Name: Evaluierung der Caspase-Aktivierung zur Beurteilung des angeborenen Immunzelltods (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-01-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 23 s
Description: Lernen Sie die Bewertung der Caspase-Aktivierung in angeborenen Immunzellen zur Untersuchung von Zelltodmechanismen bei Infektionen und Krebs. Diese Methode liefert Einblicke in Krankheitsprozesse.

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Wir danken den Mitgliedern des Kanneganti-Labors für ihre Kommentare und Vorschläge, und wir danken J. Gullett, PhD, für die Unterstützung bei der wissenschaftlichen Redaktion. Die Arbeit in unserem Labor wird durch die Zuschüsse AI101935, AI124346, AI160179, AR056296 und CA253095 (an T.-D.K.) der National Institutes of Health (NIH) sowie durch die American Libanese Syrian Associated Charities (an T.-D.K.) unterstützt. Der Inhalt liegt ausschließlich in der Verantwortung der Autoren und spiegelt nicht unbedingt die offiziellen Ansichten der National Institutes of Health wider.

T.-D.K. ist Berater für Pfizer.

Die Überwachung der Caspase-Spaltung und -Aktivierung liefert eines der umfassendsten Bilder der PCD-Aktivierung des angeborenen Immunsystems als Teil der angeborenen Immunantwort. Das hier beschriebene Protokoll demonstriert eine Strategie zur Überwachung der Caspase-Aktivierung als Reaktion auf IAV-, HSV1- und F. novicida-Infektionen und den sterilen Auslöser LPS + ATP, aber zahlreiche andere Stimuli können PCD induzieren und könnten in dieser Methode verwendet werden, wie in mehreren Veröffentlichungen gezeig...

