Name: Differential Markierung von Zelloberflächen und internalisierten Proteine Antikörper nach Fütterung der Live-kultivierten Neuronen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-12T14:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 56 s
Description: Erfahren Sie die differentielle Markierung von Oberflächen- und internalisierten Proteinen in lebenden Neuronen mittels Antikörper-Fütterung. Diese Methode ermöglicht die Unterscheidung von Zelloberflächenproteinen und endozytierten Proteinen durch Immunfluoreszenzmikroskopie.

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Die Autoren danken Teele Palumaa für die Unterstützung bei den Zahlen. Aus dem National Health and Medical Research Council, Australien Gefördert durch Projektstipendium 1008046.

1. Dissoziierte Hippocampus Neuron Kultur <ol><li> Bereiten Deckgläser (Borosilikatglas): <ol><li> In 100%-igem Ethanol waschen. </li><li> Luft trocknen unter UV-Bestrahlung. </li><li> Mantel mit Poly-D-Lysin (0,5 mg / ml in 0,15 M Borat-Puffer, über Nacht bei 4 ° C). </li><li> Am nächsten Tag (Tag der Kultur) 3x waschen in PBS dann Mantel mit Laminin (2,5 ug / ml, Natur Maus Laminin) + 5% v / v hitzeinaktiviertem fötalen Kälberserum (FCS) in PBS für 2 Stunden bei 37 ° C. </li></ol></li><li> Präparieren Sie embryonalen Tag 18 (E18) Rattenhippokampi und sammeln in PBS Calcium und Magnesium, auf Eis gekühlt enthält. Hinweis: Alle Versuchsprotokolle mit Tieren wurden von der Tierethikkommission der Universität von Melbourne genehmigt. </li><li> Vorbereitung der Papain und DNase I-Lösungen aus der Dissoziation Papain-Kit nach den Anweisungen des Herstellers. <ol><li> In 50 ul DNase I-Lösung zu 1 ml Papain-Lösung. </li><li> HINWEIS: Sobaldzuerst hergestellt wird, kann das Papain-Lösung und die DNase I-Lösungen getrennt in Aliquots werden (0,5 ml und 25 &amp;mgr; l Aliquots für Papain und DNase I bezeichnet) und bei -20 ° C bis zum Gebrauch gelagert. </li></ol></li><li> Entfernen Sie so viel wie möglich PBS und Inkubation hippocampi (aus einem Wurf von Embryonen) mit 1 ml Papain / DNase I-Lösung bei 37 ° C für 15-20 min. Flick vorsichtig das Rohr, um die Inhalte während der Inkubationszeit zweimal mischen. </li><li> Man verreibt den Hippocampus-Gewebe sanft (die Vermeidung der Erzeugung von Bläschen) mit einer flammpolierten Pasteurpipette silikonisierten 10-15x, bis Zelldispersion erhalten wird, und wenige, wenn überhaupt, Gewebestücke von undissoziierten bleiben. </li><li> Sorgfältig Schicht dissoziierten Zellsuspension über eine 3 ml Kissen von 4% w / v Rinderserumalbumin (BSA) in Hanks ausgewogener Salzlösung plus Additive (HBSS +, siehe Abschnitt 1.6.1). <ol><li> Bereiten diese Stufengradienten Lösung durch Auflösen des BSA bei Raumtemperatur ohne RührenRing in HBSS mit 2 mM CaCl 2, 1 mM MgSO 4, 4 mM NaHCO 3 und 40 mM Glucose (HBSS +) dann Sterilfilter und bei 4 ° C </li></ol></li><li> Zentrifuge, 100 g, 7 min in einer Tischzentrifuge mit Ausschwingrotor. </li><li> Entfernen der Überstand man aufpassen, nicht das Zellpellet abzusaugen. </li><li> Resuspendieren der pelletierten Zellen vorsichtig mit einem flamm poliert (silikonisiert) Pasteur-Pipette (oder eine 1 ml Pipettenspitze blau) in 1 ml komplette Neurobasalmedium (mit 2% B27, 0,5 mM L-Glutamin mit 1% FCS). </li><li> Graf zwei 10 ul Aliquots mit einer Zählkammer (NB zählen nur phasen hellen Zellen als &quot;Live&quot;-Zellen). </li><li> Platte primäre Neuronen auf vorbereitete beschichtete Deckgläschen (0,75 bis 1 x 10 5/18 mm Deckgläschen in 12-Well-Platte). Unmittelbar vor der Beschichtung, saugen überschüssiges Laminin / Serum-Lösung von Deckgläsern und ersetzen mit primären Neuronenkulturmedium (siehe unten). NB Die erforderliche nUmbra von Deckgläsern muss im Voraus bestimmt, wie Deckglas Zubereitung wird am Tag vor der Kultur begonnen werden (siehe Schritt 1.1). </li><li> Kultur primären Ratten-Hippocampusneuronen E18 bis zu 21 Tagen in vitro (DIV) in Neurobasalmedium, 2% B27, 0,5 mM L-Glutamin mit 1% FCS (hitzeinaktiviert) ergänzt. Führen Sie eine Halbmediumwechsel bei 7 DIV und danach wöchentlich. Die anti-mitotische Fluordeoxyuridin / Uridin wird auf 7 DIV hinzugefügt, 1/1, 000 Verdünnung von 10 mM von je Nukleosid) an Gliazellen übermäßiges Wachstum zu verhindern. </li></ol> 2. Antikörper Inkubation mit Live-Neuronen <ol><li> Während der ersten Woche in Kultur werden Neuronen entwickeln dendritischen Dornen und 2-3 Wochen, haben Neuronen ausreichend gereift unterziehen Synaptogenese 6,7. <ol><li> An ausgewählten Versuchszeitpunkt / s, wenden Sie den primären Antikörper in die Vertiefungen mit primären embryonalen Neuronen auf Deckgläsern verdreifachen. Hinzufügen eines Aliquots der Antikörper direkt in das Kulturmedium vondie primären Neuronen auf die gewünschte Endverdünnung Anmerkung: In diesem Beispiel wird ein polyklonaler Kaninchen-Antiserum gegen ein rekombinantes sezernierten Form des Proteins erhöht wurde 1/500 durch Zugabe von 2 &amp;mgr; l bis 1 ml Kulturmedium verdünnt, und, ein Zentrifugation für 10 min , 13.000 xg, RT kann vor der Einnahme einen aliquoten Teil des Antikörpers, wie dieses integriert sein wird er Partikel zu entfernen und kann dazu beitragen, Hintergrund. </li><li> Der Präimmunserum Kontrollen füge eine äquivalente Menge von Präimmunserum (in der gleichen Endverdünnung). Wenn kein Präimmunserum vorhanden ist, fügen Sie die gleichwertige Menge von Neurobasal Medium oder PBS (kein primärer Antikörper-Kontrolle). Alternativ, wenn eine geeignete primäre Antikörper ist, die intrazelluläre Region / Regionen des Proteins erkennt dieser Antikörper kann auch mit einer Steuer um Spezifität der Oberflächenfärbung testen zugesetzt werden. </li><li> Rückgabe der Zellen zu dem Kulturbrutschrank für 1-4 Stunden (dieser Inkubationszeit kann empirisch bestimmt werden). In unserem experiments wurde der Antikörper für den gesamten Zeitraum vorhanden, obwohl die Versuchsanordnung konnte eine Puls-Antikörper, gefolgt von