Name: Mesoscopic Fluoreszenz-Tomographie für In-vivo Imaging der Entwicklungsländer Drosophila /em (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-08-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 51 s
Description: Lernen Sie mesoskopische Fluoreszenz-Tomographie zur 3D-Bildgebung von Organentwicklung in Drosophila melanogaster. Diese Methode ermöglicht tiefere Einblicke als konventionelle Mikroskopie.

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C. Vinegoni dankt für die Unterstützung von National Institutes of Health (NIH) gewähren 1-RO1-EB006432.

Die Drosophila melanogaster Aktien in diesem Experiment verwendet, sind folgende: <ul style="list-style-type:none;"><li> Elav-Gal4 (FBti0002575) </li><li> ap-Gal4md544 (FBal0051787) </li><li> UAS-srcEGFP (FBti0013990) </li><li> w1118 (FBal0018186) </li></ul> Für alle Versuche wurde die UAS-Gal4-System zu überexprimieren GFP in das Gewebe von Interesse (dh der Speicheldrüsen oder der Flügel-Discs) verwendet. Genauer gesagt wurden weibliche Fliegen transgenen mit der entsprechenden Gal4 zu UAS-EGFP transgenen Kameraden gekreuzt. Die Kreuze wurden bei 25 ° C in einem befeuchteten Inkubator aufgezogen. Wenn Puppen bevölkern die Fläschchen (ca. 5-6 Tage nach Beginn des Kreuzes) zu starten, wurden sie für GFP-Fluoreszenz auf die weiße prepupal Bühne (0-1 Stunden nach Puparium Bildung) ausgewählt und gesammelt für Tomographie. <ol><li> Richten Sie geeignete Kreuzungen und hinten bei 25 ° C </li><li> 5-6 Tage nach der Einweihung des Kreuzes, wählen fluoreszierenden Nachkommen für die Bildgebung. Verwenden Sie einen feuchten Pinsel für die schonende Entfernung der weißen prepupae von den Seiten des Fläschchens. </li><li> Put prepupae in einem Tropfen Wasser oder PBS in eine Petrischale Speisereste und der Leim, der das Puppenstadium Cover und macht die Probe autofluoreszierenden entfernen. Reinigen Sie mit einem Pinsel. Wenn die Alterung der Puppen ist notwendig, statt weiß prepupae in einer Petrischale mit einem feuchten Papiertuch (einer feuchten Kammer) oder an den Seiten eine saubere Flasche mit fliegen Lebensmittel ausgewählt. Dadurch wird sichergestellt, dass genügend Feuchtigkeit, um die ordnungsgemäße Entwicklung des Tieres zu ermöglichen. </li></ol> Drosophila Montage <ol><li> Kleben Sie den unteren Teil der Puppenhülle in eine Glaskapillare (800 Mikrometer Durchmesser), so dass die Fliege anterior / posterior Achse parallel zur Röhre. </li><li> Fix die Kapillare vertikal auf einem Rotations-Bühne. </li><li> Passen Sie die Kippachse des Rotations-Bühne, um für die Drehachse parallel zu der Pixel-Spalten der bildgebenden CCD. </li></ol> Bestimmung Vorwärts-Modell <ol><li> Fix eine Puppe in eine Kapillare aus Glas und Montage wie zuvor beschrieben </li><li> Füllen Sie eine