Isolierung und Verdauung neutrophiler Proteine

Beginnen Sie mit einem Röhrchen mit Neutrophilen. Fügen Sie einen Puffer hinzu, der einen Proteinase-Inhibitor enthält, um den Proteinabbau zu verhindern.

Fügen Sie ein geeignetes Reinigungsmittel hinzu, um die Neutrophilenmembran zu permeabilisieren

In einem Eisbad beschallen Sie die Probe mit hochfrequenten Schallwellen, um die Zellmembran zu durchbrechen und intrazelluläre Inhalte, einschließlich verschiedener Proteine, freizusetzen.

Kurz zentrifugieren, um den Inhalt von den Röhrchenwänden aufzufangen und in ein geeignetes Röhrchen zu überführen.

Führen Sie ein Reduktionsmittel ein und inkubieren Sie es bei hoher Temperatur, um die Spaltung der Disulfidbindung zu fördern, wodurch die Proteine denaturieren.

Abkühlen lassen und ein alkylierendes Reagenz einführen, das die Sulfhydrylgruppen alkyliert.

Fügen Sie kaltes Aceton hinzu, um die Proteinfällung zu induzieren.

Zentrifuge, um die Proteine und Zellfragmente zu pelletieren. Entfernen Sie den Überstand und trocknen Sie ihn an der Luft.

Geben Sie einen denaturierungsmittelhaltigen Puffer ein und beschallen Sie, um das Proteinpellet wieder aufzulösen.

Zum Schluss fügst du eine Proteasemischung hinzu, die Proteine spaltet. Bewahren Sie die Probe für die weitere Verarbeitung auf.

Sammeln Sie zunächst die neutrophilendifferenzierten HL60-Zellen in einem 15-Milliliter-Röhrchen, indem Sie die Proben 5 Minuten lang bei 400-mal g zentrifugieren.

Waschen Sie das Zellpellet zweimal, indem Sie 15 Milliliter PBS hinzufügen und zentrifugieren Sie erneut bei 400 mal g für 5 Minuten.

Geben Sie 300 Mikroliter eiskaltes 100-millimolares Tris HCl pH 8,5 mit einer Proteinase-Hemmer-Cocktailtablette zu jeder Probe und wirbeln Sie sie kurz ein.

Fügen Sie dann 1 x 10 Volumen mit 20 % SDS zu einer Endkonzentration von 2 % hinzu und sondenbeschallen Sie die Proben in einem Eisbad für 30 Sekunden an und 30 Sekunden aus, für fünf Zyklen bei 10 Prozent Leistung.

Um den Sprühnebel von den Röhrchenwänden aufzufangen, zentrifugieren Sie die Proben 5 bis 10 Sekunden lang bei maximaler Geschwindigkeit, ohne dass die Zelltrümmer ein Pellet bilden.

Die Proben aus dem 15-Milliliter-Röhrchen werden in ein 2-Milliliter-Röhrchen überführt und 1 x 100 Volumen 1 Molstock Dithiothreitol bis zu einer Endkonzentration von 10 Millimolar zugegeben.

Nach kurzem Vortexen inkubieren Sie die Proben 10 Minuten lang bei 95 Grad Celsius und schütteln bei 800 U/min. Kühlen Sie die Proben dann auf Raumtemperatur ab, indem Sie sie auf Eis legen.

Als nächstes fügen Sie unter dunklen Bedingungen 1 x 10 Volumen von 0,55 molaren Iodacetamid zu einer Endkonzentration von 55 Millimolar hinzu und wirbeln Sie das Röhrchen ein, bevor Sie es 20 Minuten lang bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubieren.

Am Ende der Inkubation fügen Sie 100 Prozent eiskaltes Aceton bis zu einer Endkonzentration von 80 Prozent hinzu. Lagern Sie die Proben über Nacht bei minus 20 Grad Celsius. Lagern Sie sie bis zu zwei Wochen für den späteren Gebrauch.

Am nächsten Tag zentrifugieren Sie die Proben bei 13.500 U/min für 10 Minuten bei 4 Grad Celsius, um das Zellpellet auszufällen. Waschen Sie das Zellpellet zweimal, indem Sie 500 Mikroliter 80 Prozent eiskaltes Aceton hinzufügen, gefolgt von einer 10-minütigen Zentrifugation bei 13.500 U/min und 4 Grad Celsius.

Zu dem luftgetrockneten Zellpellet geben Sie 100 Mikroliter 8 molaren Harnstoff in 40 millimolare HEPES und beschallen Sie es in einem 4 Grad Celsius warmen Wasserbad für 30 Sekunden an und 30 Sekunden lang aus, um das Proteinpellet aufzulösen, bevor das Protein quantifiziert wird.

Fügen Sie anschließend 300 Mikroliter Ammoniumbicarbonat hinzu, um die Probe auf eine Endkonzentration von 2 molaren Harnstoff zu verdünnen. Um 50 Mikrogramm Protein zu verdauen, fügen Sie den Proben auf dem Eis Trypsin und Lysin-C in einem Enzym-Protein-Verhältnis von 1 zu 50 hinzu.

Mischen Sie die Proben durch sanftes Klopfen und inkubieren Sie sie über Nacht bei Raumtemperatur zum Aufschluss. Fahren Sie dann mit dem Peptidreinigungsprotokoll fort.