Das angeborene Immunsystem fungiert als erste Verteidigungslinie während einer Infektion und als Reaktion auf sterile Reize wie Gewebeverletzungen und Veränderungen der Homöostase. Angeborene Immunsensoren auf der Zelloberfläche und im Zytoplasma reagieren auf pathogen- oder schädigungsassoziierte molekulare Muster (PAMPs bzw. DAMPs), um entzündliche Signalwege und zelluläre Reaktionen auszulösen. Einer der Schlüsselprozesse der angeborenen Immunantwort ist die Induktion des Zelltods, um infizierte oder beschädigte Zellen zu entfernen und weitere angeborene und adaptive Immunantworten voranzutreiben. Der programmierte Zelltod (PCD) ist ein hochkonservierter Prozess über Spezies hinweg, was seine evolutionäre Bedeutung als angeborener Immunmechanismus unterstreicht.
Es gibt mehrere angeborene Immun-PCD-Signalwege, die in allen Zelltypen aktiviert werden können. Caspasen sind eine Schlüsselfamilie hochkonservierter, intrazellulärer, Cystein-abhängiger Proteasen, die für viele PCD-Signalwege, einschließlich des traditionell nicht-inflammatorischen Apoptosewegs sowie entzündlicher PCD-Signalwege wie Pyroptose, Nekroptose und PANoptosekritisch sind 1,2,3,4,5 . Es gibt 11 humane und 10 murine Caspasen, die gut definiert sind, sowie Pseudo-Caspasen, die funktionell sein können, und die meisten werden konstitutiv als inaktive monomere oder dimere Pro-Caspasen exprimiert, die eine Spaltung zur Aktivierung erfordern 6,7. Caspasen enthalten auch wichtige Domänen für die Rekrutierung und Bildung von Multiproteinkomplexen. Dazu gehören die Caspase-Aktivierungs- und Rekrutierungsdomäne (CARD), die in Caspase-1, Caspase-2, Caspase-4, Caspase-5, Caspase-9 und Caspase-11 zu finden ist, oder die Todeseffektordomäne (DED), die in Caspase-8 und Caspase-10 zu finden ist. Sowohl durch ihre proteolytische Aktivität als auch durch ihre Fähigkeit, Multiproteinkomplexe zu bilden, sind Caspasen entscheidende Treiber der angeborenen Immun-PCD.
Die Rolle von Caspasen bei der angeborenen Immun-PCD wurde erstmals in der Apoptose identifiziert, wo die Initiator-Caspasen Caspase-2, Caspase-8, Caspase-9 und Caspase-10 die Henker-Caspasen Caspase-3, Caspase-6 und Caspase-7 aktivieren, um den Zelltodzu beschleunigen 8,9,10,11,12. Initiator-Caspasen können durch verschiedene Signalkaskaden aktiviert werden; Der extrinsische Signalweg aktiviert Caspase-8 durch extrazelluläre Liganden-induzierte Todesrezeptor-Signalgebung, und der intrinsische Signalweg aktiviert Caspase-9 durch die Störung der mitochondrialen Integrität13. Aktivierte Initiator-Caspasen spalten den Linker und trennen die großen und kleinen katalytischen Untereinheiten von Henker-Caspasen, um ihre aktiven Formen zu erzeugen. Die Henker-Caspasen spalten dann ihre Substrate, um die Zelle zu zerlegen, was zu DNA-Abbau, Membranblasen, Kernfragmentierung und der Freisetzung apoptotischer Körper führt14,15. Dieser Prozess endet typischerweise in einer nicht-lytischen und nicht-entzündlichen Form des Zelltods, wenn er mit der sofortigen Beseitigung der sterbenden Zellen durch Efferozytosegekoppelt ist 16. Defekte in der Efferozytose oder ein Mangel an phagozytischen Zellen können jedoch zur Anhäufung von apoptotischen Zellen führen, die dann einen lytischen und entzündlichen Zelltod durchlaufen17,18.
