Quantitative Bildgebung von Lineage-spezifischen Toll-like Rezeptor-vermittelten Signaltransduktion in Monozyten und dendritischen Zellen aus kleinen Proben des menschlichen Blutes

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, den Einsatz der Bildstromtechnologie zur Quantifizierung zellulärer Mechanismen primärer Immunzellen aus gut definierten Patientenkohorten zu demonstrieren. Dies wird erreicht, indem zunächst periphere mononukleäre Blutzellen oder pbmc aus Blutproben von Patienten oder gesunden Probanden isoliert werden. Nach der Isolierung werden die Zellen aktiviert und anschließend fluoreszenzmarkiert.

Anschließend werden die Zellen hydrodynamisch fokussiert, mit Laserlicht angeregt und mittels einer Zeitverzögerungsintegration auf einer CCD-Kamera abgebildet. Abschließend werden Bilder mit dem Bildstrom-Zytometer aufgenommen und die Quantifizierung von NF-kappa-b durchgeführt.

Die Translokation in jedem zellulären Bild wird mithilfe der Ideas-Software durchgeführt. Letztendlich können die Unterschiede zwischen den einzelnen Probandengruppen durch die Analyse von Punktdiagrammen, Histogrammen und Zellbildern bestimmt werden. Der Vorteil des Image Streams liegt darin, dass er Fakten und Immunfluoreszenz kombiniert.

Wir können zelluläre Signaltransduktionswege auf linien-spezifische Weise untersuchen, entweder auf Einzelzell- oder Populationsebene, ausgehend von nur einer kleinen Blutprobe. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Wissenstand zu beantworten, indem sie Signalvermittler lokalisiert und quantifiziert. Beispielsweise kann sie verwendet werden, um die kernwärts gerichtete Translokation von Transkriptionsfaktoren, die durch Wirkstoffe vermittelt wird, zu untersuchen, oder um die Auswirkungen des Alterns auf die Zellbiologie zu analysieren.

Ein Leiter aus meinem Labor wird die Technik demonstrieren, nachdem periphere mononukleäre Blutzellen von menschlichen Freiwilligen isoliert wurden. Resuspendieren Sie die gewonnenen pBMKs mit drei mal 10 hoch sechs Zellen pro 0,6 Milliliter Medium und überführen Sie die Zellsuspension anschließend in 1,5-Milliliter-Röhrchen. Stimulieren Sie danach einen Teil der Zellen mit einem Aktivierungsreagenz wie hier dem TLR8-Liganden R848 und inkubieren Sie alle Zellen dann 10 bis 60 Minuten bei 37 Grad Celsius in einem 5 % CO₂-Inkubator.

Nach der Inkubationszeit die Zellen fünf Minuten bei 500 × g bei Raumtemperatur pelletieren, den Überstand verwerfen und die Zellen mit einem Cocktail von Oberflächenantikörpern, die spezifisch für Monozyten- oder DC-Linien sind, 20 Minuten bei vier Grad Celsius markieren, wobei auch Röhrchen mit Zellen, die mit Einzelfarbkonjugaten markiert sind und als Kompensationskontrollen verwendet werden, eingeschlossen werden. Anschließend die Zellen 10 Minuten bei Raumtemperatur in 4 % PFA-PBS fixieren. Nach einer Zentrifugation der Zellen 10 Minuten bei 500 × g bei Raumtemperatur die PBMCs in Gefriermittel resuspendieren und die Zellen bei minus 80 Grad Celsius lagern, bis sie am Tag des Assays analysiert werden.

Tauen Sie die Zellen schnell in einem Wasserbad bei 37 Grad Celsius auf und permeabilisieren Sie sie nach dem Zentrifugieren zur Entfernung des Einfrierpuffers mit 100 Mikrolitern BD-Perm-Waschpuffer. Anschließend inkubieren Sie sie 20 Minuten bei Raumtemperatur mit Antikörpern gegen intrazelluläre Signalkomponenten, wie hier beispielsweise mit Anti-NF-kappaB-p65-Antikörpern. Nach dem Aufpelletieren resuspendieren Sie die Zellen in 100 Mikrolitern BD-Perm-Waschpuffer, der Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG enthält.

Alexa 6 47 und inkubieren Sie die PBMC weitere 20 Minuten bei Raumtemperatur. Unmittelbar vor der Bildgebung führen Sie eine Gegenfärbung der Zellen mit einem Kernfarbstoff durch. Schalten Sie zunächst den Image Stream ein und starten Sie dann die Inspire-Software. Klicken Sie anschließend auf „Laden der Standardvorlage“ und wählen Sie danach „Initialisierung der Fluidik“.

