Quantitative Bildgebung von Lineage-spezifischen Toll-like Rezeptor-vermittelten Signaltransduktion in Monozyten und dendritischen Zellen aus kleinen Proben des menschlichen Blutes

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, den Einsatz der Bildstromtechnologie zur Quantifizierung zellulärer Mechanismen von primären Immunzellen aus gut definierten Patientenkohorten zu demonstrieren. Dies wird erreicht, indem zunächst mononukleäre Zellen des peripheren Blutes oder pbmc aus Blutproben isoliert werden, die von Patienten oder gesunden Freiwilligen entnommen wurden. Nach der Isolierung werden die Zellen aktiviert und anschließend fluoreszenzmarkiert.

Anschließend werden die Zellen hydrodynamisch fokussiert, mit Laserlicht angeregt und mit einer Zeitverzögerungsintegration abgebildet. CCD-Kamera. Schließlich werden Bilder mit dem Bildstromzytometer und der Quantifizierung von NF kappa b benötigt.

Die Translokation in jedem zellulären Bild wird mit der Software ideas durchgeführt. Letztendlich können die Unterschiede zwischen den einzelnen Probandengruppen durch die Analyse von Punktdiagrammen, Histogrammen und Zellbildern festgestellt werden. Der Vorteil des Bildstroms besteht darin, dass er Fakten und Immunfluoreszenz kombiniert.

Wir sind in der Lage, die Signalwege der Zellen auf eine linienspezifische Weise zu betrachten, entweder einzelne Zellen oder Populationen, und zwar mit nur einer kleinen Blutprobe. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen des Wissens zu beantworten, indem sie Signalzwischenprodukte lokalisiert und quantifiziert. So kann es beispielsweise verwendet werden, um die aktionsvermittelte nukleare Translokation transparenter Faktoren zu untersuchen oder um die Auswirkungen des Alterns auf die Zellbiologie zu untersuchen.

Leiter einer aus meinem Labor wird die Technik demonstrieren Nach der Isolierung von mononukleären Zellen aus dem peripheren Blut, die von menschlichen Freiwilligen gewonnen wurden. Resuspendieren Sie die wiedergewonnenen p BMCs dreimal 10 bis zu den sechsten Zellen pro 0,6 Milliliter Medium und übertragen Sie dann die Zellsuspension auf 1,5 Milliliter Röhrchen. Stimulieren Sie anschließend einige der Zellen mit einem Aktivierungsmittel, wie z. B. dem hier gezeigten TLR eight LA R 8 4 8, und inkubieren Sie dann alle Zellen 10 bis 60 Minuten lang bei 37 Grad Celsius in einem 5%igen Kohlendioxid-Inkubator.

Nach der Inkubationszeit werden die Zellen fünf Minuten lang bei 500-facher G-Temperatur bei Raumtemperatur pelletiert, der Überstand verworfen, die Zellen 20 Minuten lang bei vier Grad Celsius mit einem Cocktail aus Oberflächenantikörpern markiert, die für Monozyten- oder DC-Linien spezifisch sind, einschließlich Röhrchen mit Zellen, die mit einfarbigen Konjugaten markiert sind, um als Kompensationskontrollen verwendet zu werden. Fixieren Sie dann die Zellen 10 Minuten lang bei Raumtemperatur in 4%P-F-A-P-B-S. Nachdem Sie die Zellen 10 Minuten lang bei 500-facher G-Temperatur bei Raumtemperatur zentrifugiert haben, resuspendieren Sie das pbmc in Gefrierpuffer und lagern Sie die Zellen bei minus 80 Grad Celsius, bis sie am Tag des Assays analysiert werden.

Tauen Sie die Zellen schnell in einem 37 Grad Celsius heißen Wasserbad auf und permieren Sie sie nach dem Zentrifugieren, um den Gefrierpuffer zu entfernen, mit 100 Mikrolitern BD Perm Waschpuffer. Anschließend mit anti-intrazellulären Signalkomponenten-Antikörpern wie den hier gezeigten Anti-NF-Kappa-Antikörpern BP 65 für 20 Minuten bei Raumtemperatur markieren. Nach der Pelletierung werden sie von den Zellen Resus in 100 Mikrolitern BD Perm Wash Buffer suspendiert, der Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG enthält.

Alexa 6 47 und inkubieren Sie den pbmc für weitere 20 Minuten bei Raumtemperatur. Unmittelbar vor der Bildgebung beginnen Sie mit der Gegenfärbung der Zellen mit einem nuklearen Farbstoff, indem Sie den Bildstrom einschalten und dann die Inspire-Software starten. Klicken Sie anschließend auf die Standardvorlage laden und wählen Sie dann Fluidik initialisieren.

