Differential Markierung von Zelloberflächen und internalisierten Proteine ​​Antikörper nach Fütterung der Live-kultivierten Neuronen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, Proteine auf der Oberfläche lebender Neuronen zu markieren und anschließend Oberflächenproteine von internalisierten Proteinen durch differentielle Sekundärantikörpermarkierung zu unterscheiden. Zu diesem Zweck werden primäre Neuronen, die auf Deckglas kultiviert werden, mit einem Antikörper inkubiert, der gegen ein Oberflächenepitop gerichtet ist, und inkubiert, um eine Internalisierung zu ermöglichen. Nach der Inkubation wird ein fluoreszenzmarkierter Sekundärantikörper appliziert, um oberflächenexponierte Proteine zu identifizieren.

Dann wird überschüssiger, unmarkierter Sekundärantikörper aufgetragen, um alle verbleibenden Oberflächenprotein-Primärantikörperkomplexe zu blockieren. Die kultivierten Neuronen werden dann perme und ein sekundärer Antikörper einer anderen Farbe wird aufgebracht, um internalisiertes Protein nachzuweisen. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die durch Immunfluoreszenzmikroskopie die relativen Konzentrationen von internalisiertem Protein gegenüber Oberflächenprotein zeigen.

Nach diesem Verfahren kann ein zeitlicher Verlauf der Internalisierung von Quelloberflächenproteinen erhalten werden, der Informationen über die Proteintransportraten unter Basilikum und stimulierten Bedingungen liefert. Beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie Deckgläser für die Zellkulturwäsche vorbereiten Polylysin-beschichtete 18-Millimeter-Bolicglas-Deckgläser, die einen Tag zuvor hergestellt wurden, indem Sie sie in drei separate Spülschalen tauchen, die PBS enthalten. Geben Sie 500 Mikroliter Laminatlösung in die Vertiefungen einer 12-Well-Platte und legen Sie dann mit einer Pinzette die Deckgläser in jede Vertiefung. Drücken Sie auf jeden Deckzettel nach unten, um sicherzustellen, dass er flach im Boden der Vertiefung sitzt, zwei Stunden lang bei 37 Grad Celsius inkubieren, dieses Protokoll kann entweder mit E 15 Mauskortiken oder E 18 Ratten-Nilpferd Campi durchgeführt werden.

In dieser Demonstration werden Mauskortiken verwendet. Legen Sie die Rinde eines halben Wurfes oder eines Wurfes Embryonen auf Eis in ein Ein-Milliliter-Behälter, der PBS mit Kalzium und Magnesium enthält, und legen Sie sie auf Eis. Entfernen Sie anschließend mit einer Ein-Milliliter-Mikropipette das PBS aus dem kortikalen Gewebe.

Fügen Sie dann 500 Mikroliter einer Lösung einer Pappa-DNA zu kortikalem Gewebe aus einem halben Wurf Embryonen hinzu. Inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius für 15 bis 20 Minuten. Zweimal während der Inkubationszeit das Röhrchen vorsichtig bewegen, um den Inhalt nach der Inkubation zu mischen, und verwenden Sie eine flammpolierte silikonisierte Pasterpipette, um das Gewebe 10 bis 15 Mal vorsichtig neu zu bewerten, bis eine Zelldispersion erreicht ist.

Wenige, wenn überhaupt, nicht dissoziiertes Gewebe sollten übrig bleiben, um die Bildung von Blasen zu vermeiden. Schichten Sie die dissoziierte Zellsuspension vorsichtig über ein drei Milliliter dickes Kissen aus 4 % BS, A in Hank's BSS mit Additiven. Dann in einer Tischzentrifuge mit einer Ausschwingrotorzentrifuge bei 100-fachem G für sieben Minuten.