Klicken Sie dann auf das Menü für die Bildergalerie und wählen Sie „Alle“ aus. Drücken Sie nun auf „Setup ausführen“, um mit der Aufnahme der Perlen zu beginnen, und wählen Sie anschließend den Hellfeldkanal aus. Sobald die Geschwindigkeitsperlen laufen, klicken Sie unter dem Reiter „Assist“ auf „Alle starten“, um das Gerät zu kalibrieren und zu testen.

Nachdem das ImageStream-System kalibriert wurde, drücken Sie Spülen, Verriegeln und Laden, um die hellste Probe in das Gerät einzuladen. Stellen Sie anschließend die Laserleistung so ein, dass jeder Florachrom einen maximalen Pixelwert zwischen 104.000 Zählungen aufweist, gemessen in den Punktdiagrammen. Danach legen Sie die Kriterien für die Zellklassifizierung fest.

Klicken Sie nun auf „Run“, um die Datenerfassung zu starten, und speichern Sie die experimentellen Datendateien, um diese zunächst zu analysieren. Öffnen Sie die Analyse-Software, um kompensierte Bilddateien zu erstellen, und setzen Sie dann einen Tor auf Ereignisse mit normaler Kernfärbungsintensität und hohem Verhältnis der Kernfärbung. Um Einzelzellen im Tor R1 von Zelltrümmern oder mehrzelligen Ereignissen zu unterscheiden, befinden sich Monozyten innerhalb des Tores für CD14-positive Zellen. Myeloische dendritische Zellen, die hoch für CD11c und niedrig für CD4 sowie Lin1-Marker sind, befinden sich im Tor R3.

Verwenden Sie abschließend die Ideas-Software, um die Kolokalisation des zytoplasmatischen Transkriptionsfaktors NF kappa B mit dem nuklearen Farbstoff zu bestimmen. Eine hohe Korrelation zwischen NF kappa B und dem nuklearen Farbstoff, die auf eine Kolokalisation der beiden Marker hinweist, spiegelt sich in einem hohen Ähnlichkeitswert wider und zeigt das Ausmaß der Zellaktivierung an. Der Prozentsatz der Ereignisse mit hohem Ähnlichkeitswert zwischen verschiedenen Behandlungsgruppen oder Patientenpopulationen kann verglichen werden, um die relative funktionelle Effizienz der Zellen mittels Ideas zu bewerten.

Mit Hilfe von Software können anschließend Bilder von Zellen aus Schlüsselsegmenten von Populationshistogrammen dargestellt werden. ImageStream ermöglicht die Gating von Zellsubpopulationen direkt aus PBMCs und die Abbildung von Zellantworten aus gegateten, aber nicht sortierten Zellpopulationen. Hier wurde der Einfluss der TLR-Signaltransduktion auf die nukleäre Lokalisation von NF-kappa-B-p65 in Lin-1-negativen, CD4-dim, CD11c-positiven myeloischen DCs im Ausgangszustand quantifiziert.

Ein hoher Prozentsatz unstimulierter Zellen mit dem Transkriptionsfaktor NF kappa B p65 im Zytoplasma wurde beobachtet. Nach Stimulation wiesen die behandelten Zellen einen signifikant höheren Ähnlichkeitswert von NF kappa B p65 mit der nukleären Färbung PI auf, was darauf hinweist, dass NF kappa B p65 nach Stimulation in den Zellkern translozierte. Digitale Bilder, die gleichzeitig von den unbehandelten oder mit R848 stimulierten Zellpopulationen aufgenommen wurden, zeigen repräsentative Zellen und die Intensität der Translokation von NF kappa B in den Zellkern. Beachten Sie die intensivere Färbung von NF kappa B und PI in der mit R848 stimulierten Gruppe im Vergleich zu den unbehandelten Zellen.

Wir haben diese Technik an Zellen von Spendern unterschiedlichen Alters angewendet und Unterschiede in den TLR-vermittelten NF-kappa-B-Aktivierungswegen gezeigt. Sobald die Technik beherrscht ist, kann sie innerhalb eines Tages durchgeführt werden, zuzüglich Zeit für die Bildanalyse, wodurch sowohl mehrere Lokalisierungsbilder als auch Populationsstatistiken ermöglicht werden. Außerdem können wir Reaktionen direkt aus mehreren Zellpopulationen abbilden, ohne dass eine physische Trennung erforderlich ist. Der Bildstrom kann breit auf eine Vielzahl zellulärer Mechanismen angewendet werden und sollte in der translationsmedizinischen Forschung von großem Wert sein.