Flotationsbasierte T-Zell-Isolierung mittels Auftriebs-aktivierter Zellsortierung

Um T-Zellen – weiße Blutkörperchen, die für das Immunsystem unerlässlich sind – mit Hilfe der auftriebsaktivierten Zellsortierung (BACS) zu isolieren, wird eine Suspension von mononukleären Zellen des peripheren Blutes, PBMCs, eingenommen. PBMCs enthalten Ziel-T-Zellen und Nicht-Zielzellen wie B-Zellen, Monozyten, natürliche Killerzellen und dendritische Zellen.

Fügen Sie einen Puffer hinzu, der eine ausreichende Menge biotinylierter Anti-CD3-Antikörper enthält, und inkubieren Sie für die erforderliche Dauer. Der Antikörper bindet an den CD3-Komplex – einen multimeren Proteinkomplex auf der Zelloberfläche – ein charakteristisches Merkmal von T-Zellen.

Fügen Sie funktionalisierte Mikrobläschen hinzu – kleine kugelförmige Partikel, die mit Streptavidin beschichtet sind – für eine positive Selektion von Antikörper-gebundenen T-Zellen. Der Kern jeder Mikroblase ist eine Hohlkugel, was sie zu Partikeln mit geringer Dichte macht, die in einer wässrigen Lösung schwimmen können.

Inkubieren Sie die Mischung unter Rühren, damit sich die Mikrobläschen und die Probe gründlich vermischen können. Während der Inkubation bindet Streptavidin auf der Mikroblase an Biotin auf dem T-Zell-gebundenen Antikörper und immobilisiert die Zellen auf den Mikrobläschen.

Zentrifugieren Sie das Röhrchen. Nicht-Zielzellen trennen sich als Pellet am Boden von der Mischung.

Die an die Ziel-T-Zellen gebundenen Mikrobläschen bleiben an der Oberfläche über Wasser, was zu einer auftriebsbasierten Trennung der T-Zellen führt. Diese Trenntechnik begrenzt die Belastung der Zielzellen. Entfernen Sie mit einer dünnen Pipette das Pellet und den Überstand, ohne die Mikroblasenschicht zu stören.

Resuspendieren Sie die isolierten, mikrobläschengebundenen T-Zellen in einem geeigneten Kulturmedium für die weitere Verarbeitung.

Inkubieren Sie zunächst 3 x 10⁸ kommerziell hergestellte PBMCs in 2,5 Millilitern Trennpuffer mit biotinyliertem Anti-CD3-Antikörper. Mischen Sie die Komponenten vorsichtig durch Pipettieren und inkubieren Sie sie 10 Minuten lang bei Raumtemperatur.

Geben Sie Streptavidin-Mikrobläschen in einem Verhältnis von 0,5 zu 1 gemäß den Anweisungen des Herstellers zu den Zellen und mischen Sie sie mit einem handelsüblichen End-over-End-Rotator bei 20 U/min für 10 bis 15 Minuten bei Raumtemperatur. Bei 400 x g 5 Minuten bei Raumtemperatur zentrifugieren.

Nach der Zentrifugation befinden sich die positiv selektierten Zellen oben in der Suspension mit den Streptavidin-Mikrobläschen, und die verbleibenden nicht selektierten Zellen befinden sich in dem Zellpellet am unteren Ende des Röhrchens.

Führen Sie mit einer 9-Zoll-Glaspipette die Spitze unterhalb der Blasenzellenschicht bis zum Boden des Röhrchens ein. Aspirieren Sie das Zellpellet und den Überstand mit einer elektronischen Pipette und übertragen Sie sie in ein neues Röhrchen.

Die im Originalröhrchen verbliebene Blasenzellenschicht in 1 Milliliter vollständiges T-Zellmedium resuspendieren. Der Überstand wird bei 400 x g 5 Minuten lang bei Raumtemperatur zentrifugiert und zur indirekten Messung der Reinheit und Rückgewinnung verwendet.