.