Entfernen Sie nach dem Schleudern vorsichtig den Überstand und achten Sie darauf, dass das Zellpellet nicht abgesaugt wird. Fügen Sie dann einen Milliliter des kompletten Neuro-Basalmediums hinzu und pipettieren Sie vorsichtig auf und ab, um die pelletierten Zellen wieder zu resuspendieren. Verwenden Sie anschließend ein Hämozytometer, um die Konzentration lebender Zellen zu bestimmen.

Nur phasenhelle Zellen sollten unmittelbar vor der Beschichtung als aktiv betrachtet werden. Aspirieren Sie die überschüssige Laminatserumlösung aus den Deckgläsern in den Vertiefungen und ersetzen Sie sie durch primäres Neuronenkulturmedium. Fügen Sie dann 75.000 bis 100.000 primäre Neuronen zu jeder Vertiefung hinzu.

Kultivieren Sie die Neuronen bis zu 21 Tage lang in neuronalem Basalmedium bei 37 Grad Celsius, 5 % Kohlendioxid am siebten Tag und fügen Sie danach jede Woche antimitotisches Fluor und Desoxyuridin-Uridin hinzu, um ein Überwachsen der Gliazellen zu verhindern, und führen Sie einen halben Mediumwechsel durch. Während der ersten Woche in Kultur entwickelten die Neuronen dendritische Dorne, wie auf diesem Bild einer zwei Tage alten Kultur zu sehen ist. In der zweiten bis dritten Woche sind sie gereift und durchlaufen eine Synaptogenese.

Ein umfangreiches Netzwerk von Projektionen ist in dieser Abbildung dargestellt, die nach 14 Tagen in vitro aufgenommen wurde, um oberflächenexponierte Proteine von Interesse zu markieren und den Primärantikörper in der entsprechenden Konzentration direkt in das konditionierte Medium zu geben. Jede Bedingung sollte in dreifacher Ausfertigung getestet werden. Vier Kontrollen, Präimmunserum oder Antikörper, die intrazelluläre Regionen des Proteins erkennen, die während der Exozytose nicht exponiert sind, können in der gleichen Verdünnung wie der Test-Primärantikörper verwendet werden. Bringen Sie die Zellen nach der Inkubation für ein, zwei oder vier Stunden in den Kulturinkubator zurück, aspirieren Sie das antikörperhaltige Medium und waschen Sie die Vertiefungen einmal vorsichtig, aber schnell mit PBS.

Fügen Sie Raumtemperatur hinzu, indem Sie Lösung in die Vertiefungen geben und dann ansaugen. Dann frisch zubereitetes 4%para-Formaldehyd hinzufügen und fünf Minuten inkubieren. Fügen Sie Raumtemperatur hinzu, um die Zellen nach der Fixierung zu fixieren.

Entfernen Sie die para-Formaldehyd-Lösung aus den Vertiefungen und entsorgen Sie sie in einem Behälter für flüssige Abfälle in der Abzugshaube. Spülen Sie die Zellen dann wie zuvor dreimal schnell mit PBS aus. Lassen Sie die dritte Wäsche an Ort und Stelle, damit sich der Deckbezug leicht entfernen lässt.

Entfernen Sie anschließend mit einer Pinzette vorsichtig die Deckgläser von der Platte und legen Sie sie mit der Zellseite nach oben auf eine Folie aus Param auf dem Boden oder Deckel einer Einweg-Kulturplatte. Der Rest des Färbeprotokolls wird auf dieser Oberfläche durchgeführt: Pipettieren Sie die Blockierungslösung von PBS 5%BSA vorsichtig auf die Zellen, um einen abgerundeten, blasenförmigen Tropfen auf dem Deckglas zu erzeugen, damit es nicht austrocknet. 30 Minuten inkubieren.

Es ist wichtig, daran zu denken, der Blockierungslösung kein Reinigungsmittel hinzuzufügen. In diesem Stadium sollten die Zellen nicht durchdrungen werden, wenn nur Zelloberflächenproteine markiert werden sollen. Nach der Blockierung aspirieren Sie die Blockierungslösung, markieren dann oberflächenexponierte Proteine, tragen einen fluoreszenzmarkierten Sekundärantikörper auf, inkubieren dann nach der Inkubation zwei Stunden lang bei Raumtemperatur, aspirieren den Sekundärantikörper und waschen die Deckgläser zweimal jeweils fünf Minuten lang mit PBS, um jedes Protein auf der Zelloberfläche zu blockieren, das nicht durch den markierten Sekundärantikörper gebunden ist.