Es wurde entdeckt, dass die entzündlichen Caspasen, einschließlich Caspase-1 (Mensch und Maus), Caspase-4 und Caspase-5 (Mensch) und Caspase-11 (Maus), während einer Form der entzündlichen angeborenen Immun-PCD (III-PCD) aktiviert werden, die als Pyroptose bezeichnet wird. Die Caspase-1-Aktivierung ist mit der Bildung von Inflammasomen verbunden, bei denen es sich um Multiproteinkomplexe handelt, die einen zytosolischen angeborenen Immunsensor, ein Adaptermolekül (Apoptose-assoziiertes speckartiges Protein, das eine CARD [ASC] enthält) und Caspase-1 enthalten. Die Bildung dieses Komplexes ermöglicht es Caspase-1, eine Proximity-vermittelte Autoproteolyse zu durchlaufen, um seine aktive Form freizusetzen, die Zielsubstrate spalten kann, einschließlich der proinflammatorischen Zytokine Interleukin (IL)-1β und IL-18 und des porenbildenden Moleküls Gasdermin D (GSDMD)19,20,21,22,23 . Caspase-11, Caspase-4 und Caspase-5 können GSDMD auch aktivieren, ohne dass das Inflammasom stromaufwärts gebildet wird, nachdem PAMPs wie Lipopolysaccharid (LPS) erkannt wurden19,20. Diese Caspasen durchlaufen eine Dimerisierung, gefolgt von einer Oligomerisierung und Selbstspaltung zur Aktivierung bei Bindung an zytosolisches LPS, was zu einer nicht-kanonischen Inflammasom-Aktivierung 24,25,26 und einer Caspase-1-Aktivierung in zellintrinsischer Weise führt, um die IL-1β- und IL-18-Reifung zu induzieren 20. Die Reifung und Freisetzung dieser entzündungsfördernden Zytokine charakterisieren diese Caspasen als "entzündlich". Darüber hinaus wurde festgestellt, dass die apoptotische Caspase-8 auf dem Inflammasom lokalisiert ist, was eine Verbindung zwischen apoptotischen und pyroptotischen Prozessen herstellt. Studien haben gezeigt, dass die apoptotische Caspase-8 auch für die Regulierung einer anderen Form der PCD, der Nekroptose, entscheidend ist. Der Verlust von Caspase-8 führt zu einer spontanen Rezeptor-interagierenden Serin-Threonin-Kinase 3 (RIPK3)-vermittelten Mixed-Lineage-Kinase-Domänen-ähnlichen Pseudokinase (MLKL)-Aktivierung, um den III-PCD-Weg der Nekroptose 27,28,29,30,31,32,33,34,35 anzutreiben.
Während Caspasen in der Vergangenheit aufgrund der Art des Zelltods, den sie auslösen, als "apoptotisch" oder "entzündlich" eingestuft wurden, deuten immer mehr Hinweise darauf hin, dass es durch Caspasen ein umfangreiches Übersprechen zwischen den angeborenen immunen PCD-Signalwegen gibt 3,4. Zum Beispiel spaltet die inflammatorische Caspase-1 aus Inflammasomen die apoptotische Caspase-7 an ihrer kanonischen Aktivierungsstelle34. Die Caspase-1-Aktivierung kann auch zur Spaltung von apoptotischen Substraten wie der Poly(ADP-Ribose)-Polymerase 1 (PARP1)36 führen. In Zellen, denen GSDMD fehlt, kann Caspase-1 auch Caspase-3 spalten37,38. Zusätzlich kann die kanonisch apoptotische Caspase-3 Gasdermin E (GSDME) spalten, um PCD17,18 zu induzieren, und verarbeitet auch GSDMD in eine inaktive Form40. Darüber hinaus wurde eine Caspase-8-Rekrutierung für den Inflammasom-Komplex beobachtet 39,40,41,42,43,44,45, und Caspase-8 ist ein Schlüsselregulator der kanonischen und nicht-kanonischen Inflammasom-Aktivierung 39. Es gibt auch überlappende und redundante Rollen für Caspase-8 und Caspase-1 bei vielen entzündlichen Erkrankungen, und die angeborene Immun-PCD, die durch die Aktivierung von pyroptotischen, apoptotischen und nekrototischen Komponenten gekennzeichnet ist, tritt im gesamten Krankheitsspektrumauf 39,46,47,48,49,50.
Basierend auf dieser Wechselwirkung zwischen entzündlichen und apoptotischen Caspasen wurde eine Schlüssellücke im mechanistischen Verständnis der angeborenen Immunität und der PCD identifiziert, die zur Entdeckung der PANoptose führte. PANoptose ist eine einzigartige Form der III-PCD, die als Reaktion auf Krankheitserreger, PAMPs, DAMPs und Veränderungen der Homöostase aktiviert wird und durch PANoptosomen reguliert wird - facettenreiche makromolekulare Komplexe, die Komponenten aus anderen Zelltodwegen integrieren 44,50,51,52,53,54,55 . Die Gesamtheit der biologischen Wirkungen bei der PANoptose kann nicht allein durch Pyroptose, Apoptose oder Nekroptose allein erklärt werden 3,4,35,36,39,46,47,48, da die PANoptose durch die Aktivierung mehrerer Caspasen gekennzeichnet ist, einschließlich Caspase-1, Caspase-11, Caspase-8, Caspase-9, Caspase-3 und/oder Caspase-7, je nach Kontext 44,48,49,50,51,52,53,54,56,57,58,59,60,61,62 . PANoptose wird zunehmend mit Infektions- und Entzündungskrankheiten sowie mit Krebs und Krebstherapien in Verbindung gebracht 3,4,35,36,39,44,46,47,48,49,50,51,52,53 ,54,56 ,57,58,59,60,61,62,63,64,65,66.