einer weiteren Inkubation nach dem Auswaschen (a Pulse-Chase-Experiment) enthalten, um den Zeitverlauf der Internalisierung beurteilen. OPTIONAL: Diese Inkubation kann bei Raumtemperatur oder auf Eis durchgeführt werden, um die Rate der basalen Protein Internalisierung verlangsamen, falls erforderlich. Wenn in einem Nicht-CO 2-kontrollierten Umgebung durchgeführt wird, sollte das Medium, eine, die nicht gepuffert Bicarbonat vor der Zugabe der Antikörper / Antiserum geändert werden. ACHTUNG: Ältere Neuronenkulturen (&gt; 14 Tage und besonders kultivierten embryonalen Maus-Neuronen) keine Vollmediumwechsel gut vertragen. </li></ol></li><li> Wir haben Inkubationszeit für diesen primären Antikörper Internalisierung Schritt von 1 h, 2 h und 4 h mit guten Ergebnissen verwendet werden, obwohl die optimale Zeit auf Abundanz des Proteins von Interesse sowie die Dynamik abhängig von den Proteintransport in der CELls im Studium. HINWEIS: Die zweifarbige Bilder in Repräsentative Ergebnisse gezeigt, wurden mit einer Inkubation von 1 h bei 37 º C in einem Gewebekultur-Inkubator erhalten. </li><li> Nach Inkubation für den gewünschten Zeitraum, absaugen, die den Antikörper enthaltende Medium. Sanft aber schnell wieder waschen die Vertiefungen mit PBS bei Raumtemperatur. </li></ol> 3. Sekundäre Antikörper Anwendung auf Fest, permeabilisierten Zellen <ol><li> Fix Neuronen mit 4% Paraformaldehyd in Phosphatpuffer pH 7,2, 5 min bei Raumtemperatur Hinweis: Die besten Ergebnisse erzielen Sie mit frisch zubereiteten Haarfestiger; alternativ Update, das bei -20 ° C gelagert wurde und aufgetaut vollständig, so dass keine ausgefallenen Para ist offensichtlich . ACHTUNG: Paraformaldehyd Fixiermittel sollten bereit und in einem Abzug gehandhabt werden. </li><li> Entfernen fix aus Brunnen (Übernahme in Abfallbehälter im Abzug) und spülen 3x mit PBS. <ol><li> OPTIONAL: Wenn gewünscht, auf Antikörper-Reagenzien zu sparen, können die Deckgläservorsichtig von der Platte mit 12 Vertiefungen mit einer Pinzette entfernt werden, und platziert Zell Seite nach oben, auf ein Blatt Parafilm auf der Basis eines Einweg-Kulturplatte gelegt. </li><li> Lösungen können dann leicht auf die Deckgläser pipettiert werden, so dass sie völlig ohne Lösungsüberflutung über den Rand des Deckglases auf den Parafilm abgedeckt sind. </li><li> Diese Technik eignet sich für Kurzzeit-Inkubation (1-2 Std.) jedoch mehr Inkubationen (zB über Nacht) sollte in einer feuchten Kammer durchgeführt werden. Alternativ können die Deckgläser wieder in die Vertiefungen der 12-Well-Platte für die Inkubation über Nacht und ausreichendes Volumen gegeben werden sollte hinzugefügt werden, dass die Deckgläser nicht austrocknen. </li></ol></li><li> Block für 30 min bei Raumtemperatur mit 5% BSA in PBS (Anmerkung: Sie Waschmittel in der Blockierungslösung in dieser Phase nicht hinzu, da es wichtig, dass die Zellen nicht permeabilisiert). </li><li> Um Oberflächenprotein, bevor Sie fortfahren mit UVEK beschriftention von internalisierten Protein, gelten die erste fluoreszenzmarkierten 2 ° Antikörper der Wahl. Anmerkung: In dem hier beschriebenen Beispiel wurde das primäre Antiserum in Kaninchen (in-house-Antikörper) einen rekombinanten sezernierten Isoform 4 angehoben. So kann der erste sekundäre Antikörper an die extrazelluläre Region des Trans Isoform auf der Oberfläche der permeabilisierten Neuronen nachzuweisen, haben wir Esel-Anti-Kaninchen-Dylight 649 (um 1/200 verdünnt in PBS mit 5% BSA). Es wird empfohlen, verdünnten sekundären Antikörperlösungen (10 min, 13.000 xg, RT) vor Gebrauch zentrifugiert. </li><li> Die Deckgläser Inkubation für 2 Stunden bei Raumtemperatur. </li><li> Deck waschen (in Brunnen), 2x 5 min mit PBS. </li></ol> 4. Blockieren mit Excess unbeschriftet 2 ° Antikörper <ol><li> Blockieren die permeabilisierten Neuronen mit einer hohen Konzentration (&gt; 0,1 mg / ml) von unmarkiertem 2 ° Antikörper. <ol><li> Das unmarkierte 2 ° Antikörper sollte gegen die Spezies gezüchtet werden, in denenDer primäre Antikörper wurde durch Inkubation über Nacht bei Raumtemperatur erhöht (in diesem Fall Kaninchen). </li><li> Für dieses Protokoll wurde AffiniPure F ab-Fragment Ziegen-anti-Kaninchen-IgG (H + L) in einer Konzentration von 0,13 mg / ml verwendet. HINWEIS: Die Inkubation über Nacht wurde festgestellt, entscheidend, da eine kürzere Inkubation (2 h) zu sein war nicht ausreichend für eine vollständige Blockierung des primären Antikörpers, der nicht vollständig von dem markierten sekundären Antikörper gebunden wurde. </li></ol></li><li> Deck waschen (in Brunnen), 2x 5 min mit PBS. </li><li> Nach dieser Blockierungsschritt, nach Fixierung der Zellen mit 4% Paraformaldehyd in Phosphatpuffer pH 7,2, 5 min bei Raumtemperatur. Spülen mit PBS (2x) nach der Entfernung der Fixierungsmittel (Fixiermittel Transfer zum Abfallbehälter im Abzug). </li></ol> 5. Permeabilisierung und Anwendung des Zweiten Fluoreszenz-konjugierte Antikörper 2 ° <ol><li> Permeabilisiert und blockieren die Zellen mit 5% BSA in PBS, enthaltend 0,1% Triton-X-100 bei Raumtemperatur für 30 min. </li><li> Blocking-Lösung (darauf achten, dass die Deckgläser nicht austrocknen). In der zweiten fluoreszenz konjugierten 2 ° Antikörper mit einem anderen Fluorophor markiert. <ol><li> HINWEIS: Es muß möglich sein, diese Fluorophor-Markierung von dem vorher verwendeten unterscheidet, abhängig von den verfügbaren Anregungs / Emissionsfilter auf der konfokalen Mikroskop (siehe unten). </li><li> Für die in diesem Protokoll vorgestellten Beispiel wurde ein Alexa Fluor 488-konjugierten Esel-Anti-Kaninchen-2 °-Antikörper verwendet (um 1/200 in PBS, 5% BSA und 0,1% Triton-X-100). Inkubation 2 h bei Raumtemperatur entfernen Sie dann das 2 °-Antikörperlösung. </li></ol></li><li> Wash Deckgläser 3x 5 min mit PBS und schließlich kurz waschen mit entsalztem Wasser. </li></ol> 6. Montage-und Imaging <ol><li> Berg Deckgläser auf Glasobjektträger mit einem wässrigen Medium mit Montageantifade (zB Vectashield) und trocknen lassen. Shop im Dunkeln bei 4 ° C für optimal Erhaltung der Fluoreszenzsignalintensität. </li><li> Bildimmun Zellen auf einem konfokalen Mikroskop. <ol><li> Geeigneten Anregungs-und Emissionsfilter zur Detektion von zwei Fluorophor-Signale zur Verfügung stehen. </li><li> Wenn verschiedene experimentelle Bedingungen (zB Internalisierung Raten unter depolarisierten 8,9 oder Kontrollbedingungen) verglichen werden, sicherzustellen, dass alle replizieren Deckgläser aus den verschiedenen Bedingungen sind mit den gleichen Bildaufnahmeparameter abgebildet. Die integrierte Dichte der Standardregionen von Interesse oder der puncta Attribute (zB Anzahl, Größe) aus den resultierenden Bilder können dann mit Standard-Bildanalyse-Software (z. B. Fiji / ImageJ, Metamorph) gemessen werden. