Die Photokonversionstechnik zur Erforschung der Dynamik von Entzündungszellen in Insektenpuppen

Beginnen Sie mit einer Schale mit Glasboden, die transgene Drosophila-Puppen enthält, die markiertes verwundetes Epithel tragen, deren Zelloberflächenproteine grüne Fluoreszenz aufweisen.

Die Immunzellen der Puppen – oder Hämozyten – exprimieren photokonvertierbare grüne Fluorophore im Zytoplasma und rot fluoreszierende Proteine im Zellkern, was die Zellverfolgung erleichtert.

Die verwundeten Zellen setzen Chemolockstoffe – oder Entzündungsmoleküle – frei, die die Hämozyten an die verwundete Stelle locken.

Die konfokale Mikroskopie zeigt den verwundeten Bereich, der von grünen Epithelzellen umgeben ist.

Während der Heilung verlängern grüne Hämozyten mit roten Kernen in der Nähe der Wunde die Membranvorsprünge – Filopodien und Lamellipodien – und wandern in Richtung des verwundeten Bereichs.

Im Laufe der Zeit, wenn der Chemolockstoff diffundiert, wandern entfernte Hämozyten in Richtung Wunde und erzeugen eine Immunzellwelle.

Beleuchten Sie die Subpopulation der wandernden Hämozyten mit einer Wellenlänge von 405 Nanometern. Dadurch wird das photokonvertierbare Fluorophor der Hämozyten irreversibel von grün nach rot umgewandelt.

Diese photokonvertierten Hämozyten reparieren das verwundete Epithel und bewegen sich von der Wundstelle weg, wodurch die photokonvertierten Hämozyten von den nicht photokonvertierten Hämozyten unterschieden und die Dynamik der entzündlichen Zellen aufgeklärt wird.

Nachdem Sie die Pupillenflügelränder verwunden haben, übertragen Sie die Glasbodenschale schnell in ein geeignetes Mikroskop für die Zeitrafferaufnahme. Öffnen Sie dann die entsprechende Bildaufnahmesoftware.

Schalten Sie in der Software die entsprechenden Laser ein und passen Sie deren Leistung und Verstärkungsversatz an, um ein ausreichendes Fluoreszenzsignal ohne Pixelsättigung zu erhalten. Im Allgemeinen funktioniert die geringstmögliche Laserleistung im Bereich von 5 % bis 20 % am besten, um Photobleaching zu minimieren.

Fokussieren Sie sich bei geringer Vergrößerung auf den gesamten Pupillenflügel oder bei starker Vergrößerung auf die Wunde, um die Wundheilung zu untersuchen. Um sowohl das reparierende Epithel als auch die Rekrutierung von Entzündungszellen zu erfassen, stellen Sie das Mikroskop zunächst so ein, dass es mit der Feinfokuseinstellung auf dem Bedienfeld einen Z-Stapel aufzeichnet. Scannen Sie vom verwundeten Epithel bis zum extrazellulären Raum darunter, der wandernde Hämozyten enthält.

Stellen Sie als Nächstes die Software so ein, dass Z-Scheiben durch den Pupillenflügel alle 3 Mikrometer oder in noch engeren Abständen aufgezeichnet werden. Zeichnen Sie für die Zeitraffer-Bildgebung Z-Stacks mindestens alle 30 Sekunden für mindestens eine Stunde auf.

Wenn Sie die fotokonvertierbaren Sonden verwenden, um eine Teilmenge von Zellen während der Bildgebung selektiv zu photokonvertieren und zu markieren, öffnen Sie die entsprechenden Module in der Bildgebungssoftware, um die Fotokonvertierung durchzuführen und den 405-Nanometer-Laser zu aktivieren. Wählen Sie dann die Zellen aus, die in der FRAP-Software mit einem Auswahlwerkzeug fotokonvertiert werden sollen.

Legen Sie als Nächstes den Zeitverlauf für die Fotokonvertierung auf einen einzelnen Iterationsframe fest, stellen Sie den 405-Nanometer-Laser auf 20 % Laserleistung ein und klicken Sie dann auf Experiment starten, um die Fotokonvertierung durchzuführen. Beenden Sie nach Abschluss des Vorgangs das FRAP-Modul und kehren Sie zum ursprünglichen Bildbildschirm zurück. Dort stimmen Sie die Laser auf die verwendeten Fluorophore ab und bilden die photokonvertierten und nicht photokonvertierten Zellen mit Zeitrafferaufnahmen ab.