Mesoscopic Fluoreszenz-Tomographie für In-vivo Imaging der Entwicklungsländer Drosophila

Um die Rekonstruktionen der sich entwickelnden Organe innerhalb der Drosophila melanogaster durchführen zu können, müssen wir das Vorwärtsmodell bestimmen, das die Ausbreitung des Lichts in der Puppe selbst am besten beschreibt. Das Verfahren beginnt mit der Auswahl einer weißen Präpuppe und dem Aufkleben an das Ende einer Kapillarröhre, so dass die vordere hintere Achse der Poppa parallel zur Röhre ausgerichtet ist. Ein kleines Kapillarröhrchen wird mit etwas Fluoreszenzfarbstoff gefüllt und in das Pupillengehäuse eingesetzt.

Nach sorgfältiger Achsenverstellung wird die Puppe um 360 Grad gedreht. Bilder werden aus verschiedenen Winkeln aufgenommen. Die erfassten Fluoreszenz-Trans-Beleuchtungsdaten werden verwendet, um das Vorwärtsmodell zu bestimmen, das zur Abbildung der Organentwicklung verwendet wird.

Hallo, mein Name ist Claudia und ich bin am Center for Assistance Biology am Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School. Ich bin Ula Petou vom Paramount Lab an der Harvard Medical School, und ich bin Daniel Rozanski vom Institut für Biologische und Medizinische Bildgebung an der Technischen Universität München und dem Heliman Center München. Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur dreidimensionalen Rekonstruktion des ganzen Körpers in Oph Melano Casta.

Wir verwenden dieses Verfahren in unserem Labor zur in vivo Visualisierung der Entwicklung der Organe während des Pupillenstatus. Fangen wir also an, bevor wir beginnen. Bitte beachten Sie, dass es kein begleitendes Video gibt, das Sie sich vorher ansehen sollten, in dem einige technische Aspekte der optischen Projektionstomographie ausführlicher erläutert werden als hier.

Darüber hinaus erklärt das andere Video die Bildgebung von präparierten Geweben oder Organen größerer Tiere. Für alle Experimente, die in diesem Video behandelt werden, werden Forge-Drosophila-Transgene verwendet. Es handelt sich um EL A gal four, das in den Speicheldrüsen exprimiert wird, apteris gal four, das in den Larvenvorläufergeweben des adulten Flügels und Thorax exprimiert wird, das Transgen, das fluoreszierendes Protein herstellt.

Als Reaktion auf Gal 4 mit der Bezeichnung U-A-S-G-F-P und weißem 1118 werden die nicht fluoreszierenden Kontrollmännchen, die die UAS-Transgene tragen, mit jungfräulichen Weibchen gekreuzt, die die GAL 4-Transgene tragen, um Gewebe zu erhalten. Die spezifische Expression von GFP-Kreuzungen erfolgt von acht bis 10 jungfräulichen Weibchen und Männchen auf Standard-Fliegenmedien mit einer Prise Backhefe. An der Oberfläche werden die Fläschchen bei 25 Grad Celsius in einem befeuchteten Inkubator unter einem 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus gelagert.

Zwei Tage nach der Initiation der Kreuzung werden die Eltern in ein frisches Fläschchen umgefüllt und fünf bis sechs Tage später beginnt PUI mit dem Befüllen des weißen PrepU mit dem Befüllen des Fläschchens. I sind für die GFP-Expression unter einem Fluoreszenz-Präparierskop ausgewählt. Die Auswahl der weißen Pre Pui sorgt für eine korrekte Inszenierung der Tiere, da sie etwa eine Stunde lang weiß bleiben.

Nach der Pupille werden sie dann pigmentiert oder bräunlich. GFP-exprimierende Pui werden vorsichtig mit einem feuchten Pinsel aus den Fläschchen gesammelt und in einen Tropfen Wasser oder PBS in eine Petrischale gegeben, die von autofluoreszierenden Materialien gereinigt werden muss. Mit dem Pinsel sollten sie nun bereit für die tomographische Bildgebung sein.

Wenn die PrepU I weiter altern müssen, um das richtige Entwicklungsstadium zu erreichen, können sie in einer Petrischale mit einem feuchten Papiertuch oder in einem sauberen Lebensmittelfläschchen aufbewahrt werden. Dies gewährleistet eine ausreichende Luftfeuchtigkeit und eine ordnungsgemäße Entwicklung für die Bildgebung. Das PrepU muss auf das Innere eines Glaskapillarrohrs mit einem Durchmesser von 800 Mikrometern geklebt werden.

Malen Sie das hintere Ende der Pupille mit Sekundenkleber und richten Sie die geklebte Oberfläche der Vorpuppe so in die Röhre ein, dass der vordere hintere Zugang der Fliege parallel zur Röhre ist. Der vordere Teil des Tieres wird über die Kapillarröhre hinausragen. Das Kapillarrohr wird nun auf dem Rotationstisch des Mikroskops fixiert.

Stellen Sie in einer vertikalen Position die Kippachse des Rotationstisches so ein, dass die Rotationsachse des Tubus parallel zu den Pixelspalten des Bildgebungs-CCD ist. Nachdem Sie die Position der Fliege angepasst haben, fahren Sie mit der Bildgebung fort. In diesem Beispiel sollen Tiere mit fluoreszierenden Speicheldrüsen so abgebildet werden, dass oph die Expression von GFP in ihren Speicheldrüsen aus einer Kreuzung zwischen EAG vier und U-A-S-G-F-P Stämmen erzeugt werden kann.