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Lewis, T. L. Jr, Mao, T., Arnold, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+myosin+VI+in+the+localization+of+axonal+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">A role for myosin VI in the localization of axonal proteins.</a> PLoS Biol. 9, (2010).</li>
<li>von Zastrow, M., Williams, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulating+neuromodulation+by+receptor+membrane+traffic+in+the+endocytic+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Modulating neuromodulation by receptor membrane traffic in the endocytic pathway.</a> Neuron. 76, 22-32 (2012).</li>
<li>Gunnersen, J. M., Augustine, C., Spirkoska, V., Kim, M., Brown, M., Tan, S. -S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+analysis+of+gene+expression+patterns+in+developing+mouse+neocortex+using+serial+analysis+of+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Global analysis of gene expression patterns in developing mouse neocortex using serial analysis of gene expression.</a> Mol. Cell. Neurosci. 19, 560-573 (2002).</li>
<li>Gunnersen, J. M., Kim, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sez-6+proteins+affect+dendritic+arborization+patterns+and+excitability+of+cortical+pyramidal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Sez-6 proteins affect dendritic arborization patterns and excitability of cortical pyramidal neurons.</a> Neuron. 56, 621-639 (2007).</li>
<li>Kennedy, M. J., Davison, I. G., Robinson, C. G., Ehlers, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Syntaxin-4+Defines+a+Domain+for+Activity-Dependent+Exocytosis+in+Dendritic+Spines%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Syntaxin-4 Defines a Domain for Activity-Dependent Exocytosis in Dendritic Spines.</a> Cell. 141, 524-535 (2010).</li>
<li>Cullen, D. K., Gilroy, M. E., Irons, H. R., Laplaca, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synapse-to-neuron+ratio+is+inversely+related+to+neuronal+density+in+mature+neuronal+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Synapse-to-neuron ratio is inversely related to neuronal density in mature neuronal cultures.</a> Brain Res. 1359, 44-55 (2010).</li>
<li>Grabrucker, A., Vaida, B., Bockmann, J., Boeckers, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptogenesis+of+hippocampal+neurons+in+primary+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Synaptogenesis of hippocampal neurons in primary cell culture.</a> Cell Tissue Res. , 338-341 (2009).</li>
<li>Vaillant, A. R., Zanassi, P., Walsh, G. S., Aumont, A., Alonso, A., Miller, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+mechanisms+underlying+reversible%2C+activity-dependent+dendrite+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Signaling mechanisms underlying reversible, activity-dependent dendrite formation.</a> Neuron. 34, 985-998 (2002).</li>
<li>Park, M., Penick, E. C., Edwards, J. G., Kauer, J. A., Ehlers, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recycling+endosomes+supply+AMPA+receptors+for+LTP%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Recycling endosomes supply AMPA receptors for LTP.</a> Science. 305, 1972-1975 (2004).</li>
<li>Kennedy, M. J. &, Ehlers, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organelles+and+trafficking+machinery+for+postsynaptic+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Organelles and trafficking machinery for postsynaptic plasticity.</a> Annu. Rev. Neurosci. 29, 325-362 (2006).</li>
<li>Lasiecka, Z. M., Yap, C. C., Caplan, S., Winckler, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+early+endosomes+require+EHD1+for+L1%2FNgCAM+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neuronal early endosomes require EHD1 for L1/NgCAM trafficking.</a> J. Neurosci. 30, 16485-16497 (2010).</li>
<li>Arancibia-Cárcamo, I. L., Fairfax, B. P., Moss, S. J., Kittler, J. T. Studying the localization, surface stability and endocytosis of neurotransmitter receptors by antibody labeling and biotinylation approaches. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aArancibia-C%C3%A1rcamo%2C+IL+%22The+Dynamic+Synapse%3A+Molecular+Methods+in+Ionotropic+Receptor+Biology%22">The Dynamic Synapse: Molecular Methods in Ionotropic Receptor Biology</a>. Kittler, J. T., Moss, S. J. , CRC Press. Boca Raton, FL. (2006).</li>
<li>Petrini, E. M., Lu, J., Cognet, L., Lounis, B., Ehlers, M. D., Choquet, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocytic+trafficking+and+recycling+maintain+a+pool+of+mobile+surface+AMPA+receptors+required+for+synaptic+potentiation%29%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Endocytic trafficking and recycling maintain a pool of mobile surface AMPA receptors required for synaptic potentiation).</a> Neuron. 63, 92-105 (2009).</li>
<li>Reider, A., Wendland, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocytic+adaptors+%E2%80%93+social+networking+at+the+plasma+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Endocytic adaptors – social networking at the plasma membrane.</a> J. Cell Sci. 124, 1613-1622 (2011).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.

