Quantitative durchflusszytometrische Messung der Pilzsporen-Phagozytose durch humane Phagozyten

Nehmen Sie eine Multiwell-Platte, die eine humane Leukozytensuspension enthält. Fügen Sie FITC-markierte pathogene Pilzsporen hinzu.

Während der Inkubation schwellen die Sporen auf und brechen ihre starre hydrophobe Proteinschicht auf, wodurch die Zellwandpolysaccharide freigelegt werden, die von spezifischen Mustererkennungsrezeptoren auf phagozytischen Zellen erkannt werden.

Diese Bindung löst intrazelluläre Signalwege aus, die zu einer Aktin-Umlagerung und Sporeninternalisierung in Phagosomen führen.

Je nach Aktivierungszustand der Fresszellen bleiben einige Sporen ohne Internalisierung an den Zellen haften.

Ernten Sie die Zellen nach der Inkubation und überführen Sie sie in ein frisches Röhrchen.

Zentrifuge. Resuspendieren Sie die Zellen in einem Puffer und überführen Sie sie auf eine Multi-Well-V-Bodenplatte.

Führen Sie fluorophormarkierte Anti-FITC-Antikörper ein, die an die exponierten FITC-Moleküle auf anhaftenden Sporen binden und diese gegenfärben.

Zentrifuge. Resuspendieren Sie die Zellen in einem Puffer und überführen Sie sie in Durchflusszytometerröhrchen.

Führen Sie eine Durchflusszytometrie durch, um zwischen internalisierten und zelladhärenten Sporen zu unterscheiden.

Phagozyten, die internalisierte Sporen enthalten, zeigen FITC-Signale, während Zellen mit adhärenten Sporen FITC- und Gegenfärbesignale aufweisen.

Zu Beginn werden 2 Millionen Leukozyten und 4 Millionen FITC-markierte Konidien in 1,5 Millilitern RPMI, ergänzt mit 10 % FCS, auf eine 12-Well-Kulturplatte übertragen. Schließen Sie eine Kontrolle nur von Zellen ohne Konidien und eine Kontrolle von Zellen mit unmarkierten Konidien ein. Inkubieren Sie die Platte in einem befeuchteten Kohlendioxid-Inkubator bei 37 Grad Celsius für die gewünschte Zeit. Wenn die Inkubation abgeschlossen ist, verwenden Sie einen Zellschaber, um die Zellen zu ernten, und geben Sie sie in ein 15-Milliliter-Röhrchen.

Geben Sie zunächst 100 Mikroliter jeder Probe und Kontrolle in eine Vertiefung einer 96-Well-V-Bodenplatte. Fügen Sie zum Waschen 150 Mikroliter PBS mit 2 Millimolar EDTA hinzu. Platzieren Sie zur Farbkompensation 1 Million Zellen ohne Konidien für jede Farbe in anderen Vertiefungen der Platte. Fügen Sie eine Vertiefung mit Zellen hinzu, die ungespannt bleiben. Geben Sie zum Waschen 150 Mikroliter PBS mit 2 Millimolar EDTA in jede Vertiefung

Anschließend die Platte mit einer Klebefolie abdecken und bei 300 mal g bei Raumtemperatur fünf Minuten zentrifugieren. Entfernen Sie dann die Folie und entsorgen Sie den Überstand, indem Sie die Platte schnell und gewaltsam nur einmal über das Waschbecken oder ein Einweg-Papiertuch umdrehen. Resuspendieren Sie die Zellen in 100 Mikrolitern Antikörpermischung und mischen Sie sie gut durch Pipettieren.

Zur Farbkompensation resuspendieren Sie die jeweiligen Zellen in 100 Mikrolitern PBS, die 2 Millimolar EDTA enthalten, und fügen Sie jeder Vertiefung einen einzelnen Antikörpertyp in der gleichen Menge hinzu, die in der Antikörpermischung verwendet wird. Mit einer Klebefolie abdecken und bei Raumtemperatur im Dunkeln 20 Minuten inkubieren.

Entfernen Sie danach die Folie und geben Sie 150 Mikroliter PBS mit 2 Millimolar EDTA zum Waschen in jede Vertiefung. Decken Sie die Platte wieder mit Klebefolie ab. Zentrifugieren Sie bei 300 g und bei Raumtemperatur fünf Minuten lang, entfernen Sie dann die Folie und entsorgen Sie den Überstand, indem Sie die Platte schnell und kräftig über ein Waschbecken oder ein Einweg-Papiertuch umdrehen. Resuspendieren Sie die Zellen in 200 Mikrolitern PBS, die 2 Millimolar EDTA enthalten, und überführen Sie die Zellsuspension aus jeder Vertiefung in ein separates Röhrchen mit rundem Boden.

Starten Sie das Durchflusszytometer und lassen Sie es aufwärmen. Erstellen Sie in der Erfassungssoftware ein neues Experiment, richten Sie die neuen Proben ein und beschriften Sie sie. Richten Sie die Parameter und die Detektoren für die entsprechenden Fluorophore ein, wie im Textprotokoll beschrieben.

Zeigen Sie in dieser Software die entsprechenden Punktdiagramme an, wie im Textprotokoll beschrieben. Entnehmen Sie mit der reinen Zellprobe einige Zellen und setzen Sie das Tor um die Leukozyten. Basierend auf dem Leukozyten-Gate trennt sich das Gate für CD45-positive Zellen von Konidien im SSC/CD45-Plot. In einem Dot Plot CD14/CD66b gate Neutrophile und Monozyten getrennt.

Wechseln Sie danach von der reinen Zellprobe zu unmarkierten Konidien. In einem Punktdiagramm zeigen Anti-FITC/FITC-Signale Neutrophile an und setzen Quadranten für Anti-FITC- und FITC-Signale. Öffnen Sie die Statistikansicht, und passen Sie die Quadranten so an, dass maximal 1 % der Zellen in den Quadranten Q1, Q2 und Q4 zulässig sind.

Wiederholen Sie diesen Vorgang für das Monozyten-Gate. Erfassen Sie im Leukozyten-Gate alle Proben mit mindestens 20.000 Ereignissen. Die Phagozytose von FITC-markierten Konidien durch humane Neutrophile kann aus den Statistikansichten abgelesen werden.