Silica-Kapillare (100 Mikron, OD) mit einem fluoreszierenden Farbstoff (Cy5.5) </li><li> Legen Sie die Kapillare im Inneren der Puppe bei 45 Grad in Bezug auf den vorderen / hinteren Achse </li><li> Illuminate die Puppe mit einer Anregung Laserstrahl mit geringer numerischer Apertur Linse. Sammeln Fluoreszenz Transilluminationsbilder über 360 Grad drehbare die Puppe um seine Hochachse. </li><li> Fit der experimentellen Daten mit einem geeigneten Vorwärtsmodell </li></ol> Imaging Speicheldrüsen <ol><li> Montieren Sie eine Puppe, die GFP in den Speicheldrüsen, wie zuvor beschrieben </li><li> Illuminate mit einem Anregungsstrahl und sammeln sich in Durchleuchtung der GFP-Fluoreszenz-Signal über 360 Grad drehbare die Puppe um seine Hochachse. </li><li> Rekonstruieren Sie die erfassten Daten unter Verwendung der Vorwärtsmodell </li></ol> Time-Lapse Imaging <ol><li> Montieren Sie einen weißen Vorpuppe, die GFP in den Flügel Imaginalscheiben </li><li> Halten Sie die Imaging-Umgebung feucht und bei Raumtemperatur, um eine Dehydratation der Puppe zu vermeiden. </li><li> Legen Sie einen Auslöser, um kontinuierliche Beleuchtung zu vermeiden </li><li> Illuminate mit einem Anregungsstrahl und sammeln sich in Durchleuchtung der GFP-Fluoreszenz-Signal über 360 Grad drehbare die Puppe um seine Hochachse. </li><li> Rekonstruieren Sie die erfassten Daten unter Verwendung der nach vorne Modell. </li></ol> Histologie <ol><li> Dissect Speicheldrüsen CNS / Auge-Discs in 1x PBS. </li><li> Fix Gewebe in 4% Formaldehyd, 1x PEM (100mm Rohre, 1 mM EGTA, 1 mM MgCl 2) für 20min bei Raumtemperatur. </li><li> Entfernen Befestigung und montieren in Vectashield mit DAPI (Vector) </li><li> Bild mit einem Fluoreszenzmikroskop. </li></ol> Time-Lapse Histologie <ol><li> Sammeln Sie weiß prepupae und Bühne sie in einer feuchten Kammer. </li><li> Sammeln Puppen in verschiedenen Entwicklungsstadien </li><li> Prick das Puppenstadium Fall zweimal (0 Std. Nach Puparium Formation) mit einer feinen Nadel (Insekten Stift 000, FST) vor der Fixierung. </li><li> Fix Puppen in 8% Formaldehyd, 1x PEM für 6-8 Stunden bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln. </li><li> Nach dem Entfernen der Fixierung und Spülen mit 1x PBS, schneiden Sie die feste Puppe mit einer scharfen Klinge in zwei Teile senkrecht zur A / P-Achse; </li><li> Tauchen Sie die beiden Stücke in Vectashield mit DAPI (Vector) und mounten auf Deckglas Objektträger (Lab-Tek) für die Bildgebung. </li><li> Erwerben Sie Bilder mit einem Fluoreszenz-konfokalen Mikroskop. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1510/1510fig1thumb.jpg" alt="Abbildung 1" border="0" /> Abbildung 1. Bitte <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1510/1510fig1.jpg">klicken Sie hier</a> , um al sehenarger Version von Abbildung 1.