Die hier beschriebene Technik ist komplementär zu der Biotinylierung der Zelloberfläche (durch Arancibia-Carcamo et al. Bewertung) 12 und es ist die Methode der Wahl für die Bewahrung von Informationen über die subzelluläre Lokalisation des internalisierten Protein, sofern eine geeignete primäre Antikörper an ein extrazelluläres Epitop ist. Darüber hinaus kann die Quantifizierung von Proteintransport / Internalisierung über die Zeit (durch Fixieren Deck zu verschiedenen Zeiten während der Inkubation ...

Bei der Festlegung der Funktion der neu identifizierten Proteine, Untersuchung der subzellulären Lokalisation und Menschenhandel des Proteins in Frage wichtige Hinweise auf die wahrscheinliche Rolle / s des Proteins 1,2 bieten. Bioinformatische Analyse des Transkriptoms der Entwicklungs Neocortex 3 hat uns mit einer Liste von Genen veränderte Expression während der Maushirn Kortikogenese zeigt. Dann nahm eine Gen-Knockout-Ansatz, um festzustellen, dass das Protein durch eines dieser Gene, sez6 codiert, hat eine Schlüsselrolle in der Neuronenentwicklung. Wir beobachteten, dass die Beschlagnahme-verwandtes Gen 6 oder Sez6, Protein ist in der Entwicklung Dendriten und ist auch in dendritischen Dornen, spezialisierte Strukturen auf Dendriten, die Aufnahme und Integration von erregenden Signale vorhanden. Darüber hinaus, wenn dieses Protein fehlt, Dendriten und Synapsen nicht einwand 4 zu bilden. Die wahrscheinliche dominante Isoform des Proteins hat die Eigenschaften eines TransmembranE-Rezeptor, obwohl, wenn die subzelluläre Verteilung von immunmarkierten Proteins wurde durch konfokale Mikroskopie oder Immun-Elektronenmikroskopie untersucht die meisten, wenn nicht alle, der das Signal erschien mit kleinen Bläschen in der somatodendritischen Fach mit wenig oder kein Protein auf der Plasmamembran markiert zugehörigen an der Zelloberfläche. Um endgültig zu zeigen, dass diese mutmaßlichen Rezeptor mit einem vorhergesagten großen extrazellulären Domäne in der Plasmamembran gehandelt hat man eine Lebendzell-Ansatzes unter Verwendung des Antiserums wir an einen extrazellulären Teil des Proteins erzeugt hatte, um Protein auf der Zelloberfläche zu markieren. Durch die Kombination dieser &quot;Antikörper Fütterung&quot; Ansatz mit zwei Anwendungen der differentiell markierten sekundären Antikörper, der durch eine umfassende Sperrschritt und einem Schritt Permeabilisierung getrennt waren wir in der Lage, zwei verschiedene Pools von Protein unterschieden durch Bindung an fluoreszenzmarkierten Sekundärantikörper tragen verschiedene fluoreszier identifizierenent-Tags. So konnten wir Protein, das während der Antikörper-Inkubation Schritt von Protein, das entweder blieb auf der Zelloberfläche oder wurde während dieser Zeit auf die Oberfläche Handel durch Endozytose internalisiert worden war, zu unterscheiden. Unter Verwendung dieses Verfahrens haben wir, dass das Protein von Interesse wird zu und von der Zelloberfläche in Neuronen gehandelt. Daher hat sich diese relativ schnell und einfache Technik informativer als traditionelle Methoden Immunzytochemie oder vorge Einbettung Immunelektronenmikroskopie, trotz der Tatsache, dass wir verwendeten die gleiche polyklonalen Kaninchen-Antiserum für alle diese Techniken. Diese Technik ist allgemein anwendbar auf irgendeine Transmembranprotein ein gutes Antikörper Epitope erkennen, die extrazelluläre Domäne ist. Die Technik bereits verwendet wurde, um die Rezeptorhandel der Glutamat-Rezeptor-Untereinheit GluR1 5 zu studieren.