Angesichts der essentiellen Rolle von Caspasen in Zelltodwegen, einschließlich Apoptose, Pyroptose, Nekroptose und PANoptose, ist es wichtig, Techniken zu entwickeln, um ihre Aktivierung zu charakterisieren und die volle Komplexität der PCD-Signalwege zu verstehen. Das Protokoll beschreibt hier eine Methode zur Stimulation von Zellen und zur Messung der anschließenden Aktivierung von Caspasen (Abbildung 1). Diese Methode nutzt die proteolytische Spaltung von Caspasen, die im Allgemeinen für ihre Aktivierung erforderlich ist, um sie zu untersuchen. Durch Western Blot können die Proteingrößen bestimmt werden, was eine klare Visualisierung und Differenzierung von inaktiven Pro-Caspasen und ihren aktivierten, gespaltenen Formen ermöglicht.
Die Hauptvorteile dieses Protokolls sind 1) seine Fähigkeit, die Aktivierung mehrerer Caspasen parallel aus einer einzigen Population endogener Zellen zu beurteilen, um die PCD-Aktivierung genauer zu bestimmen, und 2) die Verwendung relativ einfacher Labortechniken, die keine umfangreiche Schulung oder teure Ausrüstung erfordern. Frühere Protokolle haben Western Blotting, Fluoreszenzreporter oder Antikörperfärbung verwendet, um die Caspase-Aktivierung in Kulturüberständen, Zell- und Gewebelysaten, ganzen Zellen durch Mikroskopie und in vivo 67,68,69,70,71 zu überwachen, aber diese Techniken überwachen im Allgemeinen nur ein oder zwei Caspasen in einer Probe. Während synthetische Peptidsubstrate, die Caspase-Spaltstellen enthalten, die bei der Spaltung fluoreszieren, zur Überwachung der Caspase-Aktivierung in Zell- oder Gewebelysaten69 verwendet wurden, können diese Substrate oft von mehr als einer Caspase gespalten werden, was es schwierig macht, die spezifische Aktivierung einzelner Caspasen in diesem System zu bestimmen. Darüber hinaus ermöglicht die Verwendung von Western Blot anstelle der Verwendung von fluoreszierenden Reportern oder anderen Tag-basierten Methoden den Forschern, endogene Zellen zu verwenden, anstatt spezifische Zelllinien mit Reportergenen zu erzeugen. Die Verwendung endogener Zellen hat mehrere Vorteile, einschließlich der Tatsache, dass viele immortalisierte Zelllinien einen Mangel an Schlüsselmolekülen für den Zelltodaufweisen 72,73, was die Ergebnisse beeinflussen könnte. Darüber hinaus ermöglicht die Verwendung endogener Zellen die Bewertung verschiedener Zelltypen wie Makrophagen, Epithelzellen und Endothelzellen anstelle einer einzelnen Linie. Western Blot ist auch eine relativ einfache und kostengünstige Technik, die in Labors auf der ganzen Welt durchgeführt werden kann, ohne dass große, teure Geräte oder komplizierte Setups erforderlich sind.
Dieses Protokoll ist in der gesamten Biologie weit verbreitet, um sowohl die zelltodabhängigen als auch die zelltodunabhängigen Funktionen von Caspasen zu verstehen, einschließlich ihrer Gerüstrollen und Funktionen in anderen entzündlichen Signalwegen74. Die Anwendung dieser Methode ermöglicht einen einheitlichen Ansatz bei der Untersuchung von PCD-Signalwegen des angeborenen Immunsystems und der Entzündungssignalisierung über Krankheiten und Zustände hinweg, und dieses Protokoll kann verwendet werden, um kritische regulatorische Prozesse und mechanistische Verbindungen zu identifizieren, die die Entwicklung zukünftiger therapeutischer Strategien beeinflussen werden.