<ol><li>Ntziachristos, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Looking+and+listening+to+light%3A+the+evolution+of+whole-body+photonic+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Looking and listening to light: the evolution of whole-body photonic imaging.</a> Nat. Biotechnol. 23, 313-320 (2005).</li>
<li>J, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+projection+tomography+as+a+tool+for+3D+microscopy+and+gene+expression+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Optical projection tomography as a tool for 3D microscopy and gene expression studies.</a> Science. 296, 541-545 (2002).</li>
<li>Dodt, H. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultramicroscopy%3A+three-dimensional+visualization+of+neuronal+networks+in+the+whole+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain.</a> Nat. Methods. 4, 331-336 (2007).</li>
<li>Vinegoni, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+Drosophila+melanogaster+pupae+with+mesoscopic+fluorescence+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of Drosophila melanogaster pupae with mesoscopic fluorescence tomography.</a> Nat. Methods. 5, 45-47 (2008).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

In-vivo-Rekonstruktionen der Puppenhülle und die GFP-exprimierenden Speicheldrüsen der D. melanogaster Vorpuppe (Scale bar, 500 Mikron) mit den entsprechenden Histologie (blau, DAPI-Färbung, grün, GFP-Fluoreszenz) ist in Abb. 1 (a) gezeigt. Zeitraffer-Serie Abbildung von D. melanogaster Flügel Imaginalscheiben ist in Abb. 1 (b) gezeigt. Die Bilder sind aus einem einzigen lebenden Exemplars erworben, an vier verschiedenen Zeitpunkten (0,3.0, 3,5 und 6,5 Stunden). In der ersten Spalte einer Projektion be...

mesoscopic fluoreszenz-tomographie für in-vivo imaging der entwicklungsländer drosophila</em

Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila

Visualisierung der Entwicklung Organbildung sowie Progression und Behandlung von Krankheiten oft in hohem Maße von der Fähigkeit, optisch verhören molekulare und funktionelle Veränderungen in intakten lebenden Organismen. Die meisten existierenden Verfahren der optischen Bildgebung sind unzureichend für die Bildgebung bei Dimensionen, die zwischen dem Eindringen Grenzen der modernen Lichtmikroskopie (0,5-1mm) und die Verbreitung auferlegten Grenzen der optischen Makroskopie liegen (&gt; 1cm) [1]. So viele wichtige Modellorganismen, zB Insekten-, Tier-Embryonen oder Kleintier Extremitäten, bleiben unzugänglich für in-vivo optische Bildgebung. Zwar gibt es zunehmendes Interesse an der Entwicklung von Nanometer-Auflösung optische bildgebende Verfahren gibt es nicht viele erfolgreiche Anstrengungen bei der Verbesserung der bildgebenden Eindringtiefe worden. Die Fähigkeit zur in-vivo-Bildgebung über Mikroskopie Grenzen durchzuführen, ist in der Tat mit den Schwierigkeiten mit Photonenstreuung im Gewebe verbunden erfüllt. Die jüngsten Bemühungen zur Bild gesamten Embryos zum Beispiel [2,3] erfordern spezielle chemische Behandlung der Probe, um sie von Streuung klar, ein Verfahren, das sie sich nur für Post-mortem-Bildgebung ermöglicht. Diese Methoden jedoch Beweise, dass für die Bildgebung größere Exemplare als die, die in der Regel durch Zwei-Photonen-oder konfokalen Mikroskopie, vor allem in der Entwicklungsbiologie und in der Wirkstoffforschung erlaubt. Wir haben einen neuen optischen Bildgebungsverfahren namens Mesoscopic Fluoreszenz-Tomographie entwickelt [4], die geeignet für non-invasive In-vivo-Bildgebung bei Abmessungen von 1mm-5mm. Die Methode Austausch Auflösung für Eindringtiefe, sondern bietet eine beispiellose tomographischen Imaging-Leistung und es wurde entwickelt, um die Zeit als neue Dimension in der Entwicklungsbiologie Beobachtungen (und möglicherweise auch in anderen Bereichen der biologischen Forschung) hinzufügen, indem Sie die Vermittlung der Fähigkeit zur Abbildung der Entwicklung der Fluoreszenz- getaggt Reaktionen im Laufe der Zeit. Als solche kann sie beschleunigen Studien der morphologischen oder funktionellen Abhängigkeiten von Gen-Mutationen oder äußere Reize und können wichtiger ist, fangen die vollständigen Überblick über die Entwicklung oder die Gewebe-Funktion, indem sie Längs-Zeitraffer-Visualisierung der gleichen, sich entwickelnden Organismus. Die Technik nutzt eine modifizierte Labormikroskop und Multi-Projektion Beleuchtung, Daten mit 360-Grad-Projektionen zu sammeln. Es gilt das Fermi Vereinfachung Fokker-Plank-Lösung des Photons Transport Gleichung, mit der geometrischen Optik Prinzipien kombiniert, um eine realistische Inversionsschema für mesoskopischen Bereich zu bauen. Dies ermöglicht in-vivo Ganzkörper-Visualisierung von nicht-transparenten dreidimensionale Strukturen in Proben bis zu einigen Millimetern Größe. Wir haben die in-vivo-Leistung der Technik durch bildgebende dreidimensionale Strukturen gezeigt, die Entwicklung Drosophila Gewebe in-vivo und nach der Morphogenese der Flügel in der undurchsichtigen Drosophila Puppen in Echtzeit über sechs Stunden hintereinander.