<table><tbody><tr><td>PBS mit Ca und Mg</td><td>Invitrogen</td><td>14040182</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasalmedium</td><td>Invitrogen</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>B27 Supplement</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>Invitrogen</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>Papain-Dissoziationssystem</td><td>Worthington Biochemical Corporation</td><td>PDS</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserum Albumin&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich Australien</td><td>A9418</td><td></td></tr><tr><td>Hank&#039; s ausgewogene Salzlösung ohne Calcium, Magnesium, Phenolrot</td><td>Invitrogen (Gibco)</td><td>14175-079</td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-Lysin</td><td>Sigma Aldrich Australien</td><td>P0899</td><td></td></tr><tr><td>Natürliches Mauslaminin</td><td>Invitrogen</td><td>23017-015</td><td>Vor der Aliquote auf Eis auftauen</td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum HyClone</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluordeoxyuridin</td><td>Sigma Aldrich Australien</td><td>F0503</td><td></td></tr><tr><td>Uridine</td><td>Sigma Aldrich Australien</td><td>U3003</td><td></td></tr><tr><td>18 mm Rundglas Deckgläser</td><td>Menzel Gl&auml; ser</td><td>CB00180RA1</td><td></td></tr><tr><td>VECTASHIELD wässriges Eindeckmedium</td><td>Vector Laboratories</td><td>H1400</td><td></td></tr><tr><td>Donkey Anti-Kaninchen Dylight 649&nbsp;</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td><td>711-495-152</td><td></td></tr><tr><td>AffiniPure Fab Fragment Ziege Anti-Kaninchen 1gG (H+L)&nbsp;</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td><td>111-007-003</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma Aldrich Australia</td><td>P6148</td><td>TOXIC - Griff im Abzug</td></tr><tr><td>Triton-X-100</td><td>Sigma Aldrich Australia</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488-konjugierter Esel Anti-Kaninchen 2&deg; Antikörper</td><td>Invitrogen - Molekulare Sonden</td><td>A21206</td><td></td></tr></tbody></table>