Klicken Sie dann auf das Menü der Bildergalerie und wählen Sie alle aus. Drücken Sie nun Run Setup Up, um die Bildgebung der Kügelchen zu starten, und wählen Sie dann den Hellfeldkanal aus. Sobald die Geschwindigkeitsperlen ausgeführt sind, klicken Sie auf der Registerkarte "Unterstützung" auf "Alle starten", um das Gerät zu kalibrieren und zu testen.

Nachdem das ImageStream-System kalibriert wurde, drücken Sie auf Spülen, verriegeln und laden, um die hellste Probe in das Gerät zu laden. Stellen Sie dann die Laserleistung so ein, dass jedes Flora Chrome einen maximalen Pixelwert zwischen 104.000 Zählungen hat, wie in den Punktdiagrammen gemessen. Legen Sie dann die Kriterien für die Zellklassifizierung fest.

Klicken Sie nun auf Ausführen, Abrufen, um die Experimentdatendatei zu sammeln und zu speichern, um die Datendateien zuerst zu analysieren und Ideen zu öffnen. Analysesoftware erstellt kompensierte Bilddateien und gatet dann auf Ereignisse mit einer normalen Kernfarbstoffintensität und einem hohen Kernfarbstoff-Seitenverhältnis. Um einzelne Zellen im R-Ein-Gatter von Trümmern oder multizellulären Ereignissen zu unterscheiden, finden sich Monozyten innerhalb des Gates für CD 14-positive Zellen, myeloische dendritische Zellen, die für CD 11 C hoch und für CD 4 niedrig sind, und Lin-One-Marker befinden sich im R-3-Gatter.

Verwenden Sie schließlich eine Ideensoftware, um die Kolokalisation des zytoplasmatischen Transkriptionsfaktors NF kappa B mit dem Kernfarbstoff zu bestimmen. Eine hohe Korrelation des nuklearen Farbstoffs NF kappa B, die auf eine Kolokalisation der beiden Marker hinweist, spiegelt sich in einem hohen Ähnlichkeitswert wider und zeigt den Grad der Aktivierung der Zelle an. Der Prozentsatz der Ereignisse mit hoher Ähnlichkeit zwischen verschiedenen Behandlungsgruppen oder Patientenpopulationen kann verglichen werden, um die relative funktionelle Effizienz der Zellidee zu bewerten.

Software kann dann verwendet werden, um Bilder von Zellen aus Schlüsselsegmenten von Populationshistogrammen anzuzeigen. ImageStream ermöglicht das Gating von Zelluntergruppen direkt aus pbmc und die Bildgebung von Zellantworten aus gated, aber unsortierten Zellpopulationen. Hier wurde der Effekt des TLR-Signalwegs auf die nukleäre Lokalisation von NF kappa BP 65 in lin eins, negativer CD vier, dim CD 11 C positiver myeloischer dcs zu Studienbeginn quantifiziert.

Es wurde ein hoher Prozentsatz an unstimulierten Zellen mit dem Transkriptionsfaktor NF kappa BP 65 im Zytoplasma beobachtet. Nach der Stimulation wurde bei den behandelten Zellen ein signifikant höherer Ähnlichkeitswert von NF Kappa BP 65 mit der Kernfärbung PI festgestellt, was darauf hindeutet, dass NF Kappa BP 65 trans nach der Stimulation in den Zellkern gelangte. Digitale Bilder, die gleichzeitig von unbehandelten oder R 8 48 stimulierten Zellpopulationen aufgenommen wurden, zeigen repräsentative Zellen und die Intensität von NF kappa B trans, die sich in den Zellkern befinden. Man beachte die hellere Intensität der NF-, Kappa-, B- und PI-Färbung in der R 8 48-stimulierten Gruppe im Vergleich zu den unbehandelten Zellen.

Wir haben diese Technik an Zellen von Spendern unterschiedlichen Alters angewendet und Unterschiede in den TLR-vermittelten NF Kappa B-Aktivierungswegen gezeigt. Einmal gemeistert, kann diese Technik innerhalb eines Tages innerhalb zusätzlicher Zeit für die Bildanalyse durchgeführt werden, was sowohl mehrere Lokalisierungsbilder als auch Populationsstatistiken ermöglicht. Darüber hinaus können wir Reaktionen von mehreren Zellpopulationen direkt abbilden, ohne dass es zu einer physischen Trennung kommt. Der Bildstrom kann auf eine Reihe von zellulären Mechanismen angewendet werden und sollte in der translationalen Forschung sehr wertvoll sein.