Inkubieren Sie die nichtpermeablen Neuronen über Nacht mit einer hohen Konzentration an unmarkierten Sekundärantikörpern. Bei Raumtemperatur. Die Inkubation über Nacht ist entscheidend.

Kürzere Inkubationszeiten blockieren keinen primären Antikörper vollständig, der nicht vollständig an den markierten Sekundärantikörper gebunden ist. Waschen Sie die Eindeckeinlagen am nächsten Tag zweimal für jeweils fünf Minuten mit PBS wie zuvor. Dann werden die Zellen nach dem Entfernen des Fixiermittels fünf Minuten lang bei Raumtemperatur mit 4%para-Formaldehyd in Phosphatpuffer postfixiert.

Spülen Sie die Zellen zweimal schnell mit PBS. Als nächstes für die intrazelluläre Markierung die Zellen permeieren und mit PBS mit 5 % BSA und 0,1 % Triton X 100 bei Raumtemperatur für 30 Minuten blockieren. Entfernen Sie nach der Permeation die Blocklösung.

Achten Sie darauf, dass die Deckgläser nicht austrocknen. Fügen Sie einen anders gekennzeichneten Sekundärantikörper hinzu und inkubieren Sie ihn zwei Stunden lang bei Raumtemperatur. Nach dem Entfernen des zweiten Sekundärantikörpers waschen Sie die Eindeckeinlagen dreimal fünf Minuten lang mit PBS.

Waschen Sie sie dann kurz mit deionisierter Wasserhalterung ab. Der Deckdeckel wird mit einem wässrigen Eindeckmedium, das ein Lichtschutzmittel enthält, auf Objektträger aufgeschoben und ermöglicht es ihnen, die Objektträger im Dunkeln bei vier Grad Celsius trocken zu lagern, um das Fluoreszenzsignal optimal zu erhalten. Bilden Sie die Immunfärbezellen auf einem konfokalen Mikroskop mit den entsprechenden Anregungs- und Emissionsfiltern ab.

Verwenden Sie dieselben Bildgebungsparameter für alle Replikationen und Bedingungen nach der Bildgebung. Verwenden Sie eine Standard-Bildanalysesoftware wie Fiji Image J oder metamorph, um die integrierte Dichte von Standardregionen von Interesse zu bestimmen, oder die Punta-Attribute wie Anzahl und Größe, um zu bestimmen, ob das anfallsbezogene Gen sechs oder sechs auf der Neuronenoberfläche vorhanden war und von ihr internalisiert wurde. Die zweifarbige Markierung von kultivierten Hippocampus-Neuronen von Ratten wurde wie in diesem Video beschrieben durchgeführt.

In diesem Bild ist das markierte Zelloberflächenprotein in Cyan und das internalisierte Protein in Grün dargestellt. Eine durch die Pfeilspitze angezeigte Doppelfärbung wurde nur in einer Zelle beobachtet, die ungesund zu sein schien, um zu bestimmen, ob Proteine, die während der Antikörperfütterung internalisiert wurden, in Endosomenneuronen lokalisiert waren, die den frühen Recycling-Endosomenmarker Transferrin mCherry exprimierten, nach der Permeation immungefärbt waren, wie in dieser Region des dendritischen Dorns gezeigt wurde, gab es eine umfangreiche Überlappung der Punktfärbung mit Transferrin, was bestätigt, dass das internalisierte Protein an Endosomen lokalisiert ist. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden besteht darin, dass ein einziger Antikörper zur Unterscheidung zwischen Zelloberfläche und internalisierten Proteinpools verwendet werden kann.