differential markierung von zelloberflächen und internalisierten proteine ​​antikörper nach fütterung der live-kultivierten neuronen

Differential Labeling of Cell-surface and Internalized Proteins after Antibody Feeding of Live Cultured Neurons

Um die Zelloberflächen-Lokalisierung eines mutmaßlichen Transmembran-Rezeptor in kultivierten Neuronen demonstrieren, das Protein markiert man auf der Oberfläche von lebenden Neuronen mit einem spezifischen primären Antikörper gegen einen extrazellulären Teil des Proteins erhöht. Da die Rezeptoren an und von der Oberfläche gehandelt, wenn Zellen werden permeabilisiert, dann nach der Fixierung sowohl der Zelloberfläche und interne Protein um denselben markierten sekundären Antikörper nachgewiesen werden. Hier passten wir eine Methode verwendet, um Proteintransport (&quot;Antikörper Zeit&quot;) zu studieren, um Label-Protein, das während der Antikörper-Inkubation Schritt und Protein, die entweder blieb auf der Zelloberfläche oder wurde in dieser Zeit an die Oberfläche Handel durch Endozytose internalisiert worden war differentiell . Die Fähigkeit, diese beiden Pools von Protein unterscheiden durch den Einbau einer Übernachtblockierungsschritt mit hochkonzentrierten unmarkierten sekundären Antikörpers nach einer anfänglichen incubatio möglich wurden der permeabilisierten Neuronen mit einem fluoreszenzmarkierten sekundären Antikörper. Nach dem Blockierungsschritt, Permeabilisierung der Neuronen erlaubt Detektion des internalisierten Pool mit einem fluoreszierenden sekundären Antikörpers mit einem anderen Fluorophor markiert. Mit dieser Technik konnten wir wichtige Informationen über die subzelluläre Lage dieses mutmaßlichen Rezeptor zu erhalten, offenbart, dass es in der Tat auf der Zelloberfläche in Neuronen gehandelt. Diese Technik ist allgemein anwendbar auf einen Bereich von Zelltypen und Zelloberflächen-Proteine, die eine geeignete Antikörpers an ein extrazelluläres Epitop ist.

