Licht-Blatt-Mikroskopie zur dreidimensionalen Visualisierung der menschlichen Immunzellen

Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Immunologie zu beantworten, z. B. wie genau sich Immunzellen in einem physiologisch relevanten Kontext verhalten, z. B. wie Zielzellen effizient in einer dreidimensionalen Umgebung gesucht werden können. Der Hauptvorteil dieser Methode besteht darin, eine sehr dünne Lichtschicht zu erzeugen, die nur die Fokusebene beleuchtet, ohne die Zellen außerhalb der Ebene zu beeinflussen. Dies ermöglicht eine sehr schnelle Erfassungsgeschwindigkeit bei ausgeprägter Reduktion von Bleaching und Photozytotoxizität.

Dieses Verfahren wird von Dr. Renping Zhao, einem Postdoktoranden aus meinem Labor, demonstriert. Zu Beginn werden unter einer Zellkulturhaube 400 Mikroliter gekühlte Kollagen-Stammlösung in ein steriles 1,5-Milliliter-Röhrchen überführt. Fügen Sie langsam 50 Mikroliter gekühltes 10X PBS hinzu.

Mischen Sie dann die Lösung, indem Sie das Röhrchen vorsichtig kippen. Geben Sie 48 Mikroliter 0,1 molares Natriumhydroxid in die Kollagenlösung, um den pH-Wert auf 7,2 bis 7,6 einzustellen. Verwenden Sie pH-Teststreifen, um den pH-Wert der Mischung zu bestimmen.

Fügen Sie zwei Mikroliter steriles destilliertes deionisiertes Wasser hinzu, um das endgültige Volumen auf 500 Mikroliter zu bringen. Gut mischen und die Kollagenlösung bis zur weiteren Verwendung auf Eis oder bei vier Grad Celsius lagern. Nach der Fluoreszenzmarkierung lebender Zellen gemäß dem Textprotokoll werden unter der Zellkulturhaube einmal 10 bis die sechsten Zellen in ein steriles 1,5-Milliliter-Röhrchen überführt.

Zentrifugieren Sie das Röhrchen acht Minuten lang bei 200 mal g. Entsorgen Sie dann den Überstand und verwenden Sie 200 Mikroliter Nährmedium, um das Pellet wieder zu suspendieren. Geben Sie 85,9 Mikroliter der neutralisierten Kollagenlösung in die Zellsuspension und mischen Sie richtig, um eine Kollagenkonzentration von 2,5 Milligramm pro Milliliter zu erreichen.

Lassen Sie die Zellkollagenmischung auf Eis in der Haube. Führen Sie als Nächstes einen Kolben in die passende Kapillare ein, bis der Kolben einen Millimeter aus der Kapillare herausragt. Befeuchten Sie dann den Kolben, indem Sie ihn in Kulturmedium tauchen.

Das Überspringen dieses Schritts kann zu einer unerwünschten Einführung von Luftblasen zwischen dem Kolben und der Kollagenmatrix führen. Tauchen Sie die Kapillare in das Zellkollagengemisch und ziehen Sie den Kolben langsam 10 bis 20 Millimeter zurück. Befeuchten Sie dann mit einer Sprühflasche mit 70 % Ethanol ein Papiertuch und wischen Sie damit die Außenwand der Kapillare ab, um die restliche Kollagenlösung zu entfernen.

Befestigen Sie nun mit Modelliermasse die Kapillare an der Innenwand eines Fünf-Milliliter-Röhrchens. Schieben Sie die Zellkollagenmischung an den Rand der Kapillare. Dann inkubieren Sie das Röhrchen mit der Kapillare bei 37 Grad Celsius und 5% CO2 für eine Stunde, um das Kollagen zu polymerisieren.

Geben Sie nach der Inkubation ein bis zwei Milliliter Nährmedium in das Röhrchen. Stoße dann den polymerisierten Kollagenstab vorsichtig in das Medium aus, bis etwa die Hälfte des Kollagens im Medium hängt. Inkubieren Sie die Kapillare für weitere 30 Minuten.

Um die Lichtblattmikroskopie durchzuführen, bauen Sie die Probenkammer gemäß den Anweisungen des Herstellers zusammen. Platzieren Sie nach dem Einschalten des Mikroskops und des Inkubators bei der Live-Bildgebung die Kapillare in der Probenkammer, lokalisieren Sie die Probe und suchen Sie den Interessenbereich für die Bildaufnahme. Aktivieren Sie die entsprechenden Laser.

Stellen Sie dann die Laserleistung und die Belichtungszeit ein. Legen Sie außerdem die Schrittweite des Z-Stapels, die Start- und Endpositionen des Z-Stapels und das Zeitintervall für das Live-Cell-Imaging fest. Starten Sie dann die Bildaufnahme.

