Quantitativer Multiplex-Bakteriennachweis mit Farbstoff-markierten magnetischen Mikrosphären

Nehmen Sie eine Assay-Platte, die eine Mischung aus magnetischen Polystyrol-Mikrokügelchen enthält, die intern mit spektral unterschiedlichen Fluorophoren gefärbt sind.

Jedes Mikrosphären-Set ist kovalent an unterschiedliche pathogene bakterienspezifische Fängerantikörper gekoppelt.

Fügen Sie eine hitzeabgetötete pathogene Bakterienmischung hinzu. Ausbrüten.

Capture-Antikörper binden die bakteriellen Zielantigene und bilden Mikrosphären-Bakterien-Komplexe.

Verwenden Sie einen Magnetabscheider, um Komplexe abzusetzen. Ungebundene Bakterien entsorgen und mit Puffer waschen.

Fügen Sie Puffer und biotinylierte Nachweisantikörper hinzu, die spezifisch an mikrosphärengebundene Bakterien binden

Trennen Sie die Komplexe magnetisch und waschen Sie sie mit Puffer.

Suspendieren Sie die Komplexe im Puffer. Pipettieren Sie Reportermoleküle, die Fluorophor-gekoppeltes Streptavidin umfassen und an die biotinylierten Nachweisantikörper binden.

Trennen und waschen Sie die Komplexe magnetisch. Im Puffer resuspendieren.

Bei der flussbasierten Analyse regt der erste Laser die internen Fluorophore der Mikrosphäre an, wodurch einzigartige spektrale Signaturen erzeugt und einzigartige Mikrosphärensätze identifiziert werden.

Der zweite Laser regt die Fluorophor-Reporter an, die an Bakterien auf Mikrosphären gebunden sind, und quantifiziert Bakterien auf verschiedenen Mikrosphärensätzen, was einen multiplexierten quantitativen Bakteriennachweis ermöglicht.

Für die Probenerfassung fügen Sie zunächst fünfzig Mikroliter Mikrokugeln oder konjugierte Kügelchen hinzu, um Antikörper in einer 96-Well-Platte einzufangen. Geben Sie dann fünfzig Mikroliter der pathogenen Bakterien, gefolgt von fünfzig Mikrolitern PBS-TBN, in die Hintergrundvertiefungen.

Decken Sie die Platte mit einer Folienversiegelung ab und inkubieren Sie sie auf einem Plattenschüttler bei achthundert Umdrehungen pro Minute für eine Stunde.

Legen Sie danach die Platte für 1 Minute auf den Magnetabscheider, um die Kügelchen zu trennen. Evakuieren Sie die restliche Lösung, während Sie die Platte auf dem magnetischen Plattenabscheider belassen. Klopfen Sie dann drei- bis viermal zum Trocknen auf Laborpapiertücher. Waschen Sie die Vertiefungen zweimal gründlich mit PBS-TBN.

Für den Probennachweis geben Sie fünfzig Mikroliter Assay-Puffer gefolgt von fünfzig Mikrolitern biotinylierten Nachweisantikörpern in einer Konzentration von vier Mikrogramm pro Milliliter in die Vertiefungen.

Inkubieren Sie die Platte eine Stunde lang im Dunkeln, um eine effiziente Interaktion zwischen Bakterien und Nachweisantikörpern zu ermöglichen. Trennen Sie anschließend die Kügelchen mit dem Magnetabscheider und waschen Sie die Kügelchen mit PBS-TBN, wie zuvor gezeigt.

Resuspendieren Sie die Kügelchen in fünfzig Mikrolitern Assay-Puffer und fügen Sie fünfzig Mikroliter Streptavidin-R-Phycoerythrin oder SAPE, ein fluoreszierendes Reportermolekül, hinzu. Decken Sie die Platte mit einer Folienversiegelung ab und inkubieren Sie sie 30 Minuten lang auf dem Plattenschüttler.

Sobald die Vertiefungen gewaschen sind, resuspendieren Sie die Kügelchen in 100 Mikrolitern PBS-TBN und laden Sie die Platte auf den durchflussbasierten Analysator.

Zeichnen Sie die Messwerte mit einer geeigneten Software auf. Die mittleren Nettowerte der Fluoreszenzintensität für jeden Organismus können anhand einer Standardkurve ausgewertet werden, um die in der Probe vorhandene Bakterienlast zu bestimmen.