Die Zweifarben-Fluoreszenz Immunfärbetechnik präsentierten nützlich zur Markierung von extrazellulären Domänen von Transmembran-Proteinen in lebenden Zellen (in 1 schematisch gezeigt). Während der Inkubationszeit, die Immunglobuline binden zugängliche Epitope und ein Anteil der Bevölkerung von Proteinmolekülen zusammen mit gebundenem Antikörper wird durch Endozytose aufgenommen. Zusätzlich kann neu synthetisierten Proteins an die Zelloberfläche über Terminhandel zu erreichen und recycelt Proteinmoleküle...

Wir beschreiben ein Verfahren, um Protein auf der Oberfläche von lebenden Neuronen mit einem spezifischen polyklonalen Antikörper, der an die extrazelluläre Epitope zu beschriften. Protein, das von dem Antikörper auf der Zelloberfläche gebunden und anschließend über Endozytose aus Protein verbleibende unterschieden werden können, oder an der Oberfläche während der Inkubation gehandelt.

Differential Markierung von Zelloberflächen und internalisierten Proteine ​​Antikörper nach Fütterung der Live-kultivierten Neuronen

In order to demonstrate the cell-surface localization of a putative transmembrane receptor in cultured neurons, we labeled the protein on the surface of ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Proteine auf der Oberfläche lebender Neuronen zu markieren und anschließend mittels differenzieller Sekundärantikörper-Färbung zwischen Oberflächenproteinen und internalisierten Proteinen zu unterscheiden. Dazu werden primäre Neuronen, die auf Deckgläsern kultiviert werden, mit einem Antikörper inkubiert, der gegen ein Oberflächenepitop gerichtet ist, und anschließend unter Bedingungen gehalten, die die Internalisierung ermöglichen. Nach der Inkubation wird ein fluoreszenzmarkierter Sekundärantikörper aufgebracht, um die auf der Oberfläche befindlichen Proteine zu identifizieren.Anschließend wird ein Überschuss an unmarkiertem sekundärem Antikörper aufgebracht, um verbleibende Komplexe aus primärem Antikörper und Oberflächenprotein zu blockieren. Die kultivierten Neuronen werden dann permeabilisiert, und ein sekundärer Antikörper einer anderen Farbe wird appliziert, um internalisiertes Protein nachzuweisen. Letztendlich können Ergebnisse erhalten werden, die die relativen Mengen an internalisiertem im Vergleich zu Oberflächenprotein mittels Immunfluoreszenzmikroskopie zeigen.Nach Durchführung dieses Verfahrens kann ein Zeitver

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Forschung

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Neuroscience

Neurowissenschaften

Wir demonstrieren den Einsatz der Gen-Kanone, um fluoreszierende Farbstoffe, wie DII, zu Neuronen in Hirnschnitten von Nagern und Primaten verschiedener Altersstufen einzuführen. In diesem speziellen Fall, verwenden wir erwachsenen Mäusen (3-6 Monate alt) und Erwachsenen cynomologus Affen (9-15 Jahre alt). Diese Technik, die ursprünglich von dem Labor von Dr. Lichtman beschrieben...

DiOLISTIC Labeling von Neuronen aus Nager und nicht-menschlichen Primaten Hirnschnitten

Eine schnelle Annäherung an Interaktionen und Wirkungen auf molekularer Mechanismen in Bezug auf die Anwesenheit von Antikörpern in einer intrazellulären Umgebung untersucht wird beschrieben. Das Verfahren beinhaltet die Transfektion von Antikörpern in lebende Zellen mit einem nicht-kovalenten Komplex-Bildung auf einem Lipid Formulierung. Die Technik ist anpassbar an immortalisierten Zelllinien und primäre Zellen.

Antikörper Transfektion in Neuronen als Werkzeug zur Pathogenese der Erkrankung Studieren

Wir stellen eine Technik zur Markierung von einzelnen Neuronen im Zentralnervensystem (ZNS)...

Beschriften einzelner Zellen im zentralen Nervensystem<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Mikrogliazellen sind die residenten Immunzellen des zentralen Nervensystems (ZNS) mit hoher Kapazität, in ihren extrazellulären Umgebung phagozytieren oder verschlingen Material. Hier ist eine breit anwendbare, zuverlässige und hoch quantitativen Assay für die Visualisierung und Messung Mikroglia-vermittelte Phagozytose von synaptischen Komponenten beschrieben.

