Differential Markierung von Zelloberflächen und internalisierten Proteine ​​Antikörper nach Fütterung der Live-kultivierten Neuronen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Proteine auf der Oberfläche lebender Neuronen zu markieren und anschließend mittels differenzieller Sekundärantikörper-Färbung zwischen Oberflächenproteinen und internalisierten Proteinen zu unterscheiden. Dazu werden primäre Neuronen, die auf Deckgläsern kultiviert werden, mit einem Antikörper inkubiert, der gegen ein Oberflächenepitop gerichtet ist, und anschließend unter Bedingungen gehalten, die die Internalisierung ermöglichen. Nach der Inkubation wird ein fluoreszenzmarkierter Sekundärantikörper aufgebracht, um die auf der Oberfläche befindlichen Proteine zu identifizieren.

Anschließend wird ein Überschuss an unmarkiertem sekundärem Antikörper aufgebracht, um verbleibende Komplexe aus primärem Antikörper und Oberflächenprotein zu blockieren. Die kultivierten Neuronen werden dann permeabilisiert, und ein sekundärer Antikörper einer anderen Farbe wird appliziert, um internalisiertes Protein nachzuweisen. Letztendlich können Ergebnisse erhalten werden, die die relativen Mengen an internalisiertem im Vergleich zu Oberflächenprotein mittels Immunfluoreszenzmikroskopie zeigen.

Nach Durchführung dieses Verfahrens kann ein Zeitverlauf der Internalisierung von Oberflächenproteinen der Quelle erhalten werden, der Informationen über die Proteintransportraten unter basalen und stimulierten Bedingungen liefert. Beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie Deckgläser für die Zellkultur vorbereiten: Tragen Sie Polylysin-beschichtete 18-Millimeter-Bohrungsgläser, die am Vortag vorbereitet wurden, indem Sie sie in drei separate Spülschalen mit PBS tauchten. Geben Sie 500 Mikroliter Laminin-Lösung in die Vertiefungen einer 12-Loch-Platte und platzieren Sie dann mit einer Pinzette die Deckgläser in jede Vertiefung. Drücken Sie jedes Deckglas leicht nieder, um sicherzustellen, dass es flach auf dem Boden der Vertiefung aufliegt, und inkubieren Sie zwei Stunden bei 37 Grad Celsius. Dieses Protokoll kann entweder mit E15-Mauskortizes oder mit E18-Ratten-Hippocampi durchgeführt werden.

In dieser Demonstration werden Mauskortizes verwendet. Legen Sie die Kortizes von einem halben Wurf oder einem ganzen Wurf von Embryonen auf Eis in ein Einmalkolben mit einem Volumen von einem Milliliter, der PBS mit Calcium und Magnesium enthält, und stellen Sie ihn auf Eis. Entfernen Sie anschließend mit einer Mikropipette mit einem Volumen von einem Milliliter den PBS von dem kortikalen Gewebe.

Fügen Sie dann 500 µL einer Pappa-DNA-Lösung zu kortikalem Gewebe aus der Hälfte eines Wurfes von Embryonen hinzu. Inkubieren Sie bei 37 °C für 15 bis 20 Minuten. Zwei Mal während der Inkubationszeit vorsichtig das Gefäß leicht anstoßen, um den Inhalt zu mischen. Nach der Inkubation das Gewebe mit einer flammenglasierten, silanisierten Pasteur-Pipette vorsichtig 10 bis 15 Mal umgepumpt, bis eine Zellverteilung erreicht ist.

Es sollten nur wenige oder keine Stücke von nicht dissoziiertem Gewebe verbleiben; vermeiden Sie die Bildung von Blasen. Schichten Sie die dissoziierte Zellsuspension vorsichtig über ein dreimilliliter-Polster aus 4 % BSA in Hank’s BSS mit Zusätzen. Anschließend zentrifugieren Sie in einer Tischzentrifuge mit Schwenkrotor bei 100 × g für sieben Minuten.