Übertragen Sie einen Milliliter 4%-Paraformaldehyd in PBS in ein Fünf-Milliliter-Röhrchen unter einer chemischen Haube. Tauchen Sie dann die Kapillare mit dem polymerisierten Kollagen in die Paraformaldehyd-Lösung und befestigen Sie die Kapillare mit Modelliermasse an der Innenwand des Röhrchens. Drücken Sie vorsichtig auf den Kolben, bis die Hälfte des Kollagenstabs in der Paraformaldehydlösung hängt.

Ziehen Sie dann den Kolben zurück, um den Kollagenstab wieder nach oben in die Kapillare zu bringen. Entfernen Sie die Kapillare aus dem Röhrchen und entsorgen Sie das Paraformaldehyd. Setzen Sie die Kapillare in ein frisches Röhrchen ein und fügen Sie einen Milliliter PBS hinzu.

Stellen Sie sicher, dass die Kapillare in das PBS eingetaucht ist. Drücken Sie vorsichtig auf den Kolben, bis die Hälfte des Kollagenstabs in der Lösung hängt, und inkubieren Sie fünf Minuten lang. Ziehe den Kolben zurück, um den Kollagenstab in der Kapillare aufzunehmen.

Ersetzen Sie dann das PBS durch frisches PBS und stoßen Sie den Kollagenstab in die Lösung aus. Nach der dritten Wäsche geben Sie ein bis zwei Milliliter blockierenden Permeabilisierungspuffer in die Tube. Stoßen Sie den Kollagenstab in die Lösung aus und inkubieren Sie das Röhrchen 30 bis 60 Minuten lang bei Raumtemperatur.

Ersetzen Sie den blockierenden Permeabilisierungspuffer durch 200 bis 500 Mikroliter Primärantikörper im blockierenden Permeabilisierungspuffer und inkubieren Sie den eingetauchten Kollagenstab eine Stunde lang in der Lösung. Nachdem Sie den Kollagenstab dreimal mit PBST gewaschen haben, inkubieren Sie den Stab in Sekundärantikörpern in blockierendem Permeabilisierungspuffer bei Raumtemperatur für eine Stunde. Nach drei weiteren Waschgängen in PBS ziehen Sie den Kollagenstab zurück in die Kapillare und bewahren Sie die Probe bis zur Bildgebung in PBS auf.

Wie in diesem Film zu sehen ist, bildeten CTL-Zellen, die mit einem EGFP-Aktin-Fusionsprotein transfiziert wurden, während der Migration zitronenförmige Hauptvorsprünge, die von feinen spindelartigen Strukturen gesäumt sind. Die Trajektorien von CTLs werden hier mit Geschwindigkeit und Persistenz oder der Verschiebung dividiert durch die Gesamtgleislänge als gemessene Parameter dargestellt. Die Geschwindigkeiten reichen von 0,01 bis 0,19 Mikrometer pro Sekunde mit einer fast 20-fachen Differenz und die Persistenz reicht von null bis 0,7.

Diese Abbildung zeigt fixierte CTL-Zellen in 3D-Kollagengel, die mit endogenem Perforin-1 und Aktin gefärbt sind. Die Probe wurde von einer Seite oder von beiden Seiten beleuchtet. Von verschiedenen Z-Positionen aus werden die Zellen gleichmäßig gefärbt, was auf eine gute Penetration von Antikörpern in die Kollagengele hinweist.

Fixierte CTL wiesen die gleiche Morphologie auf wie lebende Zellen, was darauf hindeutet, dass die Morphologie mit diesem Protokoll gut erhalten bleibt. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es sehr wichtig, daran zu denken, Luftblasen zu vermeiden und den pH-Wert richtig einzustellen. Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden wie die Lebendzellfärbung mit bestimmten Oberflächenmolekülen durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, wie z.B. die Korrelation des Zellverhaltens mit der Differenzierung oder mit verschiedenen Zellsubtypen oder die Untersuchung der Zell-Zell-Interaktion und des Zellschicksals.

Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Zellbiologie, Immunologie und Krebsforschung, um das Zellverhalten, das Zellschicksal, die Differenzierung und die Zellinteraktion in dem physiologisch relevantesten System in vitro zu erforschen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Proben mit Zellen vorbereitet, die in eine dreidimensionale Kollagenmatrix eingebettet sind, wie man Proben mit Hilfe der Lichtblattmikroskopie visualisiert, entweder live oder fixiert, und wie man die Zellmigration in 3D verfolgt.