Ein Engulfment Assay: Ein Protokoll, um Interaktionen zwischen Fresszellen und Neuronen CNS bewerten

Wir bieten eine detaillierte Beschreibung eines Protokolls für die durchflusszytometrische Analyse von Oberflächenantigenen und/oder intrazellulären Antigenen in neuralen Zelltypen. Kritische Aspekte der Versuchsplanung, methodische Schritte und grundlegende Prinzipien der Durchflusszytometrie werden erläutert, um Neurobiologen in die Lage zu versetzen, diese leistungsstarke Technologie zu nutzen.

Flow Cytometry Protokolle für Oberflächen- und intrazelluläre Antigen Analysen Neuronale Zelltypen

Rezeptor-moduliert Signalisierung und Zellen gegenüber Liganden und ist selbst in Reaktion auf Zellbedingungen, einschließlich Liganden-induzierte Signalisierung. Hier beschreiben wir eine leistungsfähige und flexible Methode zur quantitativen Beurteilung der Arzneimittel-induzierte Rezeptor-Verwendung von Immunmarkierung und colocalizational Analyse.

Tracking-Drug-induzierte Veränderungen der Post-Rezeptor-Internalisierung Handel durch Colocalizational Analysis

Die Untersuchung des Membranhandels ist entscheidend für das Verständnis der neuronalen Funktionen. Hier stellen wir eine Methode zur Quantifizierung der Vesikelmotilität in Neuronen vor. Dies ist eine bequeme Methode, die an die Quantifizierung des Membranhandels im Nervensystem angepasst werden kann.

Quantifizierung von Endosom- und Lysosom-Motilen in kultivierten Neuronen mit fluoreszierenden Sonden

Präsentiert wird hier ein Protokoll, das ein in vitro neural-endotheliales Kokultursystem und die metabolische Einbeziehung von Sialoglycan mit bioorthogonalen funktionellen Gruppen kombiniert, um primäre neuronale Stamm- und Vorläuferzellen zu erweitern und ihre Oberfläche zu beschriften. sialoglycoproteinzur Bildgebung oder Massenspektrometrieanalyse von Zelloberflächenmarkern.

Identifizieren von Zelloberflächenmarkern von primären neuralen Stamm- und Vorläuferzellen durch metabolische Kennzeichnung von Sialoglycan

Neuronale Erregbarkeit kann durch einen dynamischen Prozess der Endo- und Exozytose von exzitatorischen Ionotropic Glutamat-Rezeptoren moduliert werden. Hier beschriebenen ist ein leicht zugängliche, High-Content Assay zur Quantifizierung der Oberfläche und interne Rezeptor Bevölkerung Pools.

Ein High-Content-Assay für die Überwachung der AMPA Rezeptor Menschenhandel

Dieser Artikel stellt eine Methode zur Untersuchung des Schleimatrezeptorhandels (GluR) in dissoziierten primären Hippocampuskulturen vor. Mit einem Antikörper-Fütterungsansatz zur Kennzeichnung endogenes oder überexprimierter Rezeptoren in Kombination mit pharmakologischen Ansätzen ermöglicht diese Methode die Identifizierung molekularer Mechanismen zur Regulierung der GluR-Oberflächenexpression durch Modulation Internalisierungs- oder Recyclingprozesse.

Ein Antikörper-Fütterungsansatz zur Untersuchung des Schleimatrezeptorhandels in dissoziierten primären Hippocampuskulturen

Das neuronale Membranproteasom (NMP) wurde kürzlich in einer Untergruppe somatosensorischer Neuronen als Schlüsselregulator der Berührungs-, Schmerz- und Juckreizwahrnehmung identifiziert. In diesem Artikel wird ein robuster Arbeitsablauf für die Analyse der zelltypspezifischen NMP-Expression und -Funktion unter Verwendung von Zellsortierung, Transkriptom-Profiling und kulturbasierten Immunfluoreszenzanalysen vorgestellt.

Zellsubtyp-spezifische Analyse von neuronalen Membranproteasomen in somatosensorischen Neuronen

Erfahren Sie die differentielle Markierung von Oberflächen- und internalisierten Proteinen in lebenden Neuronen mittels Antikörper-Fütterung. Diese Methode ermöglicht die Unterscheidung von Zelloberflächenproteinen und endozytierten Proteinen durch Immunfluoreszenzmikroskopie.

Differential Markierung von Zelloberflächen und internalisierten Proteine ​​Antikörper nach Fütterung der Live-kultivierten Neuronen (Video) | JoVE Journal

Differential Markierung von Zelloberflächen und internalisierten Proteine ​​Antikörper nach Fütterung der Live-kultivierten Neuronen

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