<table><tbody><tr><td>0,45 &mu; m Filter</td><td>Millipore</td><td>SCHVU05RE</td><td></td></tr><tr><td>10 mL Spritze</td><td>BD Biosciences</td><td>309604</td><td></td></tr><tr><td>12% Polyacrylamid Gel mit 10 Vertiefungen&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>4561043</td><td></td></tr><tr><td>12-Well-Platte&nbsp;</td><td>Corning</td><td>07-200-82</td><td></td></tr><tr><td>18 G Nadel&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>305195</td><td></td></tr><tr><td>25 G Nadel&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>305122</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Röhrchen&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-809-218</td><td></td></tr><tr><td>70 &mu; M-Zell-Sieb&nbsp;</td><td>Corning</td><td>431751</td><td></td></tr><tr><td>150 mm Gewebekulturschalen</td><td>Corning</td><td>430597</td><td></td></tr><tr><td>182 cm2 Gewebekulturflasche</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-211</td><td></td></tr><tr><td>Zubehör weißes Trans-Tablett</td><td>Cytiva</td><td>29-0834-18</td><td></td></tr><tr><td>Anti&ndash; Caspase-1 Antikörper</td><td>AdipoGen</td><td>AG-20B-0042-C100</td><td></td></tr><tr><td>Anti&ndash; Caspase-11 Antikörper</td><td>Novus Biologicals</td><td>NB120-10454</td><td></td></tr><tr><td>Anti&ndash; Caspase-3-Antikörper</td><td>Zellsignaltechnologie</td><td>9662</td><td></td></tr><tr><td>Anti&ndash; Caspase-7-Antikörper</td><td>Zellsignaltechnologie</td><td>9492</td><td></td></tr><tr><td>Anti&ndash; Caspase-8-Antikörper</td><td>Zellsignaltechnologie</td><td>4927</td><td></td></tr><tr><td>Anti&ndash; Caspase-9-Antikörper</td><td>Zellsignaltechnologie</td><td>9504</td><td></td></tr><tr><td>Anti&ndash; gespaltener Caspase-3-Antikörper&nbsp;</td><td>Zellsignaltechnologie</td><td>9661</td><td></td></tr><tr><td>Anti&ndash; gespaltener Caspase-7-Antikörper&nbsp;</td><td>Zellsignaltechnologie</td><td>9491</td><td></td></tr><tr><td>Anti&ndash; gespaltener Caspase-8-Antikörper</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>8592</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Maus-HRP-konjugierter Sekundärantikörper</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td><td>315-035-047</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Kaninchen-HRP-konjugierter Sekundärantikörper</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td><td>111-035-047</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Ratten-HRP-konjugierter Sekundärantikörper</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td><td>112-035-003</td><td></td></tr><tr><td>Anti&ndash; &beta;-Aktin Antikörper (C4) HRP</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-47778 HRP</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>InvivoGen</td><td>tlrl-atpl</td><td></td></tr><tr><td>BBL Trypticase Soja Bouillon</td><td>BD Biosciences</td><td>211768</td><td></td></tr><tr><td>Bead bath</td><td>Chemglass Life Sciences</td><td>CLS-4598-009</td><td></td></tr><tr><td>Biophotometer D30</td><td>Eppendorf</td><td>6133000010</td><td></td></tr><tr><td>BME</td><td>Sigma</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>Bromphenolblau&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>BO126</td><td></td></tr><tr><td>Zellschaber</td><td>CellTreat Scientific Products</td><td>229315</td><td></td></tr><tr><td>Chemilumineszenz-Imager (Amersham 600)</td><td>Cytiva</td><td>29083461</td><td></td></tr><tr><td>CO2&nbsp; </td><td>Kammer VetEquip</td><td>901703</td><td></td></tr><tr><td>Küvetten</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-955-129</td><td></td></tr><tr><td>Präparierschere</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>221S</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11995-073</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma</td><td>43815</td><td></td></tr><tr><td>Eelektrophorese-Gerät&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>1658004</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Pharmco</td><td>111000200</td><td></td></tr><tr><td>fötales Rinderserum&nbsp;</td><td>Biowest</td><td>S1620</td><td></td></tr><tr><td>Filterpapier</td><td>Bio-Rad</td><td>1703965</td><td></td></tr><tr><td>Pinzette</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-327379</td><td></td></tr><tr><td>Francisella novicida (U112 Stamm)</td><td>BEI Resources</td><td>NR-13</td><td></td></tr><tr><td>Gel-Trenner&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>1653320</td><td></td></tr><tr><td>Gentamycin</td><td>Gibco</td><td>15750060</td><td></td></tr><tr><td>Glycerin</td><td>Sigma</td><td>G7893</td><td></td></tr><tr><td>Glycin</td><td>Sigma</td><td>G8898</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Sigma</td><td>H9892</td><td></td></tr><tr><td>Heizblock</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-043-160</td><td></td></tr><tr><td>Herpes simplex Virus 1 (HF-Stamm)</td><td>ATCC</td><td>VR-260</td><td></td></tr><tr><td>Hoher Glukose-DMEM&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>D6171</td><td></td></tr><tr><td>Menschliches Anti&ndash; Caspase-1-Antikörper</td><td>R& D Systems</td><td>MAB6215</td><td></td></tr><tr><td>Human Anti&ndash; Caspase-8 Antikörper</td><td>Enzo</td><td>ALX-804-242</td><td></td></tr><tr><td>Befeuchteter Inkubator&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>51026282</td><td></td></tr><tr><td>Bildanalysesoftware</td><td>ImageJ</td><td>v1.53a</td><td></td></tr><tr><td>IMDM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12440-053</td><td></td></tr><tr><td>Influenza-A-Virus (A/Puerto Rico/8/34, H1N1 [PR8])&nbsp;</td><td>konstruiert nach Hoffmann et al.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>L929-Zellen</td><td>ATCC</td><td>CCL-1-Zelllinie</td><td>zur Herstellung von L929-konditionierten Medien</td></tr><tr><td>L-Cystein&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP376-100</td><td></td></tr><tr><td>Luminata Forte Western HRP-Substrat</td><td>Millipore</td><td>WBLUF0500</td><td>standardempfindliches HRP-Substrat</td></tr><tr><td>MDCK-Zellen</td><td>ATCC</td><td>CCL-34</td><td>Zelllinie zur Bestimmung des IAV-Virustiters</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Sigma</td><td>322415</td><td></td></tr><tr><td>Mikrozentrifuge</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>75002401</td><td></td></tr><tr><td>Nicht-essentielle Aminosäuren&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>Fettfreies Trockenmilchpulver</td><td>Kroger</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NP-40 Lösung&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>492016</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin und Streptomycin</td><td>Sigma</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>Petrischale</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-202-011</td><td></td></tr><tr><td>PhosSTOP</td><td>Roche</td><td>PHOSS-RO</td><td></td></tr><tr><td>Stromquelle&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>164-5052</td><td></td></tr><tr><td>Proteasehemmer-Tablette</td><td>Sigma</td><td>S8820</td><td></td></tr><tr><td>PVDF-Membran</td><td>Millipore</td><td>IPVH00010</td><td></td></tr><tr><td>Schaukelschüttler</td><td>Labnet</td><td>S2035-E</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma</td><td>L3771</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchlorid&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>Natriumdesoxycholat</td><td>Sigma</td><td>30970</td><td></td></tr><tr><td>Natriumhydroxid</td><td>Sigma</td><td>72068</td><td></td></tr><tr><td>Natriumpyruvat</td><td>Gibco</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>Quadratische Petrischale</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875711A</td><td></td></tr><tr><td>Stripping-Puffer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21059</td><td></td></tr><tr><td>Super Signal Femto HRP Substrat</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>34580</td><td>hochempfindliches HRP-Substrat</td></tr><tr><td>Tischzentrifuge</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>75004524</td><td></td></tr><tr><td>Trans-Blot halbtrockenes System&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>170-3940</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma</td><td>TRIS-RO</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>Ultrareines Lipopolysaccharid (LPS) aus E. coli 0111:B4</td><td>InvivoGen</td><td>tlrl-3pelps</td><td></td></tr><tr><td>Vero Zellen</td><td>ATCC</td><td>CCL-81</td><td>Zelllinie zur Bestimmung des HSV1 Virustiters</td></tr></tbody></table>