Wir beginnen mit einer montierten Vorpuppe, beleuchten die Vorpuppe mit einem Anregungsstrahl und sammeln das GFP-Fluoreszenzsignal. Drehen Sie den PrepU bei der Durchleuchtung um 360 Grad entlang seiner vertikalen Achse und nehmen Sie die Durchleuchtungsbilder auf. Jedes Bild entspricht einer Drehung von 10 Grad.

Die Gesamterfassungszeit hängt von der Menge der Fluoreszenz und von der Intensität des Anregungsstrahls ab. Typische Zeiten liegen in der Größenordnung von einer Minute. In diesem Beispiel wird eine DSO-Puppe abgebildet, die GFP in den Flügel-Imaginalscheiben exprimiert.

Diese Puppe kann aus einem Fläschchen mit einer Kreuzung zwischen Aus GAL Four und U-A-S-G-F-P Aktien entnommen werden. Die Vorpuppe wird wie zuvor beschrieben montiert. Da die Bildgebungszeit für dieses Experiment jedoch etwa acht Stunden beträgt, ist es entscheidend, dass die Umgebung feucht und bei Raumtemperatur bleibt. Um Dehydrierung und Tod des Tieres zu vermeiden, wird ein Verschluss über dem Anregungsstrahl platziert, um das Löschen von Blütenvieren im interessierenden Gewebe zu verhindern und sicherzustellen, dass das Tier nicht wie zuvor durch den Laserstrahl verbrannt wird. mit dem Anregungsstrahl beleuchten und das GFP-Fluoreszenzsignal durch Trans-Beleuchtung erfassen.

Die Vorpuppe wird komplett um ihre vertikale Achse gedreht. Während der Datenerfassung dauert die Drehung nur eine Minute und wird in unterschiedlichen Zeitintervallen wiederholt. Um eine Zeitraffer-Serie von Bildern der Flügel während der Entwicklung zu erstellen, können Daten für mindestens sechs Stunden mit einer Rate von 100 Bildern pro Stunde aufgenommen werden.

Es ist wichtig, dass die Gesamtbelichtung mit diesem Verschluss gesteuert wird, um Schäden oder Photobleaching zu vermeiden. Dieser Film zeigt Bilder, die zwischen der PrepU-Phase und der Pupillenkopfaversion aufgenommen wurden. Bei der Rekonstruktion des dreidimensionalen Bildes gibt es eine starke Vorwärtsstreuung, die berücksichtigt werden muss und die durch Diffusion nicht approximiert werden kann.

Um die Rekonstruktion zu einem Vorwärtsstreumodell der Lichtausbreitung zu machen, muss also bestimmt werden. Der Einfachheit halber vernachlässigen wir die Absorption. Das Ausmaß der Streuung wird experimentell getestet. Zu diesem Zweck wird ein Fremdkörper mit standardisierter Fluoreszenz in die nicht fluoreszierende weiße 1118-Vorpuppe eingeführt, die dann gescannt wird, um die Vorwärtsmodelldaten zu generieren und zunächst ein 100-Mikron-Siliziumdioxid-Kapillarrohr mit dem Fluoreszenzfarbstoff PS 5.5 zu füllen.

Schieben Sie das Kapillarrohr mit Kapillarwirkung in einem Winkel von 45 Grad zur Vorderachse in die Puppe, montieren Sie das PrepU in einem Kapillarrohr und positionieren Sie es wie zuvor beschrieben entsprechend auf dem rotierenden Tisch. Beleuchten Sie nun die Vorpuppe mit einem Anregungslaserstrahl mit einer Linse mit niedriger numerischer Apertur und sammeln Sie fluoreszierende Transbeleuchtungsbilder der Vorpuppe. Wie bereits beschrieben, wird die MATLAB-Software verwendet, um die Daten in das explizite theoretische Vorwärtsmodell einzupassen. Um den Rekonstruktionsprozess zu erleichtern, wird die feste e Annäherung an die Transportgleichung gewählt, da sie das Vorwärtsstreuregime beschreibt und auch die experimentellen Daten anpasst.

Nachdem wir das richtige Vorwärtsmodell bestimmt haben, können wir die Speicheldrüsen rekonstruieren und die tomographischen Rekonstruktionen im Zeitraffer erhalten. Wenn Sie den Einsatz einer Freiraumtomographie planen, können auch Konfigurationsalgorithmen für den Indexabgleich eingerichtet werden. Zunächst zeigen wir eine 3D-Rekonstruktion der Speicheldrüsen in einem frühen Entwicklungsstadium.

Zum Vergleich zeigt die histologische Färbung der Speicheldrüsen, dass die Rekonstruktionen gut mit der Histologie korrelieren. Dieser Zeitrafferfilm der Entwicklung der Flügel-Imaginalscheiben wurde von einem einzigen lebenden Exemplar aufgenommen. Zum Vergleich zeigt die histologische Färbung der Flügelscheibe zu gleichen Zeitpunkten, dass die Rekonstruktionen gut mit der Histologie korrelieren.

Wir haben Ihnen gerade gezeigt, wie Sie ein System bauen, um dreidimensionale Strukturen innerhalb von oph in vivo und im Zeitverlauf abzubilden. Dies ermöglicht es, uns, die Morphogenese bei Drosophila, und die Entwicklung der Flügel über sechs aufeinanderfolgende Stunden zu verfolgen. Bei diesem Verfahren ist es entscheidend, das richtige Vorwärtsmodell für die Lichtausbreitung innerhalb von Drosophila zu wählen.

Diese Methode kann in Kombination mit histologischen Techniken verwendet werden, um Licht in die Organentwicklung während der oph-Pupillenstadien zu bringen, und sie kann für die Untersuchung verschiedener Organismen ähnlicher Größe modifiziert werden. Das war's also. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.