Eine Immunmarkierungstechnik zur Visualisierung der subzellulären Lokalisierung von Proteinen

Beginnen Sie damit, einen festen Herzabschnitt in einem Natriumcacodylatpuffer zu waschen, der die Gewebestruktur stabilisiert. Tauchen Sie den Abschnitt in Osmiumtetraoxid, um die Membranlipide zu färben.

Mit Natriumacetat behandeln, um einen optimalen pH-Wert für die Färbung aufrechtzuerhalten.

Fügen Sie Uranylacetat hinzu, um Biomoleküle zu färben, um einen besseren Kontrast während der Mikroskopie zu erzielen.

Dehydrieren Sie das Gewebe in steigenden Konzentrationen von Ethanol, gefolgt von Aceton.

Betten Sie das Gewebe in ein Harz ein, erhalten Sie ultradünne Schnitte und übertragen Sie diese auf ein Mikroskopiegitter.

Führen Sie Natriummetaperiodat ein, um das Osmiumtetraoxid zu entfernen und das zelluläre Protein zu demaskieren.

Die Verbindung oxidiert auch Glykoprotein, wodurch reaktive Aldehydgruppen entstehen, die durch die Glycinbehandlung neutralisiert werden.

Führen Sie einen Blockierungspuffer ein, der eine unspezifische Antikörperbindung verhindert.

Es werden primäre Antikörper hinzugefügt, die spezifisch für das Zielprotein sind, gefolgt von biotinylierten Sekundärantikörpern.

Fügen Sie Streptavidin-konjugierte Quantenpunkte hinzu, die an Biotin binden.

Unter dem Elektronenmikroskop weisen Quantenpunkt-markierte Regionen einen höheren Kontrast auf, was eine präzise subzelluläre Lokalisierung des Zielproteins ermöglicht.

Waschen Sie das Gewebe nach 24 Stunden Fixierung zweimal für 20 Minuten in 0,1 molaren Natriumcacodylatpuffer. Entfernen Sie das Gewebe aus dem Natriumcacodylatpuffer und tauchen Sie es 4 Stunden lang bei Raumtemperatur in 2%ige Osmiumtetroxidlösung.

Tauchen Sie das Gewebe nach der Osmikation 10 Minuten lang bei Raumtemperatur in 2%ige Natriumacetatlösung. Tauchen Sie anschließend das Gewebe 1 Stunde lang bei Raumtemperatur in 2%ige Uranylacetatlösung. Nach der Uranylacetat-Färbung dehydrieren Sie das Gewebe nacheinander durch die abgestuften Alkohole und das Aceton.

Betten Sie das dehydrierte Gewebe in niedrigviskoses Epoxidharz ein, wie im Manuskript beschrieben. Geben Sie das Gewebe in frisches Harz in 8-Millimeter-Mikroformen, Formen und härten Sie das eingebettete Gewebe über Nacht bei 70 Grad Celsius aus. Nachdem Sie den interessierenden Bereich mit einem Ultra-45-Grad-Messer gefunden haben, erstellen Sie ultradünne Schnitte aus blassgoldenem Material. Platzieren Sie diese ultradünnen Abschnitte auf der stumpfen Seite eines 200-Mesh-Kupfergitters.

Beginnen Sie die Färbung, indem Sie das Antigen demaskieren, indem Sie 20 Mikroliter Ätzlösung Natriummetaperiodat auf einen sauberen Paraffinfilm geben. Legen Sie das getrocknete Gitter mit den Gewebeschnitten auf das Tröpfchen der Ätzlösung. Lassen Sie das Gitter 30 Minuten bei Raumtemperatur auf der Lösung. Waschen Sie die geätzten Gewebeabschnitte, indem Sie sie 60 Sekunden lang auf einen Tropfen destilliertem Wasser legen.

Blockieren Sie die restlichen Aldehyde, indem Sie das Schnittgitter 10 Minuten lang bei Raumtemperatur auf einen Tropfen 0,05 molare Glycinlösung legen. Tupfen Sie die Ränder des Gitters auf Filterpapier ab, um die restliche Glycinlösung zu entfernen. Legen Sie das Schnittgitter für 25 Minuten bei Raumtemperatur in 10 bis 20 Mikroliter Blocklösung.

Tupfen Sie die Gitterränder auf Filterpapier ab und legen Sie die Gitterabschnitte zur Konditionierung 10 Minuten lang auf Antikörperverdünnungsmittel. Inkubieren Sie die Gitterabschnitte mit dem Primärantikörper für 1 Stunde 30 Minuten in einer befeuchteten Kammer. Tupfen Sie das Gitter trocken und waschen Sie die Gitterabschnitte zweimal für jeweils 5 Minuten mit Antikörperverdünnungsmittel.

Inkubieren Sie die Gitterabschnitte mit biotinylierten Sekundärantikörpern für 1 Stunde in einer befeuchteten Kammer. Sobald das Gitter getupftgetrocknet ist, waschen Sie die Gitterabschnitte zweimal für jeweils 5 Minuten mit Antikörperverdünnungsmittel. Inkubieren Sie die Gitterabschnitte in handelsüblicher Streptavidin-konjugierter QD für 1 Stunde in einer befeuchteten Kammer bei Raumtemperatur. Verhindern Sie Lichteinwirkung, indem Sie die Kammer mit Alufolie abdecken. Nachdem Sie die Gitterränder mit Filterpapier getupft haben, waschen Sie die Gitterabschnitte, indem Sie sie zwei Minuten lang auf Wassertropfen legen, und tupfen Sie die Gitterränder zum Trocknen ab.