evaluierung der caspase-aktivierung zur beurteilung des angeborenen immunzelltods

Evaluation of Caspase Activation to Assess Innate Immune Cell Death

Die angeborene Immunität stellt die entscheidende erste Verteidigungslinie als Reaktion auf Krankheitserreger und sterile Beleidigungen dar. Eine wichtige mechanistische Komponente dieser Reaktion ist die Einleitung des angeborenen immunprogrammierten Zelltods (PCD), um infizierte oder beschädigte Zellen zu eliminieren und Immunantworten zu verbreiten. Eine übermäßige PCD ist jedoch mit Entzündungen und Pathologien verbunden. Daher ist das Verständnis der Aktivierung und Regulation von PCD ein zentraler Aspekt bei der Charakterisierung der angeborenen Immunantwort und der Identifizierung neuer therapeutischer Ziele im gesamten Krankheitsspektrum.
Dieses Protokoll bietet Methoden zur Charakterisierung der PCD-Aktivierung des angeborenen Immunsystems durch Überwachung von Caspasen, einer Familie von Cystein-abhängigen Proteasen, die häufig mit verschiedenen PCD-Signalwegen assoziiert sind, einschließlich Apoptose, Pyroptose, Nekroptose und PANoptose. Erste Berichte charakterisierten Caspase-2, Caspase-8, Caspase-9 und Caspase-10 als Initiator-Caspasen und Caspase-3, Caspase-6 und Caspase-7 als Effektor-Caspasen bei Apoptose, während spätere Studien die entzündlichen Caspasen Caspase-1, Caspase-4, Caspase-5 und Caspase-11 fanden, die Pyroptose auslösen. Es ist nun bekannt, dass es eine umfangreiche Wechselwirkung zwischen den Caspasen und anderen angeborenen Immun- und Zelltodmolekülen über die zuvor definierten PCD-Signalwege gibt, was eine wichtige Wissenslücke im mechanistischen Verständnis der angeborenen Immunität und der PCD identifiziert und zur Charakterisierung der PANoptose führt. PANoptose ist ein einzigartiger angeborener immuninflammatorischer PCD-Signalweg, der durch PANoptosom-Komplexe reguliert wird, die Komponenten, einschließlich Caspasen, aus anderen Zelltodwegen integrieren.
Hier werden Methoden zur Beurteilung der Aktivierung von Caspasen als Reaktion auf verschiedene Reize bereitgestellt. Diese Methoden ermöglichen die Charakterisierung von PCD-Signalwegen sowohl in vitro als auch in vivo, da aktivierte Caspasen eine proteolytische Spaltung durchlaufen, die durch Western Blot unter Verwendung optimaler Antikörper und Blotting-Bedingungen sichtbar gemacht werden kann. Es wurden ein Protokoll und ein Western-Blotting-Workflow etabliert, die es ermöglichen, die Aktivierung mehrerer Caspasen aus derselben Zellpopulation zu bewerten und eine umfassende Charakterisierung der PCD-Prozesse zu ermöglichen. Diese Methode kann in allen Forschungsbereichen in den Bereichen Entwicklung, Homöostase, Infektion, Entzündung und Krebs angewendet werden, um PCD-Signalwege in zellulären Prozessen in Gesundheit und Krankheit zu bewerten.