Mesoscopic Fluoreszenz-Tomographie arbeitet darüber hinaus das Eindringen Grenzen der Gewebe-Schnitte Fluoreszenzmikroskopie. Die Technik basiert auf Multi-Projektion Beleuchtung und ein Photon Transport Beschreibung basiert. Wir zeigen in-vivo Ganzkörper-3D-Visualisierung der Morphogenese von GFP-exprimierenden Flügel Imaginalscheiben in<em&gt; Drosophila melanogaster.</em

Mesoscopic Fluoreszenz-Tomographie für In-vivo Imaging der Entwicklungsländer Drosophila</em

Die Visualisierung der Bildung sich entwickelnder Organe sowie des Verlaufs und der Behandlung von Krankheiten beruht häufig maßgeblich auf der Fähigkeit, optische Untersuchungen von ... durchzuführen

Um die Rekonstruktionen sich entwickelnder Organe innerhalb der Drosophila melanogaster durchzuführen, müssen wir das Vorwärtsmodell bestimmen, das die Lichtausbreitung innerhalb der Puppe am besten beschreibt. Das Verfahren beginnt damit, eine weiße Vorpuppe auszuwählen und sie am Ende eines Kapillarrohrs so anzukleben, dass die anteriore-posteriore Achse der Puppe parallel zur Röhre ausgerichtet ist. Ein dünnes Kapillarrohr wird mit etwas fluoreszierendem Farbstoff gefüllt und in das Puppengehäuse eingeführt.Nach sorgfältiger Achsenanpassung wird die Puppe um 360 Grad gedreht. Bilder werden aus verschiedenen Winkeln aufgenommen. Die gewonnenen fluoreszierenden Durchlichtdaten werden verwendet, um das Vorwärtsmodell zu bestimmen, das zur Abbildung der Organentwicklung eingesetzt wird.Hallo, mein Name ist Claudia und ich befinde mich am Zentrum für Assistierte Biologie im Massachusetts General Hospital der Harvard Medical School. Ich bin Ula Petou aus dem Paramount-Labor der Harvard Medical School, und ich bin Daniel Rozanski vom Institut für Biologische und Medizinische Bildgebung an der Technischen Universität München und dem Helmholtz-Zentrum München. Heute zeigen wir Ihnen ein

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Forschung

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Biology

Biologie

Drosophila Blutzellen über die Gesamtheit des sich entwickelnden Embryos zu zerstreuen. Dieses Protokoll zeigt, wie die Montage und Bild dieser Migrationen Verwendung von Embryonen mit fluoreszenzmarkierten Blutzellen.

Live-Bildgebung Drosophila melanogaster Embryonale Hemocyte Migrationen

Quelle: Hellerman, M. B.B.. , et al. Live-Imaging des Drosophila J. Vis. Exp. (2015){TAG_ 28}}Das Video zeigt eine Live-Imaging-Technik zur Untersuchung der Augenmusterung bei einer Drosophila melanogaster-Puppe. Grün fluoreszierendes Protein (GFP)-markierte Marker ermöglichen die Visualisierung der zellulären Organisation und Differenzierung während der Bildung der sich entwickelnden Augenstruktur.

Live-Bildgebung des Drosophila-Puppenauges mittels Fluoreszenzmikroskopie

Die Tomate / GFP-FLP / FRT Verfahren beinhaltet die Visualisierung Mosaik Photorezeptorzellen in lebenden Drosophila. Es kann benutzt werden, um einzelne Schicksale Photorezeptorzelle in der Netzhaut für Tage oder Wochen folgen werden. Diese Methode ist ideal für die Untersuchung der Netzhautdegeneration und neurodegenerative Erkrankungen oder Photorezeptorzelle Entwicklung.

