Dreidimensionale quantitative Phasenbildgebung zur Charakterisierung von Lymphozyten-Subtypen

Laden Sie eine Lymphozyten-Subtyp-Suspension in eine Bildgebungskammer.

Positionieren Sie die Kammer auf dem 3D-Mikroskoptisch für quantitative Phasenbildgebung.

Passen Sie die Mikroskopparameter und die Fokusebene für eine optimale Bildgebung an.

Bei der Lymphozytenbildgebung teilt sich der Laserstrahl in Referenz- und Probenstrahlen auf.

Das digitale Mikrospiegelgerät, das über ein Mikrospiegelarray im Weg des Probenstrahls verfügt, ermöglicht es, den Strahl um 360 Grad um die optische Achse zu drehen.

Jeder Strahl, der den Lymphozyten durchläuft, durchläuft eine Phasenverschiebung, die auf Variationen des Brechungsindex innerhalb der Zelle basiert.

Die resultierenden Proben- und Referenzstrahlen rekombinieren sich zu einem 2D-Hologramm.

Eine Sequenz von Hologrammen, die Phasen- und Amplitudeninformationen aus verschiedenen Winkeln enthalten, wird durch die Strahldrehung um den Lymphozyten erfasst.

Erfassen Sie mehrere Hintergrundhologramme mit unterschiedlichen Beleuchtungswinkeln, mit Ausnahme von Lymphozyten.

Mit Hilfe des Beugungstomographie-Algorithmus rekonstruieren Sie die Hologramme in ein 3D-Brechungsindex-Tomogramm, das morphologische und biochemische Informationen von Lymphozyten liefert, ohne dass eine Markierung erforderlich ist.

Für eine optimale Bildgebung verdünnen Sie jede Zellprobe auf eine Konzentration von 180 Zellen pro Mikroliter RPMI-Medium und injizieren Sie langsam 120 Mikroliter der ersten verdünnten Probe in eine Bildgebungskammer. Nachdem Sie sich vergewissert haben, dass in der Kammer keine Blasen vorhanden sind, geben Sie einen Tropfen destilliertes Wasser auf die Objektivlinse eines quantitativen 3D-Phasenmikroskops und stellen Sie die Bildgebungskammer auf den Translationstisch des Mikroskops. Stellen Sie den Tisch so ein, dass die Probe mit der Objektivlinse ausgerichtet ist, und klicken Sie auf der Registerkarte Kalibrierung der Mikroskopperspektive der Bildgebungssoftware auf Fokus und Oberfläche, um die axialen Positionen des Objektivs bzw. der Kondensorlinsen anzupassen.

Klicken Sie auf Automatikmodus, um das Objektiv und die Kondensorlinsen auszurichten. Um die Ausrichtung zu optimieren, öffnen Sie den Scanmodus und stellen Sie die Linsen manuell so ein, dass das Muster des digitalen Mikrospiegelgeräts in der Mitte ausgerichtet ist. Kehren Sie dann in den Normalmodus zurück und passen Sie die Übersetzungsphase an, um eine Zelle im Sichtfeld zu platzieren. Passen Sie die axiale Position der Objektivlinse an, um die Fokusebene zu finden, bis die auf dem Bildschirm sichtbare Probengrenze fast unsichtbar ist.

Es ist wichtig, den Fokus der Zelle perfekt einzustellen, um ein optimales 3D-RI-Tomogramm zu erstellen. Wenn das Bild nicht richtig aufgenommen wird, wird die 3D-Rekonstruktion beeinträchtigt, was zu einem verrauschten Tomogramm führt.

Passen Sie die Übersetzungsphase an, um eine Position ohne Zelle zu finden, und klicken Sie auf Kalibrieren, um mehrere 2D-Hologramme mit unterschiedlichen Beleuchtungswinkeln zu messen. Passen Sie den Translationstisch so an, dass sich eine Zelle in der Mitte des Sichtfelds befindet, und benennen Sie auf der Registerkarte Erfassung die Probe, die abgebildet werden soll.

Klicken Sie auf 3D-Schnappschuss, um die Hologramme der Zelle mit den gleichen Beleuchtungswinkeln wie für die gerade gemessenen 2D-Hologramme zu messen. Wenn die erfassten Daten in der Datenverwaltungsgruppe angezeigt werden, klicken Sie mit der rechten Maustaste auf die Daten, und klicken Sie auf Verarbeiten, um ein 3D-Brechungsindex-Tomogramm aus den 2D-Hologrammen mithilfe des in der Bildgebungssoftware implementierten Beugungstomographie-Algorithmus zu rekonstruieren. Klicken Sie nach dem Imaging im Bereich "Datenverwaltung" mit der rechten Maustaste auf "Daten" und klicken Sie auf "Öffnen", um die Daten zu visualisieren.

Klicken Sie auf die Mitte der Zelle, um sie neu zu positionieren, und klicken Sie im Bereich Datenmanager auf RI-Tomogramm. Klicken Sie auf der Registerkarte Voreinstellung auf Laden und doppelklicken Sie auf lymphocytes.xml, eine vordefinierte Übertragungsfunktion, die von der Bildgebungssoftware bereitgestellt wird, um das Tomogramm gemäß den 3D-RI-Verteilungen zu visualisieren. Scrollen Sie mit der Maus, um die Ansicht zu vergrößern, und ziehen Sie die Zelle, um sie in eine beliebige Richtung zu drehen.