PANoptose wurde als Reaktion auf zahlreiche bakterielle, virale und Pilzinfektionen und andere entzündliche Reize sowie in Krebszellen beobachtet 44,48,49,50,51,52,53,54,56,57,58,60,61,62 </sup...

Dieses Protokoll beschreibt eine umfassende Methode zur Beurteilung der Caspase-Aktivierung (Caspase-1, Caspase-3, Caspase-7, Caspase-8, Caspase-9 und Caspase-11) als Reaktion auf In-vitro - und In-vivo-Modelle (in Mäusen) von Infektionen, sterilen Beleidigungen und Krebs, um die Initiierung von Zelltodwegen wie Pyroptose, Apoptose, Nekroptose und PANoptose zu bestimmen.

Evaluierung der Caspase-Aktivierung zur Beurteilung des angeborenen Immunzelltods

Innate immunity provides the critical first line of defense in response to pathogens and sterile insults. A key mechanistic component of this response is ...

Dieses Protokoll bietet ein facettenreiches Verständnis der Aktivierung von Zelltodprozessen, das entscheidende Einblicke in Krankheitsmechanismen und therapeutische Strategien liefern kann. Dieses Protokoll beruht auf der Verwendung einer einfacheren Technik und dem Zugriff auf die Aktivierung mehrerer Caspasen, die von einer einzigen Population endogener Zellen unerlässlich sind, um die Aktivierung stark zu bestimmen. Der angeborene Zelltod des Immunsystems wurde über das gesamte Krankheitsspektrum hinweg in Verbindung gebracht, von Infektionen über entzündliche Erkrankungen bis hin zu Krebs.Das Verständnis der molekularen Mechanismen des Zelltods durch Caspase-Aktivierung kann entscheidende Einblicke in Krankheitsprozesse liefern. Dr. Julieann, eine Postdoktorandin aus einem Labor, wird das Verfahren demonstrieren. Nachdem Sie das Knochenmark isoliert und die BMDMs differenziert haben, infizieren Sie die Zellen mit dem Influenza-A-Virus.Berechnen Sie das Virusvolumen, das bei einer Vielzahl von Infektionen von 20 plaquebildenden Einheiten benötigt wird. Entfernen Sie das Medium aus den BMDMs und waschen Sie die Zellen einmal mit 500 Mikrolitern PBS. Geben Sie 450 Mikroliter Infl

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Dieses Video zeigt die Aktivierung von Caspase-Proteinen in menschlichen Makrophagen unter Verwendung von bimolekularen Fluoreszenz-Komplementations-Reporterproteinen. Die Pro-Domänen von Caspase-1 sind mit nicht-fluoreszierenden Fragmenten von Venusproteinen fusioniert, die zu Inflammasom-Komplexen rekrutiert werden. Die Nähe von Inflammasomen induziert die Rückfaltung und Fluoreszenz von Venusfragmenten, was die Caspase-Aktivierung in den Makrophagen bestätigt.

Visualisierung der Caspase-Aktivierung in humanen Monozyten-abgeleiteten Makrophagen

Dieses Video zeigt die Bewertung mehrerer Caspase-Aktivierungen in aus dem Knochenmark stammenden Makrophagen durch Stimulation mit dem Influenzavirus. Nach der Makrophagenlyse, der Hitzeinaktivierung von Lysat und der Zentrifugation werden intrazelluläre Caspasen für die anschließende immunologische Analyse gesammelt.

Bewertung der Aktivierung multipler Caspasen in Makrophagen

Multiplex-Assays können nützliche Informationen für grundlegende zelluläre Mechanismen und beseitigen Abfälle von Reagenzien und unnötig wiederholende Experimenten. Wir beschreiben hier ein Multiplex-Caspase-3/7 Aktivitätstest unter Verwendung von fluoreszierenden und lumineszier-basierte Verfahren, um die Lebensfähigkeit der Zellen in einem in vitro Modell Hypothalamus folgenden oxidativen Herausforderung mit Palmitinsäure bestimmen.