Nach dem Zentrifugieren vorsichtig den Überstand entfernen, wobei darauf geachtet werden muss, das Zellpellet nicht abzusaugen. Anschließend ein Milliliter vollständiges neurobasales Medium hinzufügen und vorsichtig auf- und abpipettieren, um die pelletierten Zellen erneut in Suspension zu bringen. Danach mit einem Hämozytometer die Konzentration lebender Zellen bestimmen.

Nur phasenhelle Zellen sollten unmittelbar vor dem Ausplattieren als lebend betrachtet werden. Aspirieren Sie die überschüssige Laminat-Serumlösung von den Deckgläsern in den Vertiefungen und ersetzen Sie sie durch Primärneuronen-Kulturmedium. Geben Sie anschließend 75.000 bis 100.000 Primärneuronen in jede Vertiefung.

Kultivieren Sie die Neuronen bis zu 21 Tage lang in neuronalem Basalmedium bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid. Am siebten Tag und jede Woche danach geben Sie das antimetotische Fluorodeoxyuridin hinzu, um ein Überwachsen durch Gliazellen zu verhindern, und führen Sie einen halben Mediumwechsel durch. Während der ersten Woche in Kultur bilden die Neuronen dendritische Bäumchen aus, wie in diesem Bild einer zwei Tage alten Kultur gezeigt. In der zweiten bis dritten Woche reifen sie aus und durchlaufen die Synaptogenese.

Ein ausgedehntes Netzwerk von Projektionen ist in dieser Abbildung dargestellt, die nach 14 Tagen in vitro angefertigt wurde, um oberflächenexponierte Proteine ​​von Interesse zu markieren. Fügen Sie den Primärantikörper direkt in das konditionierte Medium in der geeigneten Konzentration hinzu. Jede Bedingung sollte im Dreifachansatz getestet werden. Vier Kontrollen, vorgebildetes Serum oder Antikörper, die intrazelluläre Regionen des Proteins erkennen, die während der Exozytose nicht exponiert sind, können in derselben Verdünnung wie der Test-Primärantikörper verwendet werden. Bringen Sie die Zellen nach der Inkubation für eine, zwei oder vier Stunden in den Kulturinkubator zurück, aspirieren Sie das Antikörper enthaltende Medium und waschen Sie die Vertiefungen einmal vorsichtig, aber schnell mit PBS.

Gebe Raumtemperatur hinzu, indem Sie die Lösung in die Vertiefungen geben und anschließend abpipettieren. Dann frisch zubereitete 4 % Paraformaldehyd hinzufügen und fünf Minuten inkubieren. Raumtemperatur hinzufügen, um die Zellen nach der Fixierung zu fixieren.

Entfernen Sie die Paraformaldehydlösung aus den Vertiefungen und entsorgen Sie sie in einem flüssigen Abfallbehälter im Abzug. Spülen Sie die Zellen dann wie zuvor dreimal schnell mit PBS. Lassen Sie die dritte Spülung stehen, damit der Deckglaser leicht entfernt werden kann.

Als Nächstes verwenden Sie eine Pinzette, um die Deckgläser vorsichtig aus der Platte zu entfernen, und legen Sie sie mit der Zellseite nach oben auf ein Stück Parafilm, das auf dem Boden oder Deckel einer Einwegkulturplatte liegt. Der restliche Färbeprotokollschritt wird auf dieser Oberfläche durchgeführt. Geben Sie vorsichtig die Blockierungslösung aus PBS mit 5 % BSA mittels Pipette auf die Zellen, sodass ein abgerundeter, blasenförmiger Tropfen auf dem Deckglas entsteht, der nicht austrocknet. Inkubieren Sie 30 Minuten lang.