Die Tomate / GFP-FLP / FRT Verfahren zur Live-Imaging von Mosaic Erwachsene<em&gt; Drosophila</em&gt; Sehzellen

Dieses Papier zeigt die Verwendung eines schnellen konfokalen Mikroskop, um Bildzelle Verhalten direkt durch die Puppenhülle. Nach dem Verlassen der Puppenhülle intakt ist, erlaubt dieses Verfahren die Beobachtung und Messung von dynamischen Zellprozesse im Stadium der Drosophila-Entwicklung, die schwer direkt zu studieren.

Imaging Durch die Puppenhülle von<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Immunfärbung ist eine effektive Technik zur Visualisierung spezifischer Zelltypen und Proteine innerhalb von Geweben. Durch die Verwendung von Ultraschall verringert das hier beschriebene Protokoll die Notwendigkeit, Drosophila melanogaster-Gewebe von Embryonen und Larven im Spätstadium vor der Immunfärbung zu präparieren. Wir bieten eine effiziente Methodik für die Immunfärbung von Formaldehyd-fixierten Whole-Mount-Larven.

Beschallung-erleichtert Immunfluoreszenzfärbungen der Late-Stage embryonalen und Larven<em&gt; Drosophila</em&gt; Gewebe<em&gt; In-situ</em

Dieses Protokoll stellt eine effiziente Methode zur Bildgebung des lebenden Neuroepithels des Puppenaugen von Drosophila dar. Diese Methode kompensiert Gewebebewegungen und ungleichmäßige Topologie, verbessert die Visualisierung von Zellgrenzen durch die Verwendung mehrerer GFP-markierter Verbindungsproteine und verwendet ein einfach zu montierendes Bildgebungsgerät.

Live-Bilder aus dem Drosophila Pupal Augen

Dieses Protokoll beschreibt ein detailliertes Verfahren für die langfristigen ex vivo Kultur und die Bildgebung eines Imaginalscheibe Drosophila. Es zeigt Photorezeptordifferenzierung und Ommatidienrotation innerhalb der 10 Stunden Periode von Live-Aufnahmen des Auges Scheibe. Das Protokoll ist einfach und erfordert keine teure Einrichtung erforderlich.

Langfristige Live-Imaging von<em&gt; Drosophila</em&gt; Augen Disc

Hier zeigen wir wie Einzelmolekül Foto aktiviert Lokalisierung Mikroskopie auf dem motorischen Nerv-Terminal von einem live Drosophila Melanogaster erfolgen kann Dritte instar Larve.

In Vivo Einzelmolekül-Tracking bei Drosophila präsynaptischen motorischen Nerv Terminal

Es wird ein Protokoll vorgestellt, das die Visualisierung intakter Drosophila melanogaster in jedem Entwicklungsstadium mittels Mikrocomputed Tomographie ermöglicht.

Ganztierbildgebung von Drosophila melanogaster mittels Mikrocomputed Tomographie

Im frühen Drosophila-Embryo sind viele Organellen beweglich. Im Prinzip können sie über spezifische fluoreszierende Sonden lebend abgebildet werden, aber die Eierschale verhindert eine direkte Anwendung auf den Embryo. Dieses Protokoll beschreibt, wie solche Sonden durch Mikroinjektion eingeführt und dann die Bewegung der Massenorganelle über die Teilchenbild-Velocimetrie analysiert werden.

Visualisierung des zytoskelettabhängigen Handels von lipidhaltigen Organellen in Drosophila-Embryonen

Hier werden nicht-invasive Methoden zur Lokalisation von Photorezeptormembranproteinen und zur Beurteilung der Netzhautdegeneration im Drosophila-Facettenauge mittels eGFP-Fluoreszenz beschrieben.

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