Verwendung eines Caspase Multiplexing-Test zur Apoptose in einer Zelle Hypothalamus Modell ermitteln

Um gesunde Zellen in ganzen Tieren erkennen , die geringe Mengen an Caspase - Aktivität enthalten, die hochempfindliche Biosensor bezeichnet CaspaseTracker wurde für Drosophila erzeugt. Caspase-abhängigen Biosensor-Aktivität wird in langlebigen gesunden Zellen in den inneren Organen der erwachsenen Tiere aufgezogen unter optimierten Bedingungen in Abwesenheit von Tod Stimuli detektiert.

In - vivo - Biosensor - Spuren Non-apoptotischen Caspase - Aktivität in Drosophila

Wir beschreiben die Erkennung des NLRP3-Inflammasome-Aktivierung auf zellulärer Basis mit Fluoreszenz-Mikroskopie und Färbung für aktive Caspase-1 und den Adapter, ASC. Ein Laktat-Dehydrogenase-Release-Assay wird vorgestellt, um Pyroptotic Lyse auf Basis einer Bevölkerung zu erkennen. Diese Techniken können angepasst werden, um viele Aspekte der Inflammasome Biologie zu studieren.

Erkennung von Inflammasome Aktivierung und Pyroptotic Zelltod in murinen Makrophagen Knochenmark abgeleitet

Hier wird ein experimenteller Workflow vorgestellt, der den Nachweis der Caspase-8-Verarbeitung direkt am todesinduzierenden Signalkomplex (DISC) ermöglicht und die Zusammensetzung dieses Komplexes bestimmt. Diese Methodik hat breite Anwendungen, von der Entschlüsselung der molekularen Mechanismen von Zelltodwegen bis hin zur dynamischen Modellierung von Apoptose-Netzwerken.

Messung der Zusammensetzung von CD95 Death-Inducing Signaling Complex und Verarbeitung von Procaspase-8 in diesem Komplex

Dieses Protokoll beschreibt den Arbeitsablauf zur Gewinnung von Monozyten-abgeleiteten Makrophagen (MDM) aus menschlichen Blutproben, eine einfache Methode zur effizienten Einführung von BiFC-Reportern (Bimolecular Fluorescence Complementation) in das menschliche MDM, ohne die Lebensfähigkeit und das Verhalten der Zellen zu beeinträchtigen, und einen bildgebenden Ansatz zur Messung der entzündlichen Caspase-Aktivierung in lebenden Zellen.

Visualisierung von entzündlichen Kaspasen induzierter Nähe in humanen Monozyten-abgeleiteten Makrophagen

Die Infektion mit dem Influenza-A-Virus (IAV) aktiviert die Caspasen, die Wirts- und Virusproteine spalten, die wiederum pro- und antivirale Funktionen haben. Durch den Einsatz von Inhibitoren, RNA-Interferenz, ortsgerichteter Mutagenese und Western Blotting und RT-qPCR-Techniken wurden Caspasen in infizierten Säugetierzellen identifiziert, die Wirtscortactin- und Histon-Deacetylasen spalten.

Identifizierung von Caspasen und ihren Motiven, die Proteine während einer Influenza-A-Virusinfektion spalten

Das vorliegende Protokoll beschreibt zwei Methoden zur Messung der Caspase-Aktivität durch ein fluorogenes Substrat unter Verwendung von Durchflusszytometrie oder einem Spektrofluorometer.

Messung der Caspase-Aktivität mit einem fluorometrischen Assay oder einer Durchflusszytometrie

Zell-vermittelten Lymphozytotoxizität (CML)-Assays können verwendet werden, um autoreaktive Reaktionen und Studium Mechanismen des Zelltods in vitro zu testen. Allerdings kann die Verwendung lebender Zellen konfokale mikroskopische Bildgebung mit Fluoreszenzfarbstoffen, die Art und Kinetik der Zelltod als auch die Wege genutzt näher untersucht werden.

Methoden zur Beta Cell Death vermittelt durch zytotoxische T-Lymphozyten Beurteilung

Lernen Sie die Bewertung der Caspase-Aktivierung in angeborenen Immunzellen zur Untersuchung von Zelltodmechanismen bei Infektionen und Krebs. Diese Methode liefert Einblicke in Krankheitsprozesse.

Evaluierung der Caspase-Aktivierung zur Beurteilung des angeborenen Immunzelltods

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