Es ist wichtig zu beachten, dass dem Blockierungspuffer kein Detergens zugesetzt werden darf. Zu diesem Zeitpunkt sollten die Zellen nicht permeabilisiert werden, wenn nur Proteine an der Zelloberfläche markiert werden sollen. Nach der Blockierung den Blockierungspuffer abpipettieren und anschließend einen fluoreszenzmarkierten sekundären Antikörper zur Markierung der auf der Zelloberfläche exponierten Proteine hinzufügen. Danach zwei Stunden bei Raumtemperatur inkubieren. Im Anschluss den sekundären Antikörper abpipettieren und die Deckgläser zweimal für jeweils fünf Minuten mit PBS waschen, um jegliche Proteine an der Zelloberfläche zu blockieren, die nicht durch den markierten sekundären Antikörper gebunden wurden.

Die nichtpermeabilisierten Neuronen über Nacht mit einer hohen Konzentration unmarkierten sekundären Antikörpers inkubieren. Bei Raumtemperatur. Die Übernacht-Inkubation ist entscheidend.

Kürzere Inkubationszeiten blockieren nicht vollständig primäre Antikörper, die nicht vollständig durch den markierten sekundären Antikörper gebunden sind. Am nächsten Tag die Deckgläser wie zuvor zweimal für jeweils fünf Minuten mit PBS waschen. Anschließend die Zellen nach Entfernung des Fixativs für fünf Minuten bei Raumtemperatur mit 4 % Paraformaldehyd im Phosphatpuffer nachfixieren.

Spülen Sie die Zellen zweimal kurz mit PBS. Anschließend für die intrazelluläre Markierung die Zellen mit PBS, der 5 % BSA und 0,1 % Triton X-100 enthält, für 30 Minuten bei Raumtemperatur permeabilisieren und blockieren. Nach der Permeabilisierung die Blockierungslösung entfernen.

Darauf achten, dass die Deckgläser nicht austrocknen. Eine anders markierte sekundäre Antikörper hinzufügen und zwei Stunden bei Raumtemperatur inkubieren. Nach dem Entfernen des zweiten sekundären Antikörpers die Deckgläser dreimal für jeweils fünf Minuten mit PBS waschen.

Anschließend kurz mit entionisiertem Wasser waschen und die Deckgläser mit einem wässrigen Einbettmedium, das einen Anti-Fade-Agens enthält, auf Objektträger aufbringen. Die Präparate trocknen lassen und zur optimalen Erhaltung des fluoreszierenden Signals im Dunkeln bei vier Grad Celsius lagern. Die immunogefärbten Zellen mittels konfokalem Mikroskop mit den geeigneten Anregungs- und Emissionsfiltern abbilden.

Verwenden Sie für alle Replikate und Bedingungen nach der Bildaufnahme dieselben Bildaufnahmeparameter. Verwenden Sie eine Standard-Software zur Bildanalyse, wie beispielsweise Fiji Image J oder Metamorph, um die integrierte Dichte definierter interessierender Regionen oder die Punta-Attribute, wie Anzahl und Größe, zu bestimmen, um festzustellen, ob das an Anfällen beteiligte Gen sechs (says six) auf der Neuronenoberfläche vorhanden war und von dieser internalisiert wurde. Die zweifarbige Markierung kultivierter hippokampaler Rattenneuronen wurde wie in diesem Video beschrieben durchgeführt.

In diesem Bild ist das markierte Zelloberflächenprotein in Cyan dargestellt und das internalisierte Protein in Grün. Eine Doppelfärbung, die durch den Pfeil angezeigt wird, wurde nur in einer Zelle beobachtet, die ungesund erschien. Um zu bestimmen, ob das während der Inkubation mit dem Antikörper internalisierte Protein in Endosomen lokalisiert war, wurden Neuronen, die den Marker für frühe recyclingfähige Endosomen, Transferrin-mCherry, exprimieren, nach der Permeabilisierung immunhistochemisch gefärbt. Wie in diesem Bereich des dendritischen Baums gezeigt, gab es eine umfangreiche Überlappung der punktförmigen Färbung mit Transferrin, was bestätigt, dass das internalisierte Protein in Endosomen lokalisiert war. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden liegt darin, dass ein einzelner Antikörper verwendet werden kann, um zwischen Proteinen an der Zelloberfläche und internalisierten Proteinen zu unterscheiden.